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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
潮湿纤维单胞菌和绿色木霉混合接种对不同食用菌菌渣
相关酶活性的影响
谢小林1，2  顾振红2  陈美标1  姚青2  朱红惠1
（1. 广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室 省部共建华南应用微生物国家重点实验
室，广州 510070 ；2. 华南农业大学 园艺学院，广州 510642）
摘 要： 利用产酶试验和滤纸崩解试验确定纤维降解细菌（潮湿纤维单胞菌（Cellomonas uda））和真菌（绿色木霉（Trichoderma
viride））单一菌株酶活性和滤纸崩解能力，依据滤纸崩解度和羧甲基纤维素酶（CMCase）活性进行不同混合接种比例降解不同食
用菌菌渣，探讨不同菌渣发酵过程中细菌和真菌的最适配比比例和相关酶活性变化。试验结果表明，Cellulomonas uda 在产酶和崩
解培养基中 CMCase 活性均要高于 Trichoderma viride，混合菌群发酵极大地提高了酶活性 ；以桉木屑 - 秀珍菇菌渣、杂木屑 - 灵芝
菌渣和杂木屑 - 秀珍菇菌渣为唯一碳源发酵 4 d 后，其 CMCase 活性最大值分别为 2 809、3 606 和 971 U/mL，滤纸酶（FPase）活
性最大值分别为 486、454 和 151 U/mL。为后续大规模固体发酵提供依据，桉木屑 - 秀珍菇菌渣、杂木屑 - 灵芝菌渣和杂木屑 -
秀珍菇菌渣分别采用潮湿纤维单胞菌和绿色木霉配比为 1∶3、3∶1 和 1∶2 为宜。
关键词 ： 潮湿纤维单胞菌 绿色木霉 混合比例 纤维素酶 食用菌菌渣
Study on the Related Enzyme Activities in the Residues of Different
Mushroom Substrates Inoculated with Cellulomonas uda and
Trichoderma viride
Xie Xiaolin1，2 Gu Zhenhong2 Chen Meibiao1 Yao Qing2 Zhu Honghui1
（1. Guangdong Institute of Microbiology，Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong
Open Laboratory of Applied Microbiology，State Key Laboratory of Applied Microbiology，South China（The Ministry-Province Joint
Development），Guangzhou 510070 ；2. College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）
Abstract:  Enzyme production test and collapse of filter paper test were used to establish the cellulase activity and the collapse degree
of filter paper with single strain of cellulolytic bacterium（Cellulomonas uda）and fungus（Trichoderma viride）. Then mixing ratios of
cellulolytic bacterium and fungus were determined to degrade the residues of different mushroom substrates in the liquid fermentation on the
basis of the collapse degree of filter paper and carboxymethyl cellulase（CMCase）activity, to study on the optimal mixing ratio of cellulolytic
bacterium and fungus and change of related enzyme activities in the fermentation of residues of mushroom substrates. The results showed that the
CMCase activity of Cellulomonas uda was higher than those of Trichoderma viride in both the cellulase production medium and collapse of filter
paper medium. However, the mixed fermentation of Cellulomonas uda and Trichoderma viride greatly improved the cellulase enzyme activity.
After four days liquid fermentation, using eucalypt sawdust-pleurotus geesteranus, mixed sawdust-ganoderma and sawdust-pleurotus geesteranus
as only carbon source, the maximum CMCase activity was 2 809, 3 606 and 971 U/mL and the maximum filter paper（FPase）activity was
486, 454 and 151 U/mL, respectively. These results can provide basis for the large scale solid state fermentation, and the suitable mixing ratio
of Cellulomonas uda and Trichoderma viride for eucalypt sawdust-pleurotus geesteranus, mix sawdust-ganoderma and mixed sawdust-pleurotus
geesteranus was 1∶3, 3∶1 and 1∶2, respectively.
