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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
结核病是结核分枝杆菌（Mycobacterium）引起
的慢性传染性疾病，已有研究表明结核杆菌被巨噬
细胞吞噬后，在巨噬细胞内转为持留状态，通过乙
醛酸循环途径获取能量［1］。现有药物会随着患者免
疫力下降或者停药，而重新致病。因此迫切需求研
制新型抗结核药物。异柠檬酸裂解酶（ICL）是结核
收稿日期 ： 2014-03-31
基金项目 ：吉林省科技发展计划项目（2008110）
作者简介 ：吴丛梅，女，教授，研究方向 ：生物工程学 ；E-mail ：wucmyue@sina.com
通讯作者 ：殷玉和，男，讲师，研究方向 ：生物工程学 ；E-mail ：yyhlxt72@sina.com
肽类化合物对 H37Ra 抑制的优化筛选
吴丛梅 李玲玲 关晓侠 刘新涛 陈吉 殷玉和
（长春工业大学化学与生命科学院，长春 130012）
摘 要 ： 通过抑菌试验，确定不同培养基条件下多肽化合物的抑菌效果，并测定其最小抑菌浓度（Minimum inhibitory
concentration，MIC）。加入 Vc，比较抑菌效果，进一步优化筛选 H37Ra 抑制剂。先根据 ELISA 试验结果进行噬菌体肽库筛选，然
后利用分子对接软件模拟多肽与 ICL 蛋白晶体（1F8I）的分子对接，将成功对接的多肽采用 Fmoc 固相合成法合成，并对其生物活
性进行检测。用制备型反相高效液相色谱仪对合成的多肽进行纯化并进行质谱检测。共筛选得到 4 条多肽且均有抑菌效果，并与
剂量相关。结果显示，浓度为 800-1 500 μg/mL 时，各组多肽均抑菌。浓度为 500 μg/mL 时，正常培养基中只有一种肽有抑菌作用，
而限制碳源培养基中均不能抑菌。2 号肽抑菌效果最好，正常培养基中 MIC 为 200 μg/mL，限制碳源中为 500 μg/mL。阳性对照组，
两种培养基抑菌效果一致，利福平 MIC 为 0.8 μg/mL，异烟肼 MIC 为 0.5 μg/mL。根据 MIC 结果，在正常培养基中加入 Vc，检测到
多肽、利福平和异烟肼的抑菌效果呈剂量依赖性升高。
关键词 ： 肽类化合物 MIC 噬菌体肽库 分子对接 Fmoc 固相合成
Optimization Screening of Peptides Inhibition to H37Ra
Wu Congmei Li Lingling Guan Xiaoxia Liu Xintao Chen Ji Yin Yuhe
（School of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012）
Abstract: By inhibition experiments to determine the inhibitory effect of peptide compounds under different culture conditions, and
measure theirs minimal inhibitory concentration（MIC）. Adding Vc to compare inhibitory effect and future optimize screening H37Ra inhibitors.
According to the results of ELISA test screen the phage peptide library, and then uses the Molecular docking software to simulate peptide
docking with ICL protein crystal（1F8I）. The successful docking peptide uses the solid-phase synthesis method of Fmoc for synthesis, and tests
its biological activity. By preparative reversed phase HPLC purifies the synthesized peptides and detects mass spectrometry. Four peptides were
screened, all of which have bacteriostatic effect, and correlated with the dose. The results showed that when the concentration between 800 and
1 500 μg/mL all group were bacteriostat. When the concentration is 500 μg/mL, only one peptide has bacteriostatic effect in the normal medium,
while all cannot inhibit in the limit carbon medium. The inhibitory effect of No.2 peptide is best, and its MIC is 200 μg/mL in normal culture,
while it is 500 μg/mL in carbon limitations. Positive control group, two media’s inhibitory effect were consistent, RIF’s and INH’s MIC were 0.8
μg/mL and 0.5 μg/mL, respectively. According to MIC results, the inhibitory effects of peptide, RIF and INH were improved when adding Vc to
the normal culture, and to be a dose-dependent increase.
