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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
杉木（Cunninghamia lanceolata）是我国南方主
要的丰产速生用材树种，在江西、湖南、四川等多
个省（区）均有种植［1］。炭疽菌是一种地理位置分
布广泛、寄主繁多的真菌，可侵害多种树木，尤其
对一些丰产速生林可以造成严重危害［2，3］。杉木炭
疽病是杉木种植区主要发生病害，几乎有杉木的地
方就有炭疽病发生，且以低山丘陵地区人工幼林更
严重，常大面积发生。病轻时会导致杉木幼苗的针
叶或嫩梢变褐枯萎，严重时常会造成杉木幼林成片
的枯黄、枯死，对其造成了毁灭性的损害［1-3］。该
收稿日期 ：2012-12-06
基金项目 ：林业公益性行业科研专项经费项目（201004014）
作者简介 ：路宗岩，女，硕士研究生，研究方向 ：森林微生物 ；E-mail ：675703558@qq.com.cn
通讯作者 ：周国英，女，博士，教授，研究方向 ：森林保护与应用微生物 ；E-mail ：gyzhou2118@163.com
杉木炭疽病拮抗菌 HY32 的筛选及其应用
路宗岩 周国英 陈玉华 闫法领 闫瑞坤 伍南
（中南林业科技大学林学院，长沙 410004）
摘 要 ： 采用组织分离法从杉木炭疽病叶中分离到一株病原菌，命名为 CSUFTCC F0101。经形态观察、致病性测定和分子
生物学鉴定确证为杉木胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。采集杉木健康枝条，通过平板对峙法初筛、发酵液法复筛，获
得 1 株具有较强拮抗活性的细菌，编号为 HY32，其抑菌带宽度达到 10 mm 以上，发酵液的抑菌活性为 81.7%。抗菌谱测定表明，
该拮抗细菌对油茶炭疽病菌、油茶软腐病菌、油茶根腐病菌和油茶叶枯病菌等 4 种病原真菌也具有较强的抗菌活性。对拮抗菌
HY32 的防病效果进行室内盆栽试验，结果表明，该拮抗菌对杉木炭疽病具有显著防治效果（≥ 60.0%），与对照组具有显著的差异。
关键词 ： 杉木炭疽病 病原菌 拮抗细菌 筛选
Screening and Application of the Antagonistic Bacterium HY32
Against Colletotrichum gloeosporioides
Lu Zongyan Zhou Guoying Chen Yuhua Yan Faling Yan Ruikun Wu Nan
（College of Forestry，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）
Abstract: We isolated pathogenic bacteria by means of tissue isolation. Through morphology, pathogenicity determination and
phylogenetic analysis, it showed that the cause of fir anthrax pathogen is Colletotrichum gloeosporioides. Acquisition of Sugiki Kenkosugimie,
through the flat confrontation method screening, fermentation liquid compound sieve, we got 1 strains with strong antagonistic activity of bacteria,
numbered HY32, bacteriostasis diameter achieving above of 10 mm, fermentation broth bacteriostasis activity up to 81.7%. Culture tests showed
it had strong antagonistic activity to 4 plant pathogens（Cunninghamia lanceolata, Agaricodochium camellia, Fusarium proliferatum, Pestalotio
psismicrospor）. Through indoor potted test of the HY32, the results showed that compared with the control group the HY32 has significant
control effect against Chinese fir anthracnose, reaching 60.0%.
