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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
亚硝化细菌能将氨氧化成亚硝酸，属于硝化细
菌科两个生理亚群之一［1］，在硝化作用第一步即由
氨盐氧化为亚硝酸盐的过程中起作用，同时也是其
第一个限速反应［2，3］。与人类的关系十分密切，被
广泛应用于食品、生物、医药工业废水净化、城市
污水处理、鱼类养殖和农作物土壤改良等方面［4，5］。
由于亚硝化菌生长速度慢，且易与硝化菌共生，不
易获得纯种，影响了其大规模的应用［6］。诱变育种
收稿日期 ：2013-06-09
基金项目 ：江苏省自然科学基金项目（BK2011201），徐州工程学院科技计划项目（XKY2012216）
作者简介 ：董玉玮，男，博士研究生，研究方向 ：环境微生物学 ；E-mail ：dongyuwei66@163.com
通讯作者 ：张雁秋，男，教授，研究方向 ：水污染控制工程 ；E-mail ：yanqiuzhang66@163.com
亚硝化细菌原生质体化学诱变育种研究
董玉玮1，2 张雁秋1 涂宝军1，2 孙玲1，2 曹文平1，2
（1. 中国矿业大学，徐州 221116 ；2. 徐州工程学院，徐州 221116）
摘 要 ： 以活性污泥中分离出的亚硝化细菌为研究对象，采用原生质体诱变技术，以化学诱变剂氯化锂、溴化乙锭诱变亚
硝化细菌原生质体，选育亚硝酸盐氮富集能力高的菌株，同时研究了诱变剂浓度与脱氮能力之间的关系。结果表明，亚硝化细菌
原生质体再生菌落的致死率随诱变剂浓度的增加而逐渐增大。采用 1 L 模拟污水培养基扩大培养后，经 2.5 mg/mL 氯化锂诱变的菌
株 LC002 脱氮率为 86.89% ；经 2 μg/mL 溴化乙锭诱变的菌株 EB003 脱氮率为 85.67%。两株诱变菌株亚硝态氮富集能力与未诱变
菌株相比有明显的提高。原生质体诱变技术是一种选育优良亚硝化细菌的有效方式。
关键词 ： 亚硝化细菌 原生质体 诱变 氯化锂 溴化乙锭
Chemical Mutagenesis Breeding of Protoplast of
Ammonia-oxidizing Bacteria
Dong Yuwei1，2 Zhang Yanqiu1 Tu Baojun1，2 Sun Ling1，2 Cao Wenping1，2
（1. China University of Mining and Technology，Xuzhou 221116 ；2. Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221116）
Abstract: Strain with strong capacity of ammoxidation screened by repeated enrichment and separation methods from activated sludge,
was collected from sewage treatment plant in China university of mining and technology. Lithium chloride and ethidium bromide mutagenesis
methods of ammonia-oxidizing bacteria protoplast were used to breed mutant strain with strong capacity of ammoxidation. The relationship
between concentrations of chemical mutagens and capacity of ammoxidation were researched. The results showed that regenerated colony number
of protoplast decreased with increased lithium chloride or ethidium bromide mutagenic concentration. After culvation of 1 L simulation sewage
medium, the mutagenic strain LC002, mutated by 2.5 mg/mL lithium chloride, still had better capacity of ammoxidation with 86.89% removal rate
of ammonia nitrogen. The mutagenic strain EB003, mutated by 2 μg/mL ethidium bromide, also had better capacity of ammoxidation with 85.67%
removal rate of ammonia nitrogen. Protoplast mutagenisis was an effective breeding method to breed excellent ammonia-oxidizing bacteria for
further application.