Key words: Peptides MIC Phage peptide library Molecular docking Solid-phase synthesis method of Fmoc
杆菌在人体内处于持续感染状态时乙醛酸支路代谢
中的关键酶［2，3］，因此，本研究以 ICL 作为研发抗
结核药物的靶点。
已知的异柠檬酸裂解酶的抑制剂能有效抑制细
胞内细菌生长［4］，但其因自身结构限制，具有生物
毒性，所以并不具有药用及开发价值［5］。目前还尚
2014年第8期 197吴丛梅等 ：肽类化合物对 H37Ra 抑制的优化筛选
未发现可作为抗结核病治疗药物的异柠檬酸裂解酶
抑制剂。
本研究以结核杆菌 ICL 作为靶点筛选可以抑
制细菌生长的多肽。首先利用噬菌体肽库筛选技
术［6］和分子对接技术［7，8］，优化筛选异柠檬酸裂解
酶肽类抑制剂。通过测定多肽在不同培养基内的抑
菌作用，确定能有效抑制细菌生长的最小抑菌浓度
（Minimum inhibitory concentration，MIC）［9］。在培养
基中加入 Vc［10］，检测多肽的抑菌效果，旨在为以
异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 H37Ra 菌种由中国药品生物制品检定所
馈赠。
1.1.2 仪器 肽类化合物由长春工业大学 ICL 抑制
剂试验组合成。MB7H9，DMSO 均购自美国 Sigma
公司。利福平购自沈阳双鼎制药有限公司。异烟肼
购自天津药业集团新郑股份有限公司。质谱（API400）
购自上海晶能生物技术有限公司。GL3000 制备型
高效液相色谱仪购自成都格莱精密仪器有限公司。
Peptide Synthesizer PSI 200 购自美国多肽科技有限
公司。
1.2 方法
1.2.1 单克隆噬菌体 ELISA 检测 用 100 μg/mL 的
ICL 靶蛋白包被 96 孔酶标板，4℃过夜。次日去除
包被液，于 4℃封闭 1 h。用 TBS/Tween（体积分数
为 0.5%）洗板，每孔分别加入 10 μL 待鉴定的扩增
噬菌体和 40 μL TBS 的混合溶液，室温震荡作用 1
h。洗板后每孔加入 200 μL HRP 标记的抗 -M13 抗
体（封闭液中以体积比 =1∶5 000 稀释）［11］，室温
震荡作用 1 h。洗板后每孔加 200 μL TMB 底物溶液，
室温作用约 20 min，出现颜色变化后，用 2 mol/L 的
H2SO4 50 μL 终止反应，酶标仪记录 450 nm 处吸光
值［12］。
1.2.2 DNA 序列测定 将所提取的噬菌体单链 DNA
送上海生工生物工程技术服务公司进行测序。测序
所得的碱基序列，通过 Generunner 软件翻译成所对
应的氨基酸序列。
1.2.3 分 子 对 接 从 蛋 白 质 数 据 库（Protein data
bank，PDB）晶体结构数据中下载 ICL 蛋白晶体三
维结构数据（1F8I.Pdb，http ：//www.pdb.org）。采用
程序中的 LigandFit 预测 ICL 活性位点，自动依据配
体 / 受体复合物的能量得到最佳的配体和受体结合
结构。分子对接采用 Monte Carlo 极小化与模拟退火
方法，每次优化 1 000 步，并考虑溶剂化效应，采
用 cellmultiple 模型计算非键相互作用。配体和受体
间的能量匹配用半经验的自由能计算方法评价［12］。
1.2.4 肽的固相合成 采用 Fmoc 固相合成法，先
将 RinK 树脂在合成仪反应器中经 DMF 溶胀 30 min，
然后逐个偶联上氨基酸残基。粗品先经制备型反相
高效液相色谱仪纯化，再用质谱检测所合成的七肽。
1.2.5 H37Ra 菌 种 培 养 以 含 10% ADC 的 MB7H9
（内含终浓度为 0.2% 的甘油）为正常生长状态的培
养基，不含甘油的为限制碳源培养基。1×105 Pa 高
压灭菌 1 h，置 4℃冰箱保存。临用时，加入 10%
ADC 营养添加剂。37℃间或震荡培养 2-3 周。
1.2.6 菌液制备
1.2.6.1 比浊管的配制 根据菌液所需达到的浓度
要求，按照表 1 的两种试剂量添加混匀配置标准比
浊管。
表 1 比浊管的配制