Key words: Chinese fir anthracnose Pathogen Antagonistic bacteria Screening
病菌的抗药性很强，目前防治杉木炭疽病的化学杀
菌剂都很难防治该病［4，5］。因此需要寻找一种高效
安全的防病方法，来控制和预防该病在杉木上的扩
散。利用生防细菌或其代谢产物防治植物病害，使
寄主植物周围的有益和有害微生物达到平衡，从而
起到防病增产目的，已经成为国内外在生物防治研
究中的热点话题［6，7］。本课题组在湖南攸县杉木生
产基地分别采集感病和健康的杉枝，分离获得杉木
炭疽病病原菌，筛选出一株高效防治杉木炭疽病的
拮抗菌，旨在为杉木炭疽病的防治提供菌种资源，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期182
并为其有效的生物防治打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
病原菌取自攸县发病杉木枝条，典型病状的新
鲜杉木炭疽病枝。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离与鉴定
1.2.1.1 病原菌的分离与形态特征观察 从攸县采
集发病杉木枝条，取典型症状的新鲜杉木炭疽病枝，
用组织分离法进行病原菌的分离，采用常规法进行
纯化和保存。将保存菌种接种在 PDA 平板上，28℃
培养，观察菌落形态和颜色及其显微形态，照相记录。
参照真菌形态学鉴定手册［8］，初步判断分离所得菌
的种类。
1.2.1.2 病原菌的致病性测定 使用科赫法则对分
离菌株进行致病性测定［9］。
1.2.1.3 病原菌 rDNA-ITS 的扩增与序列分析 采
用常规 CTAB 法［10］用 DNA 提取试剂盒（北京天根
生化科技有限公司）提取病原菌基因组 DNA。将
DNA 产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行纯
化测序。并把测序结果与 GenBank 数据库中已知序
列进行 blast 同源性检测分析。利用 MEGA5 软件以
rDNA-ITS 相似序列构建系统发育树。
1.2.2 炭疽病拮抗细菌的分离与筛选
1.2.2.1 叶表细菌的分离与纯化 采集健康杉枝，
用无菌水过夜浸泡杉叶，用稀释法分离杉叶表面细
菌，28℃培养、48 h 后记录菌量，并根据菌落形态、
颜色和大小选取，并进行纯化，共分离 6 个批次细菌。
采用常规法进行纯化和保存。
1.2.2.2 拮抗细菌的筛选 初筛：采用平板对峙法［4］，
将培养 6 d 的病原菌菌丝块（d=6 mm）接种于 PDA
平板中央，采用十字交叉法在离菌块中心 30 mm 处
接种待测内生菌，每菌株接种 4 点，以接种灭菌培
养基为对照。每次试验设置 3 次重复。28℃恒温培
养 36 h 后，测量病原菌菌落直径和抑菌带宽度，计
算拮抗菌对病菌菌丝生长的抑菌率。
复筛 ：采用发酵法［11］进行复筛。将初筛选出
的拮抗菌株分别在 NA 培养基（牛肉膏蛋白胨固体
培养基）上培养 2 d 后，接种到 50 mL NB 培养液
（牛肉膏蛋白胨液体培养基）的三角瓶中（250 mL），
28℃、180 r/min 摇床振荡培养 48 h。发酵液用 0.22
μm 细菌过滤器过滤得到发酵滤液，将滤液与约
50℃ PDA 培养基按 1∶19 混匀倒入平板，冷却后在
平板中央放入 d=6 mm 的炭疽菌菌饼，4 d 后测量病
菌菌落直径，以无菌水为对照。每次试验设置 3 次
重复。
1.2.2.3 拮抗细菌抗菌谱的测定 采用平板对峙
法［4］，在离病原菌菌块中心 3 cm 处接待测拮抗细
菌，接种 4 点 ；以中央只接病原菌，周围不接生防
菌做对照 ；28℃培养 6 d。每处理 3 次重复。记录拮
抗菌对各供试病菌的抑菌效果。供试 4 种病原菌，
即油茶炭疽病、油茶软腐病菌、油茶根腐病和油茶
叶枯病菌（由经济林培育与保护教育部重点实验室
提供）。
1.2.2.4 室内盆栽试验 对杉木幼苗进行室内盆栽试