Key words:  Cellulomonas uda Trichoderma viride Mixing ratio Cellulase Residues of mushroom substrates
收稿日期 ： 2013-07-12
基金项目 ： 国家科技支撑计划项目（2012BAD14B16），广东省科技攻关项目（2008B021000047），广东省 -中科院产学研项目（2010B090300067），
广东省省部产学研结合项目（2011B090400613）
作者简介 ：谢小林，男，研究实习员，硕士研究生，研究方向 ：微生物发酵 ；E-mail ：xiexiaolin198606@sina.com
通讯作者 ：朱红惠，女，博士，研究员，研究方向 ：微生物生理 ；E-mail ：zhuhh@gdim.cn
2013年第12期 163谢小林等 ：潮湿纤维单胞菌和绿色木霉混合接种对不同食用菌菌渣相关酶活性的影响
随着食用菌产业的发展，我国每年产生的菌渣
至少有 400 万 t［1］，菌渣利用率仅为 33%，处理这
些菌渣的传统方法是丢弃或燃烧。一方面造成了资
源的极大浪费 ；另一方面由于霉菌和害虫的生长，
增加了空气中霉菌孢子和害虫的数量，造成空气污
染［2］。由于菌渣中含有粗纤维、粗脂肪、粗蛋白、
矿物质和无氮浸出物等有效成分［3］，其主要成分粗
纤维含量更高达 9.32%-31.56%，是一类可利用资源
和潜在的非竞争资源［4］。目前，食用菌菌渣的利用
方式主要是作为配料循环使用、生产肥料、生产饲
料、用作栽培基质等［5］。因此，合理将这些废弃资
源利用于农业生产，既可提高生态效益，又可增加
生物资源的多层次利用，实现废物循环利用和农业
的可持续发展。
在自然界中，有很多微生物能够产生纤维素酶
降解纤维素，包括真菌、细菌、放线菌，其中真菌
被认为是纤维素物质的主要降解者［6］。研究较多的
是霉菌，尤以绿色木霉、里氏木霉、瑞氏木霉和康
氏木霉为典型［7］，但是由于霉菌生长缓慢且很多种
类都具有致病性，其孢子也容易传播、感染，限制
了其使用和开发，而细菌具有生长快，致病性低的
特点。目前，研究者大多采用单一微生物对纤维素
进行酶解，这样既易引起酶解产物的累积而抑制整
个反应的进行，也导致抑制大分子难降解的木质纤
维素物质的快速降解。混合菌群发酵具有弥补菌种
之间的差异，产生多种不同功能的酶，作用于纤维
素的不同位点，提高纤维素酶活性和纤维素酶解的
效果［8］。但是混合菌群需要合适的环境条件才能使
其生产能力充分表达出来，因此，必须确定混合菌
体系中的一些生理条件，如折衷 pH、折衷通气量、
温度，混合菌体系接种物中菌—菌的百分比例和接
种顺序等［9］。
本试验通过潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）
和绿色木霉（Trichoderma viride）混合菌群进行食用
菌菌渣发酵，以期针对不同菌渣确定最优发酵组合
比例，为菌渣资源化利用及后续工业大生产的应用
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌渣及菌株来源 菌渣来源于广东粤微食用
菌技术有限公司，其基本理化性质见表 1。潮湿纤
维单胞菌（Cellulomonas uda GIM 1.188）与绿色木霉
（Trichoderma viride GIM 3.141）由广东省微生物研究
所菌种保藏中心提供。
表 1 不同食用菌菌渣的理化性质
处理 全氮（g/kg） 有机碳（g/kg） C/N
桉木屑 - 秀珍菇菌渣（E-P） 6.7 441.5 65.9
杂木屑 - 灵芝菌渣（M-G） 13.7 420.0 30.7
杂木屑 - 秀珍菇菌渣（M-P） 5.9 432.2 73.3
1.1.2 培养基 C. uda 种子培养基 NB 培养基，T.
viride 种子培养基采用 PDA 液体培养基。
产酶培养基（g/L）［10］：CMC-Na 10，（NH4）2SO4 4，
MgSO4·7H2O 0.5，蛋白胨 10，牛肉膏 5。
C. uda 滤纸崩解试验培养基（g/L）［11］：牛肉膏
15，蛋白胨 10，CaCO3 20。
T. viride 滤 纸 崩 解 试 验 培 养 基（g/L）［12］：蛋
白 胨 1， 酵 母 浸 膏 10，（NH4） 2SO4 4，K2HPO4 2，
MgSO4·7H2O 0.1。
液体发酵培养基（g/L）［13］：K2HPO4 2，（NH4） 2
SO4 2.5，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl2·2H2O 0.3，
FeSO4·7H2O 0.005，MnSO4·H2O 0.0016，ZnSO4·
7H2O 0.002，CoCl2·6H2O 0.0017，Tween-80 1 mL，
菌渣 20。以上培养基均在 1.0×105 Pa，121℃灭菌
20 min 后使用，pH 值自然。
1.2 方法
1.2.1 菌株产酶活性试验
1.2.1.1 细菌和真菌产酶试验 接种 1 mL 种子液于
100 mL 产 酶 培 养 基 中，30℃、180 r/min 条 件 下 振
荡培养 3 d，制备粗酶液。菌种分别为 C. uda 和 T.