Key words: Ammonia-oxidizing bacteria Protoplast Mutagenesis Lithium chloride Ethidium bromide
是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变
异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株，
进而培育成新的品种或种质的育种方法。它是继选
择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技
术，包括细胞诱变育种和原生质体诱变育种［7］。其
中又以原生质体诱变育种最行之有效，该技术摆脱
了细胞壁的束缚，所获得的良种诱变率得以大大的
提高，具有稳定、快速、有效的优点［8］，诱变方式
2013年第12期 179董玉玮等 ：亚硝化细菌原生质体化学诱变育种研究
分为物理、化学、复合诱变等。其中化学诱变相对
于物理诱变，具有易操作、剂量易控制、对基因组
损伤小、突变率高、特异性较好且后代遗传性状稳
定等特点［9］。本研究以从活性污泥中分离到的亚硝
化细菌为研究对象，采用化学诱变剂诱变原生质体，
以期筛选出氨氧化能力高、繁殖速度快的亚硝化细
菌，为污水处理、鱼类养殖、农作物土壤改良等提
供有益菌种。
1 材料与方法
1.1 材料
菌种 ：亚硝化细菌从中国矿业大学环境与测
绘学院实验室活性污泥中富集分离获得，经鉴定为
Nitrosomonas sp.［10］。
1.2 方法
1.2.1 培养基 亚硝化细菌富集培养基［11］：0.4%
（NH4）2SO4 、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4、0.2%
NaCl、0.04% FeSO4，0.5% CaCO3 混 匀 溶 解。 调 节
pH 至 8.0-8.2。
亚 硝 化 细 菌 分 离 培 养 基［11］：Ⅰ 液 ：3.33%
（NH4）2SO4，1.4% MgSO4，0.3% FeSO4，100 mL
H2O。Ⅱ液：1.36% KH2PO4，100 mL H2O。I∶II=9∶1，
调 pH 8.0-8.2，2% 琼脂，0.8% CaCO3。
亚硝化细菌再生培养基 ：在亚硝化细菌分离培
养基中加入 0.46 mol/L 蔗糖，1.5% 聚乙烯吡咯烷酮，
0.02 mol/L MgCl2。
亚硝化细菌原生质体稀释液 ：5 mmol/L EDTA，
0.5 mol/L 磷酸缓冲液，0.46 mol/L 蔗糖，0.02 mol/L
MgCl2。
模拟污水培养基 ：亚硝化细菌富集培养基稀释
5 倍，NH3-N 浓度为 206 mg/L。
1.2.2 原生质体化学诱变和再生［10］ 亚硝化细菌
培养至第 6 天，弃上清液，菌液沉淀加入终浓度 80
μg/mL 氨苄青霉素钠，24℃作用 8 h，菌体用 PBS 缓
冲溶液（pH 值 7.0）洗涤离心（2-3 次），再用 PBS
缓冲液悬浮，加入终浓度为 1 μg/mL 的溶菌酶溶
液，40℃水浴处理 30 min，3 000 r/min 离心 10 min
得到原生质体。将制备好的原生质体采用原生质体
稀释液清洗 2-3 次，稀释后取 1 mL 涂于含有 0.01-
1 mg/mL 氯化锂或 0.1-10 μg/mL 溴化乙锭的亚硝化
细菌再生培养基上。将诱变后的菌种放入恒温培养
箱中，30℃培养 14 d，计算致死率。挑选生长速度快、
直径大的再生菌落接种于少量富集培养基中，30℃
110 r/min 摇床培养 7-14 d 后，选择格里斯试剂显色
深色的，弃上清，沉淀加入模拟污水 140 mL，24℃
110 r/min 摇床培养 14 d。
致死率（%）=（未诱变的再生菌落数 - 诱变后
的再生菌落数）/ 未诱变的再生菌落数 ×100%
1.2.3 诱变菌株液体扩大培养 挑取再生菌落生长
快速且直径较大的接种于 5 mL 模拟污水培养基的试
管中，30℃培养，格里斯试剂测试其颜色。颜色较
深时，进行第 1 次扩大培养 ：菌液沉淀加入含有 25
mL 模拟污水培养基的 100 mL 锥形瓶中，110 r/min
30℃摇床培养，格里斯试剂测试其颜色。颜色较深时，
进行第 2 次扩大培养 ：菌液沉淀加入含有 150 mL 模
拟污水培养基的 250 mL 锥形瓶中，110 r/min 30℃摇
床培养，测定亚硝酸盐氮含量。第 3 次扩大培养 ：
菌液沉淀，加入含有 250 mL 模拟污水培养基的 250
mL 锥形瓶中，110 r/min 30℃摇床培养 14-18 d，测
定亚硝酸盐氮含量。第 4 次扩大培养 ：菌液沉淀，
加入含有 500 mL 模拟污水培养基的 500 mL 锥形瓶