验。取拮抗菌发酵液（菌体浓度 >6.0×1010 CFU/mL），
用无菌水稀释成 100 倍、500 倍、1 000 倍 3 个梯度，
用喷洒的接种方法进行杉木炭疽病的防治试验。先
在保湿条件下接种供试病原菌，48 h 后在植株上喷
施拮抗菌的发酵液，25℃保湿条件下培养。设置 2
个对照，CK1 用无菌水，CK2 用 75% 多菌灵 500 倍
稀释液作为对照。每处理 3 株，重复 3 次。逐株记
录病情，并计算发病率和病情指数。杉木炭疽病病
情的分级标准参照曾大鹏等［12］的报道。
2 结果
2.1 炭疽病病原菌的鉴定结果
2.1.1 病原菌的分离与形态特征观察 从感病针叶
的病健交界处分离纯化到一株明显优势菌落，命名
为 CSUFTCC F0101。该菌于 28℃培养 6 d 后，菌落
呈圆形，直径达 70.00 mm 左右，正面为灰白色，背
面呈浅墨绿色并有同心轮纹 ；随菌龄增加颜色逐渐
加深 ；菌丝疏松绒毛状，气生菌丝发达，菌落表面
有桔红色的分生孢子堆（图 1）。在显微镜下观察其
孢子形态 ：分生孢子梗短，基部色较深，厚壁，有
分隔。孢子无色，单细胞，椭圆形，两端钝圆。初
步判定该菌是杉木炭疽病的病原菌。
2.1.2 病原菌致病性测定 接种 5 d 后，杉枝均开
始出现不规则的病斑，开始较小呈橙黄色，随后病
2013年第3期 183路宗岩等 ：杉木炭疽病拮抗菌 HY32 的筛选及其应用
斑自烫伤处向针叶四周扩展，颜色也变成暗褐色，
且针叶上有子实体和分生孢子堆产生。切断针叶后，
叶尖端先变黄枯死，然后向下方逐渐扩展到茎，最
后使整个嫩茎枯死（图 2）。其发病症状与自然条件
下相同。对照组未出现发病症状。由此推断，该病
菌是引起杉木炭疽病的致病菌。
A ：菌落正面 ；B ：菌落背面
A B
图 1 杉木炭疽病病原菌菌落特征
0.005
100
98
77
95
96
95
95
65
67
51
54
JN198430 C.crassipes
JX416095 C.capsici
JX416097 C.capsici
JN715844 C.boninense
JN715846 C.boninense
JN98427 C.boninense
JX010237 C.kahawae
JX010239 C.kahawae
JX258798 C.gloeosporioides
HQ264179 C.gloeosporioides
JX010271 C.siamense
JX010273 C.siamense
JX010209 C.aotearoa
JX010211 C.aotearoa
EU520064 C.ricini
JN198432 C.fragariae
JX010283 C.theobromicola
JX010291 C.theobromicola
CSUFTCC F0101
0.005
100
98
77
95
96
95
95
65
67
51
54
JN198430 C.crassipes
JX416095 C.capsici
JX416097 C.capsici
JN715844 C.boninense
JN715846 C.boninense
JN98427 C.boninense
JX010237 C.kahawae
JX010239 C.kahawae
JX258798 C.gloeosporioides
HQ264179 C.gloeosporioides
JX010271 C.siamense
JX010273 C.siamense
JX010209 C.aotearoa
JX010211 C.aotearoa
EU520064 C.ricini
JN198432 C.fragariae
JX010283 C.theobromicola
JX010291 C.theobromicola
CSUFTCC F0101
A ：无伤对照 ；B ：烫伤接种病原菌后的症状
图 2 接种 5 d 后杉木枝条的发病症状
2.1.3 病原菌 rDNA-ITS 的扩增和序列分析结果 用
rDNA-ITS 的通用引物对 ITS1/ITS4 对病原菌总 DNA