viride，每个处理重复 4 次。
1.2.1.2 细菌和真菌滤纸崩解和产酶试验 接种 0.5
mL 种子液于 50 mL 滤纸崩解试验培养基中，加入两
条 1 cm×3 cm 灭菌滤纸条，30℃、120 r/min 振荡培
养，分别于 24、48、72 和 96 h 取样，观察滤纸条
崩解溃烂情况和制备粗酶液。试验设两因素，因素一：
接种不同菌，分别为接种 C. uda、T. viride 和不接种
对照 ；因素二 ：不同取样时间，每个处理重复 5 次。
根据滤纸条的降解情况来判断菌株降解纤维素能力
的强弱 ：（+）代表滤纸边缘膨胀 ；（++）代表滤纸
整齐膨胀并下弯 ；（+++）代表滤纸不定形 ；（++++）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期164
表 3 C. uda 和 T. viride 对滤纸的降解能力
处理
滤纸崩解度
第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天
C. uda + + + + + + + + + +
T. viride - + + + +
- ：无崩解，+ ：崩溃程度 ；+ 越多，滤纸降解程度越高
代表滤纸完全成糊状［14］。
1.2.1.3 细菌和真菌混合比例对不同菌渣产酶试
验 接种 10% 种子液于 100 mL 液体发酵培养基中，
30℃、150 r/min 振荡培养 4 d，菌液过滤，制备粗酶液。
试验设两因素，因素 1：添加不同的菌渣，分别为 E-P、
M-G 和 M-P ；因素 2 ：接种混合菌的比例，依据 C.
uda 和 T. viride 对滤纸第 3 天的崩解情况和酶活性，
进行配比，分别为 C. uda∶T. viride = 3∶1、2∶1、
1∶1、1∶2 和 1∶3（表 2），每个处理重复 3 次。
表 2 依据 CMCase 活性进行 C. uda 和 T. viride 的配比
处理 CMCase 酶活比例 C. uda（mL） T. viride（mL）
C. uda∶T. viride 3∶1 5.6 4.4
2∶1 4.6 5.4
1∶1 3 7
1∶2 1.8 8.2
1∶3 1.2 8.8
1.2.2 酶活性测定
1.2.2.1 粗酶液制备 试验菌株培养菌液在 4℃、
6 000 r/min 离心 10 min，上清液即为粗酶液。
1.2.2.2 羧甲基纤维素酶（CMCase）活性测定［15］
取 适 当 稀 释 的 粗 酶 液 0.5 mL， 加 入 含 0.5% CMC-
Na 的 Hac-NaAc 缓冲液（乙酸 - 乙酸钠缓冲液 ：0.2
mol/L，pH5.0）1.5 mL，50℃水浴准确作用 30 min，
加入 1.5 mL DNS 试剂，沸水浴 5 min，立即冷却，
520 nm 处测定其 OD 值，根据葡萄糖标准曲线计算
酶活力。
1.2.2.3 滤纸酶（FPase）活性测定［15］ 取适当稀释
的粗菌液 0.5 mL，加入 1.5 mL Hac-NaAc 缓冲液（乙
酸 - 乙酸钠缓冲液 ：0.2 mol/L，pH5.0），加入 50 mg
滤纸条（新星滤纸规格为 1 cm×6 cm，卷曲成筒形），
50℃水浴准确作用 60 min，加入 1.5 mL DNS 试剂，
沸水浴 5 min，立即冷却，520 nm 处测定其 OD 值，
根据葡萄糖标准曲线计算酶活力。
酶活力单位（U/mL）定义为 ：在测定条件下，
1 mL 酶液每分钟水解底物生成 1 μg 葡萄糖所需的
酶量。
酶活性 =（1000×G×N）/（V×t）
其中，G ：由样品的平均吸光值在标准曲线上
相对应的葡萄糖含量（mg）；N ：酶液的稀释倍数 ；
1000 ：mg 与 μg 之间的换算系数 ；V ：反应用酶量
（mL）；t ：反应时间（min）。
1.2.3 数据处理 试验数据经 SPSS v16.0 独立样本 t
检验和单因素方差分析。
2 结果
2.1 细菌和真菌产CMCase活性
细菌和真菌在发酵培养基中的产酶活性不同，