中，110 r/min 30℃摇床培养 14-18 d，测定亚硝酸
盐氮含量。第 5 次扩大培养 ：菌液沉淀，加入含有
1 000 mL 模拟污水培养基的 1 000 mL 锥形瓶中，110
r/min 30℃摇床培养 14-18 d，测定相关氮元素含量。
1.2.4 检测方法［12］ 亚硝酸盐氮的测定 ：α-萘胺分
光光度法 ；氨氮含量的测定 ：纳氏试剂分光光度法 ；
硝酸盐氮的测定 ：酚二磺酸分光光度法。亚硝化细
菌菌群数量测定 ：最大可能数法（MPN）。
2 结果
2.1 氯化锂、溴化乙锭诱变亚硝化细菌原生质体
条件
2.1.1 原生质体致死率与氯化锂、溴化乙锭浓度之
间的关系 氯化锂、溴化乙锭诱变浓度与亚硝化细
菌原生质体致死率的关系，见图 1。从图 1 可知，
随着氯化锂、溴化乙锭诱变浓度的增加，原生质体
再生菌落数目逐渐变少，致死率逐渐增大。当氯化
锂诱变浓度为 0.1 mg/mL 时，致死率为 18.2%，当氯
化锂诱变浓度为 2.5 mg/mL 时，致死率达到 73.1%，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期180
当 氯 化 锂 诱 变 浓 度 为 10 mg/mL 时， 致 死 率 达 到
98.7% ；当溴化乙锭诱变浓度为 0.1 μg/mL 时，致死
率为 19.1%，当溴化乙锭诱变浓度为 2 μg/mL 时，致
死率达到 70.1%，当溴化乙锭诱变浓度为 10 μg/mL
时，致死率达到 99.5%。
培养时间的增加，亚硝酸盐氮含量先增加后期逐渐
趋于平缓。经氯化锂诱变的菌株中，LC002 菌株亚
硝酸盐氮含量最高，达到 175.55 mg/L（图 3-a）；经
溴化乙锭诱变的菌株中，EB003 菌株亚硝酸盐氮
含量最高，达到 175.23 mg/L（图 3-b）。诱变菌株
LC001、LC004、EB004 和 EB005 由于亚硝酸盐氮富
集能力较差被舍去。
将亚硝酸盐氮富集能力较强的诱变菌株 LC002、
LC003、EB001、EB002、EB003 和未诱变菌株进行
第 3 次扩大培养，测定结果见图 4。由图 4 可以看出，
随着培养时间的增加，亚硝酸盐氮含量先增加后期
逐渐趋于平缓。经氯化锂诱变的菌株中，LC002 菌
株亚硝酸盐氮含量最高，达到 176.18 mg/L（图 4-a）；
经溴化乙锭诱变的菌株中，EB003 菌株亚硝酸盐
氮含量最高，达到 171.57 mg/L（图 4-b）。诱变菌
株 EB001、EB002 由于亚硝酸盐氮富集能力较差被
舍去。
将亚硝酸盐氮富集能力较强的诱变菌株 LC002、
LC003、EB003 和未诱变菌株进行第 4 次扩大培养，
测定结果见图 5。由图 5 可以看出，第 4 次扩大培
养后，LC002 和 EB003 菌株亚硝酸盐氮含量最高，
分别达到 178.89 mg/L 和 168.95 mg/L。LC003 菌株亚
硝酸盐氮富集能力较差被舍去。
100
90
80
70
60
50
40㠤↫
⦷ %
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5
浓度 μg/mL 6 7 8 9 10
≟ॆ䬲 mg/mL ⓤॆ҉䭝 μg/mL
图 1 氯化锂、溴化乙锭诱变浓度对原生质体致死率的影响
2.1.2 诱变后原生质体再生菌落形态 经不同浓度
氯化锂、溴化乙锭诱变后的原生质体，在再生培养
基上培养，部分再生菌落形态见图 2。培养 8 d 后，
经 0.1、0.3、0.5 和 0.8 mg/mL 氯化锂诱变的再生菌
落颜色雪白且较小，数目较多 ；培养 7 d 后，经 1
mg/mL 和 2.5 mg/mL 氯化锂诱变的再生菌落颜色雪
白且较大，数目较少（图 2-A）；培养 14 d 后，经 5
mg/mL和10 mg/mL 氯化锂诱变的再生菌落颜色较白，
且非常小，数目很少（图 2-B）。
培养 9 d 后，经 0.1 μg/mL 和 0.5 μg/mL 溴化乙
锭诱变的再生菌落颜色雪白且较小，数目较多 ；培
养 8 d 后，经 1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL 和 6 μg/mL
溴化乙锭诱变的再生菌落颜色雪白，且较大，数
目较少（图 2-C、D）；培养 18 d 后，经 8 μg/mL 和
10 μg/mL 溴化乙锭诱变的再生菌落颜色较白，且非
常小，数目很少。
2.2 菌株的扩大化培养
将未诱变菌株（命名为 LC000）和筛选获得的
氯化锂诱变浓度为 1、2.5、5 和 10 mg/mL 的亚硝化
细 菌 各 一 株， 分 别 命 名 为 LC001、LC002、LC003
和 LC004 ；筛选获得的溴化乙锭诱变浓度为 0.5、1、