进行 PCR 扩增，将测得的 ITS 序列与 GenBank 上的
序列进行 blast 比对，结果表明，CSUFTCC F0101 菌
株的 rDNA-ITS 序列与菌株 Cg-210（GenBank 登录号
HQ264179）的相似性高达 100%。下载 GenBank 等
数据库中同源性的 ITS 序列，然后与本试验所测的
ITS 序列进行对位排列，利用 MEGA5 软件以 rDNA-
ITS 相似序列构建系统发育树（图 3）。从系统发育
树中可以看出，CSUFTCC F0101 菌株与菌株 Cg-210
（GenBank 登录号 HQ264179）和菌株 M-50（GenBank
登录号 JX258798）以 95% 的置信度聚在一支上，亲
缘关系最近。确证该病菌是杉木炭疽病的病原菌，
即胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。
2.2 拮抗细菌的筛选结果
2.2.1 拮抗细菌的初筛 试验结果表明，从湖南攸
县杉木叶表上共分离获得 45 株细菌。以杉木炭疽
病病原菌为指示菌，筛选出抑菌带宽度≥ 4 mm 的
菌 株 有 10 株， 依 次 为 HY2、HY6、HY10、HY13、
HY24、HY27、HY30、HY32、HY41 和 HY43（表 1）。
2.2.2 拮抗细菌的复筛 结果（表 2）表明，初筛
获得的抑菌带宽度≥4 mm 的 10 株菌经发酵法复筛，
其发酵液对供试病原菌的抑制率均 >60%，其中以
HY32 菌株的抑制率最高为 81.7%，能够明显抑制病
菌的生长。可以看出，在固体培养基与液体培养基中，
10 株拮抗菌产生的代谢物质的量是不一样的，二者
间没有对应关系。菌体本身的拮抗活性明显比拮抗
菌的无菌滤液高，因为拮抗菌 HY32 不论是菌体本
身还是菌株培养物的无菌滤液，都能有效抑制杉木
炭疽菌的生长，故将 HY32 作为杉木炭疽病的拮抗
菌株，进行下一步的试验。
2.2.3 拮抗菌 HY32 的形态特征 拮抗菌 HY32 菌
株在牛肉膏蛋白胨培养基上生长，菌落呈乳白色，
图 3 CSUFTCC F0101 的 rDNA-ITS 系统发育树
A B
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期184
菌丝生长抑制率为 58.2%-71.4%。其中，对油茶炭
疽病菌、油茶软腐病菌的抑菌效果较好，抑制率分
别为 71.4% 和 65.9%。可见，拮抗菌 HY32 对植物
病原真菌具有较广谱的拮抗活性，有很好的生物防
治应用前景。
表 1 拮抗细菌对杉木炭疽病菌的抑制作用
抑菌带宽度 L（mm） 菌株编号
L < 4
HY1、HY3、HY4、HY5、HY7、HY8、
HY9、HY11、HY12、HY14、HY15、
HY16、HY17、HY18、HY19、HY20、
HY21、HY22、HY23、HY25、HY26、
HY28、HY29、HY31、HY33、HY34、
HY35、HY36、HY37、HY38、HY39、
HY40、HY42、HY44、HY45
4 ≤ L < 7 HY2、HY6、HY24、HY27、HY30
7 ≤ L < 10 HY10、HY13、HY43
10 ≤ L HY32、HY41
圆形或近圆形，边缘较整齐，表面湿润，且有金属
光泽，菌落直径一般 2-3 mm，培养初期菌落中央有
褶皱产生，随着菌龄的增加，褶皱逐渐消失，最后
变成液体状。在显微镜下观察发现，菌体杆状，芽
孢端生，革兰氏染色阴性（图 4）。
表 2 拮抗细菌发酵液对杉木炭疽病菌的抑制作用
A ：显微镜下观察菌体 ；B ：肉眼观察菌落形态
图 4 HY32 的形态特征
2.2.5 室内盆栽试验结果 盆栽试验结果（表 4）
表明，通过初筛、复筛得到的潜在生防菌株 HY32，
实现了预期的生防效果，对杉木炭疽病有较好的防
治效果，使其病情指数明显降低。发酵液 100 倍稀
释液的防治效果比化学农药多菌灵好，500 倍稀释
液的治疗效果是 61.7%，100 倍稀释液的防治效果是