由图 1 可见，接种 C. uda 的 CMCase 活性为 33 U/mL，
比接种 T. viride 的酶活性高 57%，独立样本 t 检验表
明两者的差异未达到显著性水平。
45
36
27
18
9
0
C
M
C
as
e
ac
tiv
ity
U/m
L
T. viride C. uda
NS
NS ：差异不显著
图 1 C. uda 和 T. viride 产 CMCase 活性
2.2 细菌和真菌对滤纸崩解的影响
2.2.1 细菌和真菌 CMCase 活性的动态 滤纸崩解
试验中，不同取样时间细菌和真菌产 CMCase 活性
见图 2。 接种 C. uda 后 CMCase 活性逐渐升高，在
第 3 天达到峰值（124 U/mL），第 4 天 CMCase 活性
开始下降 ；接种 T. viride 后 CMCase 活性较为平稳，
且活性较低。由图 2 可知，在 4 个测定时间点，接
种 C. uda 的 CMCase 活性都要高于接种 T. viride。
180
150
120
90
C
M
C
as
e(
U
/m
L)
60
30
0
1 2 3
ᰦ䰤d
4
T. viride
C. uda
图 2 C. uda 和 T. viride 产 CMCase 活性的动态
2.2.2 细菌和真菌滤纸条崩解能力 细菌和真菌崩
解滤纸条情况见表 3，接种 C. uda 第 1 天即可见到
2013年第12期 165谢小林等 ：潮湿纤维单胞菌和绿色木霉混合接种对不同食用菌菌渣相关酶活性的影响
滤纸条明显的膨胀，随着处理时间的延长，滤纸条
崩解越来越明显，处理 4 d 后，滤纸条完全成糊状，
不能取出拍照。但接种 T. viride 对滤纸条的崩解却
没有明显的效果，只是在滤纸条表面出现真菌菌丝
体，滤纸条晾干后，呈碳化状，表明有机质已有部
分降解，滤纸条未崩解可能是由于真菌菌丝体形成
胶链状网络阻止了滤纸的断裂。
表 3 C. uda 和 T. viride 对滤纸的降解能力
处理
滤纸崩解度
第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天
C. uda + + + + + + + + + +
T. viride - + + + +
- ：无崩解，+ ：崩溃程度 ；+ 越多，滤纸降解程度越高
2.3 混合菌群配比对不同菌渣液体发酵的影响
2.3.1 混合菌群配比对不同菌渣液体发酵 CMCase
活性的影响 在液体发酵培养基中，双菌混合发酵
4 d 后 CMCase 活性见表 4。以 E-P 为唯一碳源的液
体发酵培养基中，随着 C. uda∶T. viride 比例减少，
CMCase 活性增加，当其比例为 1∶3 时，CMCase 活
性最高，为 2 809 U/mL。而以 M-G 为唯一碳源的液
体发酵培养基中与以 E-P 为唯一碳源的液体发酵培
养基中 CMCase 活性相反，在 C. uda∶T. viride 为 3∶1
时，CMCase 活性最高，达到了 3 606 U/mL。以 M-P
为唯一碳源的 CMCase 活性要低于其他两种碳源，
其 CMCase 活性在 1∶2 时最大，为 971 U/mL。
表 4 C. uda 和 T. viride 不同配比对不同菌渣产 CMCase
活性的影响
混合比例
CMCase 活性（U/mL）
E-P M-G M-P
3∶1 1842±279a 3606±746a 420±48b
2∶1 1844±198a 3118±196ab 335±141b
1∶1 2310±416a 2342±74abc 687±25ab
1∶2 2357±471a 1249±402c 971±141a
1∶3 2809±512a 2041±205bc 926±146a
同一列不同字母表示差异显著（P ≤ 0.05）
2.3.2 混合菌群配比对不同菌渣液体发酵 FPase 活
性的影响 双菌混合发酵 4 d 后对 FPase 活性见表
5。以 E-P 为唯一碳源的液体发酵培养基中，当 C.