2、4 和 6 μg/mL 的亚硝化细菌各一株，分别命名为
EB001、EB002、EB003、EB004 和 EB005， 第 2 次
扩大培养测定结果见图 3。由图 3 可以看出，随着
A B
C D
A：2.5 mg/mL 氯化锂诱变；B：5 mg/mL 氯化锂诱变；C：1 μg/mL 溴化乙锭诱变；
D ：2 μg/mL 溴化乙锭诱变
图 2 诱变后原生质体再生菌落形态
2013年第12期 181董玉玮等 ：亚硝化细菌原生质体化学诱变育种研究
2.3 诱变菌株LC002和EB003脱氮性能测定
对亚硝酸盐氮富集能力较强的 LC002 和 EB003
进行第 5 次扩大化培养，采用 MPN 法测定 LC002 和
EB003 菌株菌群数量，结果见表 1。
从 表 1 可 以 看 出，LC002 和 EB003 菌 株 菌 群
数 量 在 培 养 11 d 后 分 别 达 到 2.3×107 CFU/mL 和
0.2×107 CFU/mL。
诱变菌株亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮浓度
测定结果见图 6。从图 6 可知，第 5 次扩大化培养
后，诱变菌株 LC002 和 EB003 氨氮去除率分别达到
B 200
180
160
140
120
100
80
ӊ⺍
䞨ⴀ
≞⎃
ᓖ m
g/
L
60
40
10
0
0 1 2 3 4 5
培养时间 d
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
EB000
EB001
EB002
EB003
EB004
EB005
A 200
180
160
140
120
100
80
ӊ⺍
䞨ⴀ
≞⎃
ᓖ m
g/
L
60
40
10
0
0 1 2 3 4 5
培养时间 d 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
LC000
LC001
LC002
LC003
LC004
图 3 诱变菌株亚硝酸盐氮测定（150 mL 模拟污水培养基）
B 200
180
160
140
120
100
80
ӊ⺍
䞨ⴀ
≞⎃
ᓖ(m
g/
L)
60
40
10
0
0 1 2 3 4 5
培养时间(d)
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
EB000
EB001
EB002
EB003
200A
180
160
140
120
100
80
ӊ⺍
䞨ⴀ
≞⎃
ᓖ(m
g/
L)
60
40
10
0
0 1 2 3 4 5
培养时间(d)
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
LC000
LC001
LC002
图 4 诱变菌株亚硝酸盐氮测定（250 mL 模拟污水培养基）
200B
180
160
140
120
100
80
ӊ⺍
䞨ⴀ
≞⎃
ᓖ(m
g/
L)
60
40
10
0
0 1 2 3 4 5
培养时间(d)
6 7 8 9 10 11 12 13 14
EB000
EB001
200A
180
160
140
120
100
80
ӊ⺍
䞨ⴀ
≞⎃
ᓖ(m
g/
L)
60
40
10
0
0 1 2 3 4 5
培养时间(d)
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
LC000
LC001
LC002
图 5 诱变菌株亚硝酸盐氮测定（500 mL 模拟污水培养基）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期182
86.89% 和 85.67%，硝酸盐氮的含量一直较低，同时 菌种生长速度增快，菌种脱氮性能稳定。
表 1 LC002 和 EB003 菌株亚硝化细菌菌群数量
培养时间
（d）
LC002 菌株菌群数量
（CFU/mL）
EB003 菌株菌群数量
（CFU /mL）
培养时间
（d）
LC002 菌株菌群数量
（CFU /mL）
EB003 菌株菌群数量
（CFU /mL）
1 54 36 7 3.1×105 1.0×105
2 121 97 8 4.5×105 2.1×105
3 810 390 9 2.3×106 0.5×106
4 1.7×103 0.5×103 10 3.5×106 1.8×106
5 8.9×103 4.9×103 11 2.3×107 0.2×107
6 2.1×105 0.7×105
200A
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1 2 3 4 5
培养时间(d)