0.25% BaCl2（mL） 1% H2SO4（mL） 湿菌浓度（mg/mL）
0.4 9.6 1.0
0.8 9.2 2.0
1.2 8.8 3.0
1.2.6.2 细菌悬液的制备 向 1.5 cm×3 cm 的小瓶
内放置 10 个 6 mm 的玻璃珠，加入含 0.5% Tween80
的生理盐水 0.5 mL，121℃高压灭菌 1 h。待冷却后，
分别将两种培养液中培养 2-3 周菌龄的 H37Ra 株小
心取出，各自用无菌 PBS 缓冲液洗涤 3 遍，去除原
培养基，分别接入小瓶中，涡旋混匀，直至菌液成
乳酪状，用 0.5% 生理盐水稀释，并与比浊管比浊配
置成 1 mg/mL 的菌液［9］，静置备用。
1.2.6.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定 取制备好
的 1 mg/mL 菌悬液 5 μL，含菌数量 2×103，分别接
种于每支含 500 μL 正常状态或限制碳源培养液的 24
孔板中，然后根据需要在孔中加入 1 mL 用 DMSO 配
制的不同浓度的七肽化合物，肽浓度梯度稀释为 ：
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期198
1 500、1 000、800、500 和 200 μg/mL。以利福平和
异烟肼为阳性对照，浓度梯度稀释为 1.5、1.0、0.8、
0.5 和 0.2 μg/mL。以 DMSO 和不添加任何化合物的
培养菌液作为阴性对照。同时分别添加 1 mmol/L 和
4 mmol/L 的 Vc（每孔添加 500 μL）做对照组，置
37℃恒温孵箱内培养，2-3 周观察结果。
2 结果
2.1 噬菌体阳性克隆酶联免疫吸附剂测定（ELI-
SA）和氨基酸测序结果
将噬菌体肽库筛选所得的噬菌体铺于含 IPTG/X-
gal 的 LB 平板上，于 37℃过夜培养后长出的噬菌斑
全部为蓝色重组斑，随机挑取其中的噬菌体克隆对
其进行酶联免疫吸附剂试验（ELISA）。样品的 OD450
值高于阴性对照一倍即认为该样品值为阳性值。筛
选出的 4 个阳性克隆的噬菌体 ELISA 检测结果均大
于 0.2（图 1），氨基酸测序结果见表 2。
2.4 肽类抑制剂对H37Ra株的抑制作用
试验结果（表 3）显示，在正常培养基中，所
有多肽均具有抑菌性，并与剂量相关。浓度为 800-
1 500 μg/mL 时，各组多肽（编号 1、2、3 和 4）均
抑菌。浓度为 500 μg/mL 时，只有 2 号肽有抑菌作用。
在限制碳源液体培养基中培养，多肽的抑菌性也与
剂量相关。浓度为 800-1 500 μg/mL 时，各组多肽（编
号 1、2、3、4）均抑菌。浓度为 500 μg/mL 时，均
不能抑菌。
利福平和异烟肼为现有治疗结核病药物，对
H37Ra 均有抑制作用，其 MIC 均小于 0.5 μg/mL，利
福平浓度为 0.5 μg/mL 时无抑菌效果（表 3）。抑菌
试验中，作阳性对照，与不同浓度肽类化合物比较，
观察长菌情况，并记录其最小抑菌浓度。
根据以上结果，选用正常生长状态培养基，并
根据 MIC 浓度，4 条多肽（编号 1、2、3、4）做进
一步检测。
2.5 Vc对H37Ra的抑制作用
在正常培养基中加入 Vc，检测其对结核分枝杆
菌的抑制作用。在培养基中加入 500 μL Vc，在培养
第 4 天和第 11 天观察结核分枝杆菌生长情况，同时
2.0
1.5
1.0
0.5
O
D
45
0n
m
0
1 2 3 4
Clones
Negative control
peptides
1 ：0.809 ；2 ：1.788 ；3 ：0.3295 ；4 ：0.419 ；n=5（阴性对照的孔用 BSA 包板）
图 1 噬菌体阳性克隆的 ELISA 检测结果
2.2 分子对接结果
根据表 2 中七肽的氨基酸序列，进行 DNA 测序。
利用分子对接软件中的 Build and Edit Protein 构建七
肽的三维结构，以七肽作为配体，将 ICL（1F8I）作
为受体进行分子对接，筛选出来的 4 条七肽（编号 1、
2、3、4）与 ICL 对接成功（图 2）。
2.3 肽的固相合成结果
根据氨基酸序列分析结果，确定合成以上 4 条
七肽。用制备型反相高效液相色谱仪对合成的多肽