uda∶T. viride 为 1∶1 时，FPase 活性最大，达到了
486 U/mL。以 M-G 为唯一碳源的液体发酵培养基中
FPase 活性与 CMCase 活性相似，都是随着 C. uda∶
T. viride 比例减少，FPase 活性下降，其在 3∶1 时
酶活性最大，为 454 U/mL。以 M-P 为唯一碳源的
FPase 活性要低于其他两种碳源，其 FPase 活性在
1∶2 时最大，与 CMCase 活性相同。
表 5 C. uda 和 T. viride 不同配比对不同菌渣产 FPase 活性
的影响
混合比例
CMCase 活性（U/mL）
E-P M-G M-P
3∶1 360±62a 454±22a 70±21c
2∶1 303±37a 449±2a 87±15bc
1∶1 486±122a 368±36ab 113±13abc
1∶2 334±32a 199±44c 151±17a
1∶3 318±60a 289±58bc 131±4ab
同一列不同字母表示差异显著（P ≤ 0.05）
3 讨论
菌渣粗纤维结构极其复杂，其分解是一个复杂
的酶学过程。不同微生物所分泌的纤维素酶种类各
异且有限，对纤维素的酶解能力也大不相同，单一
菌株产酶活性和对滤纸条纤维素的分解能力非常弱，
并且降解菌渣仅靠一种微生物较难实现，因此，如
何提高酶的产量将是未来研究的重点之一［16］。纤维
素降解真菌广泛存在于自然界中，其降解纤维物质
主要是通过分泌大量的胞外酶来进行的，而细菌通
常认为产胞内酶，酶活性较低。本研究结果表明，
单一菌株在产酶培养基和滤纸条崩解培养基中，酶
活性都比较低，并且 C. uda 的酶活性和滤纸崩解度
都要高于 T. viride，究其原因为细菌在产酶培养基和
滤纸崩解培养基中生长快，产酶时间早，有利于滤
纸条的快速崩解。在液体发酵培养基中，混合菌群
极大的提高了酶活性，细菌与真菌混合菌群发酵可
能通过产生胞外酶和胞内酶协同作用于菌渣，使得
酶活性快速提高，加速了菌渣降解，这与宋向阳等［17］
和 Gautam 等［18］的研究一致，他们指出里氏木霉与
黑曲霉混合发酵产纤维素酶活要高于单一菌株。此
外，杨力等［6］研究也发现混合发酵比单一菌株纤维
素降解率提高了 12.47%。
目前对酶活的测定和计算都还没有统一的方法，
所以单从酶活的对比比较不同菌酶活的高低还缺乏
一定的说服力。本试验从菌株对滤纸的降解出发，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期166
通过比较细菌和真菌对滤纸崩解的形态变化来定性
地分析不同菌分解纤维素能力的高低，以及定量分
析不同菌酶活力大小，从而进行菌株间的合理配比，
更具科学性。
微生物酶的合成一般都有一个较适 C/N 范围，
采用适宜的 C/N 是提高酶活力和酶产率的关键技术
之一［19］，Gutierrez-Correa 等［20］认为两菌种之间的
相容性和培养基的营养条件是决定混和菌发酵成功
与否的关键因素。本研究发现高 C/N 菌渣（E-P 和
M-P），细菌和真菌在较低的比例下就可以达到高的
CMCase 和 FPase 活 性， 而 低 C/N 菌 渣（M-G）， 则
需要高的细菌和真菌比例才能达到高的 CMCase 和
FPase 活性，这可能与细菌和真菌本身对营养需求不
同有关，通常真菌要求 C/N 比较高，而细菌要求 C/N
比较低。
由于食用菌菌渣富含各种营养物质和木质素、
纤维素，合理将这些废弃物资源化利用，即可减少
环境污染，又可实现资源循环利用。本研究中 C.
uda 和 T. viride 混合发酵食用菌菌渣，CMCase 和 FP-
ase 活性均显示出较高水平。混合菌群在菌渣资源化
利用中显示了良好的应用前景。后续研究应结合液
体发酵结果，对不同菌渣采用细菌和真菌的不同混
合比例进行固体发酵，实现菌渣资源化利用。
4 结论
在产酶培养基和滤纸崩解培养基中，C. uda 的
CMCase 活 性 要 高 于 T. viride。C. uda 和 T. viride 混
合比例为 1∶3、3∶1 和 1 ：2 时，E-P、M-G 和 M-P
的酶活性分别达到最高。
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（责任编辑 李楠）