6 7 8 9 10 11 12
⎃ᓖ
(m
g/
L)
㝡≘
⦷(%
)
ӊ⺍䞨ⴀ≞⎃ᓖ(mg/L)ӊ⺍ⴀ≞⎃ᓖ(mg/L)㝡≞⦷(%)≘≞⎃ᓖ(mg/L)
200B
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1 2 3 4 5
培养时间(d)
6 7 8 9 10 11 12
⎃ᓖ
(m
g/
L)
㝡≘
⦷(%
)
ӊ⺍䞨ⴀ≞⎃ᓖ(mg/L)ӊ⺍ⴀ≞⎃ᓖ(mg/L)㝡≞⦷(%)≘≞⎃ᓖ(mg/L)
A ：LC000 菌株 ；B ：EB003 菌株
图 6 诱变菌株脱氮能力测定
诱变菌株 LC002 和 EB003 具有较好的脱氮能力，
生长速度较快，且经过不断扩大培养后，良好的遗
传性能得以较好的保留，说明其具有好的的稳定性，
可作为优良菌株供进一步研究。
3 讨论
3.1 氯化锂、溴化乙锭诱变亚硝化细菌原生质体
的特点
有报道称，致死率在 70%-75% 发生正向突变
概率高［13］，也有报道表明致死率在 90%-99% 诱变
效果好［14］。本试验结果表明致死率在 70%-75% 获
得的亚硝化细菌诱变株脱氮性能较好，主要由于亚
硝化细菌生长周期长，性状及生命力易受到外界环
境的影响，剥离细胞壁后的原生质体更为脆弱，高
致死率下菌种较难生长。因此在氯化锂和溴化乙锭
诱变中，正向突变可能较多地出现在偏低剂量中。
采用较低剂量诱变剂诱变的菌株脱氮性能有显著的
提高，可能是由于 ：（1）原生质体本身缺少细胞壁，
物理性状脆弱且化学性质不稳定，对外界刺激比较
敏感，较低剂量的诱变剂就能使其发生突变 ；（2）
诱变剂直接添加到再生培养基中，使原生质体整个
再生过程始终处于诱变状态，长期低剂量的诱变条
件有利于获得优良的菌株。采用化学诱变剂氯化锂、
溴化乙锭诱变亚硝化细菌原生质体，选育优良菌株，
另外一特点是诱变方法简便、安全，诱变效果较好，
易于控制。
3.2 氯化锂、溴化乙锭诱变方式的比较
氯化锂是一种无机化合物，做为转录阻滞剂参
与蛋白质的合成，通过顺式作用元件作用于 DNA，
使之形成基因增强子或者启动多拷贝基因，从而产
生诱变效应。一般认为氯化锂本身诱变作用较弱，
多与其它诱变方式结合应用。但是在诱变亚硝化细
菌原生质体的过程中，我们发现单独使用氯化锂的
2013年第12期 183董玉玮等 ：亚硝化细菌原生质体化学诱变育种研究
诱变效果，较氯化锂与紫外线复合诱变效果要好（结
果未列出），也优于溴化乙锭诱变结果，说明作为亚
硝化细菌原生质体的诱变剂，氯化锂是较好的选择
之一。
溴化乙锭作为 DNA 结构烷化剂，主要与 DNA
中的磷酸嘌呤、嘧啶作用，诱变谱较为广泛，相对
于氯化锂而言，溴化乙锭的诱变剂量更低，属于较
强诱变剂。本试验中诱变菌株 EB003 亚硝酸盐氮
富集能力、菌群数量、氨氮去除率均较诱变菌株
LC002 低，因此溴化乙锭并非亚硝化细菌最佳的化
学诱变剂。
3.3 展望
目前国内外虽已有反硝化细菌原生质体诱变育
种的报道［15］，但尚缺乏亚硝化细菌原生质体诱变育
种的研究。本实验室已开展了亚硝化细菌原生质体
制备工艺、紫外诱变育种的研究［10］。本试验采用两
种化学诱变剂诱变亚硝化细菌原生质体并成果获得
两株优良菌株，说明原生质体诱变是选育优良亚硝
化细菌切实可行的方法之一，为其它方式的亚硝化
细菌原生质体诱变提供了技术支撑。所获得的优良
菌株经 1 000 mL 模拟污水培养基培养，脱氮效果良
好，后续将继续研究其它诱变剂诱变亚硝化细菌原
生质体的特点，并采用连续化培养，大量繁殖优良
菌种，考察其动力学特征，以期及早用于工业化应用。
4 结论
在 250 mL、500 mL 和 1 L 模拟污水培养基培养
后，经 2.5 mg/mL 氯化锂诱变的 LC002 菌株仍具有
86.89% 的脱氮率，稳定性较好。在 250 mL、500 mL
和 1 L 模拟污水培养基培养后，经 2 μg/mL 溴化乙锭
诱变的 EB003 菌株仍具有 85.67% 的脱氮率，稳定
性较好。
参 考 文 献
［1］ Woses CR, Weisburg WG, Paster BJ. The phylogeny of purple
baeteria ：the alpha subdivision［J］. Systematic and Applied
Microbiology, 1984, 5（3）：327-336.
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by aggregated chemolithotrophic bacteria［J］. Applied and
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（责任编辑 马鑫）