进行纯化。纯化多肽由质谱（API400）确定其分子
量（图 3）。纯化结果（表 2）显示，与计算分子量
结果一致，说明成功合成了这 4 条肽链。
D:GLN119
C:ALA99
C:GLN119 A:GLN119
B:ALA96
B:ALA99
B:GLN119
A:LEU101
A:ALA99
A:GLN119 D:GLN119
A:GLN119
A B
C D
A ：1 号肽 ；B ：2 号肽 ；C ：3 号肽 ；D ：4 号肽
图 2 肽与 ICL 分子对接结果
表 2 Fmoc 法合成 4 条肽的分子量和纯度
序号 氨基酸序列 分子量（Da） 纯度（%）
1 LTLGPLL 725.9 96.7
2 LYALATM 782 98.8
3 QKASPGA 657.7 98.5
4 TELSLPS 745.8 96.4
2014年第8期 199吴丛梅等 ：肽类化合物对 H37Ra 抑制的优化筛选
设不加 Vc 组。结果（表 4）显示，第 4 天，正常培
养基中长菌，加入 Vc 后均有抑菌效果 ；第 11 天，1
mmol/L Vc 不抑菌，而 4 mmol/L Vc 仍可抑菌。与只
加多肽或 Vc 的培养基相比，加多肽、Vc 的培养基，
均可抑菌，抑菌效果随着给药剂量增加而增强，且
随时间增加而增强。
3 讨论
随着越来越多的多肽药物研发批准上市，多
肽的研究也越来越受到重视，已成药多肽有安塞
纳肽，重组人粒细胞集落刺激因子注射液等。目
前已知的异柠檬酸裂解酶的抑制剂有 3-溴丙酮酸
和 3-硝基丙酸盐，抑制剂常数（Ki）分别为 120 和
3 μmol/L［13， 14］。这几种化合物抑制剂可以有效地降
低异柠檬酸裂解酶的活性。但是这些化合物由于自
身结构等限制，具有很强的生物毒性，所以并不
具有药用及开发价值。赖煦卉等［5］检测到化合物
600
15.8
595.7
764.1
709.1
789.9 884.0
764.2
875.3
820.2 940.2
437.7
455.7 515.8
87.8 576.1
763
9
595.9
817.2 847.3
790.2
680.1
537.8
657.9
768.0
746.2
.0853.3
804.1725.3
747.8
819.0
800 800 1000 0 600 600 800
图 3 4 种纯化肽的质谱（API400）检测图
表 3 肽类化合物对 H37Ra 的抑菌结果
浓度
（μg/mL）
正常生长状态 H37Ra 限制碳源状态 H37Ra 浓度
（μg/mL）
正常生长状态 H37Ra 限制碳源状态 H37Ra
1 号 2 号 3 号 4 号 1 号 2 号 3 号 4 号 利福平 异烟肼 利福平 异烟肼
1500 － － － － － － － － 1.5 － － － －
1000 － － － － － － － － 1 － － － －
800 － － － － － － － － 0.8 － － － －
500 ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 0.5 ＋ － ＋ －
200 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 0.2 ＋ ＋ ＋ ＋
对照 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 对照 ＋ ＋ ＋ ＋
“-”表示无细菌生长 ；“＋”表示有细菌生长
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期200
FD20 的 IC50 值为 62.2 μg/mL，具有较好的成药物理
参数，并能在低浓度下有效抑制细胞内细菌生长，
是非常具有成药潜力的抗结核先导化合物，但仍具
有生物毒性，也不是理想的抗结核药物。目前还没
有发现可作为抗结核病治疗药物的异柠檬酸裂解酶
抑制剂。而多肽作为药物，与现有中药和化合物类
抑制剂相比，免疫原性低、生理活性强、疗效高，
副作用小、不会聚积体内而引起中毒，因此可解决
化合物类生物毒性问题。
Vc 是已知的一种抗氧化剂和促氧化剂，具有许
多生物学功能，包括参与氨基酸代谢、增加对感染
的抵抗能力、参加解毒功能、抗组胺及阻止致癌物