65.4%。与对照多菌灵比，拮抗菌 HY32 的发酵液对
杉木炭疽病的防治效果有明显优势。
表 3 拮抗菌 HY32 对不同植物病原菌的抑制作用
病原菌 对照菌落半径（mm） 处理菌落半径（mm） 抑菌率（%）
油茶软腐病 34 12 65.9
油茶炭疽病 37 11 71.4
油茶根腐病 35 15 58.2
油茶叶枯病 36 14 62.1
A B
表 4 HY32 发酵液对杉木炭疽病的盆栽防治效果
处理方式
治疗
发病率（%） 病情指数 防治效果（%）
100 倍稀释液 0.54 0.28 65.4
500 倍稀释液 0.68 0.31 61.7
1000 倍稀释液 1.31 0.36 55.6
CK1（清水） 2.23 0.81 —
CK2（500 倍多菌灵） 0.75 0.35 56.8
3 讨论
随着环境恶化和致病菌耐药性的增强，从自然
界中分离筛选植物病害生防菌，具有广阔的研究及
应用价值，应进一步的加强研究。拮抗菌活性一般
以抑菌带的宽度作评价指标，但抑菌带并不能很好
地反应拮抗菌的抑菌效果，因为拮抗菌的抑菌效果
和抑菌带宽窄不完全成正相关，所以本试验利用平
板对峙法和发酵液法筛选拮抗菌株，并在杉木幼苗
上进行测试。
笔者从杉木叶片表面分离到的生防菌 HY32 对
菌株 菌落直径（mm） 抑制率（%）
HY2 20.4 68.4
HY6 19.3 70.1
HY10 16.4 74.6
HY13 16.1 75.0
HY24 18.6 71.2
HY27 15.1 76.6
HY30 14.7 77.2
HY32 11.8 81.7
HY41 13.5 79.1
HY43 16.2 74.5
CK 64.5 —
2.2.4 抗菌谱试验结果 表 3 表明，拮抗菌 HY32
对供试的 4 种植物病原真菌，即油茶软腐病、油茶
炭疽病、油茶根腐病及油茶叶枯病均有抑制作用，
2013年第3期 185路宗岩等 ：杉木炭疽病拮抗菌 HY32 的筛选及其应用
杉木炭疽菌有较强的拮抗活性，初步鉴定该菌株为
芽孢杆菌。芽孢杆菌是植物微生态中的优势种群，
有较强的防病抗菌作用，分布广泛、易分离与培养，
且其芽孢对酸碱度、高温等外界因素的抗逆性较强，
所以在加工微生物菌剂和选择剂型上，产芽孢细菌
比非产芽孢细菌（如假单胞菌）有更多优势，更适
于生产加工和贮藏［14-16］。在试验过程中特别注意了
生防菌 HY32 发酵液的使用，发现新鲜发酵液具有
较稳定的防治效果 ；反之，将其放置一段时间后，
防治效果则不理想，这可能是发酵液的活菌数、菌
活力及其代谢物质会随时间发生变化，从而影响其
防治效果。该菌株发酵液原液的防病效果要比其他
浓度的好，因此其优化培养条件尚待研究。另外，
拮抗细菌用作控制病原菌的方式大致有拮抗作用、
竞争作用、寄生作用、诱导系统抗性等［17］，生防菌
HY32 的抑菌结果是造成病原菌菌丝扭曲、断裂、膨
大、抑制孢子萌发等，与卢丽俐等［11］对油茶炭疽病，
郝华坤等［19］对棉花黄、枯萎病的抑菌结果基本一致。
虽然该菌对杉木炭疽病具有一定的防治效果，但是
不太稳定，是否能应用于生产，还需要对该菌的作
用机制、定殖能力等作进一步的系统研究。
4 结论
本 试 验 从 杉 木 炭 疽 病 叶 分 离 到 了 CSUFTCC
F0101 菌株，通过科赫法则与分子鉴定，结果表明，
该菌株为杉木炭疽病的致病菌（胶孢炭疽菌）。以该
病菌作为指示菌，将从杉木叶片表面分离到的 45 株
细菌，经过平板对峙初筛，筛选到 10 株对杉木炭疽
菌有较强抑菌活性的菌株，在进一步的发酵液复筛，
筛选到一株对杉木炭疽菌具有明显拮抗效果的菌株
HY32，其发酵液对杉木炭疽菌的抑制率为 81.7%，
通过培养形状和形态观察，初步鉴定该菌株属于芽
孢杆菌。在室内盆栽试验中，HY32 菌株的防治效
果达到 60% 以上。另外，该菌具有一定的广谱抗性，
对油茶炭疽病菌、油茶软腐病菌、油茶根腐病菌、
油茶叶枯病菌均有较强抑制作用，尤其对油茶炭疽
病菌的作用显著，抑菌率达到 71.4%。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）