质生成等作用。Vilcheze 等［10］观察剂量反应关系表
明，Vc 在抑制结核分枝杆菌生长的最小抑菌浓度 1
mmol/L，有短暂的抑菌效果，然后恢复性增长。由
于 Vc 降解，每天分别添加 1 mmol/L Vc，连续添加
4 d 对结核分枝杆菌的治疗效果和直接添加 4 mmol/L
Vc 效果一样。Vc 对结核分枝杆菌培养基的杀菌效
果是由于其促氧化剂活性，亚铁离子浓度的增加导
致 ROS 的产生，脂质的改变，氧化还原失衡和 DNA
损伤，进而达到杀菌效果。
本研究的抑制剂为多肽类抑制剂，以正常和限
制碳源两种培养基做抑菌试验，多肽浓度梯度稀释
为 ：1 500、1 000、800、500 和 200 μg/mL。同时以
相同条件的 DMSO 为阴性对照，利福平和异烟肼为
阳性对照，利福平和异烟肼浓度稀释为 ：1.5、1.0、
0.8、0.5 和 0.2 μg/mL。检测到不同培养基条件的多
肽均有抑菌效果，并与剂量相关。浓度为 800-1 500
μg/mL 时，各组多肽均抑菌。浓度为 500 μg/mL 时，
正常培养基中只有 2 号肽有抑菌作用，而限制碳源
培养基中均不能抑菌。这说明限制碳源时因体内代
谢状态改变而导致肽类抑制剂耐药性增大。阳性对
照组，两种培养基抑菌效果一致，利福平 MIC 为 0.8
μg/mL，异烟肼 MIC 为 0.5 μg/mL。这与已有报道中
利福平为 0.5 μg/mL，异烟肼为 0.2 μg/mL 有所不同，
可能与培养基、培养条件的选择有关。
在两种培养基中加入 Vc，浓度为 1 mmol/L 和 4
mmol/L 检测到多肽、利福平和异烟肼的抑菌效果呈
剂量依赖性提高。给药 4 d，每天分别添加 1 mmol/L
Vc，与直接添加 4 mmol/L Vc 各组抑菌效果一样，这
与已有研究结果［10］一致。给药 11 d，4 mmol/L Vc
组仍具有抑菌效果，而 1 mmol/L Vc 组 H37Ra 恢复增
长，这应与 Vc 降解有关。可见 Vc 与多肽、利福平
和异烟肼一起给药对 H37Ra 抑制有协同效果，较单
独给药具有更好的抑菌作用，但 Vc 作为辅助药与多
肽化合物联合应用的效应及机制有待探讨，Vc 给药
浓度仍有待于研究。在此，选用正常培养基重复试验，
对筛选出的 4 条多肽 MIC 进一步测定，检测结果合
理，为以多肽类抑制剂做新型抗结核药物提供了理
论依据。进一步优化筛选 H37Ra 抑制剂，为抗结核
药物设计提供新的思路。在现有研究报告中，尚未
有 Vc 与多肽联合应用的相关报道，可望为结核病治
疗开辟新的途径。
多肽类抑制剂具有较好的成药物理参数，并且
能在低浓度下有效抑制细菌生长，具有成药潜力，
是理想的抗结核药物。此外，Vc 来源广泛，与多肽
一起联合给药抑菌克数比常规药物大 10 个数量级，
药物半衰期延长，这在抗结核药物研究领域尚未报
道，有利于下一步研究对其进行结果改造，具有广
阔的应用前景。
表 4 不同时间 1 mmol/L 和 4 mmol/L Vc 抑菌效果
4 d 11 d
不含 Vc 1 mmol/L Vc 4 mmol/L Vc 不含 Vc 1 mmol/L Vc 4 mmol/L Vc
不加肽 ＋＋＋ ＋＋ - ＋＋＋＋ ＋＋＋ -
1 号 ＋＋ ＋ - ＋＋＋ ＋＋ -
2 号 ＋＋ ＋ - ＋＋＋ ＋＋ -
3 号 ＋＋ ＋ - ＋＋＋ ＋＋ -
4 号 ＋＋ ＋ - ＋＋＋ ＋＋ -
利福平 - - - - - -
异烟肼 - - - - - -
“-”表示无细菌生长 ；“＋”表示有细菌生长 ；“+”数量表示细菌生长量 ；一个“+”含菌数量为 1×102
2014年第8期 201吴丛梅等 ：肽类化合物对 H37Ra 抑制的优化筛选
4 结论
ICL 是结核杆菌在人体内处于持续感染状态乙
醛酸支路代谢中的关键酶，本研究以 ICL 作为研发
抗结核药物的靶点。利用噬菌体肽库筛选技术和分
子对接技术，成功筛选出 4 种 ICL 肽类抑制剂，通
过抑菌试验测定均有抑菌活性，并与剂量相关。确
定不同培养基条件下多肽化合物的 MIC，进而在正
常培养基中加入 Vc，检测到多肽抑菌效果呈剂量依
赖性升高。
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（责任编辑 马鑫）