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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科木薯
属，为灌木状多年生作物。木薯淀粉含量占干物质
重的 75%-85%，是热带、亚热带重要的粮食作物和
能源植物［1］。目前，随着国家“十一五”再生能源
发展战略的制定，以及新的国家可再生能源法将玉
收稿日期 : 2012-05-03
基金项目 : 国家“973”计划课题（2010CB126601）, 广西自然科学基金重点项目（2010GXNSFD013025）, 南宁市科技攻关项目（201109044B）
作者简介 : 许娟 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 亚热带植物资源利用 ; E-mail: xujuans621@126.com
通讯作者 : 罗兴录 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 木薯栽培、育种、种质资源利用 ; E-mail: luoxinglu@sina.com
木薯淀粉合成相关酶基因的克隆及表达分析
许娟1  罗兴录1  赵德征1，2
（1 广西大学农学院，南宁 530004 ；2 广西作物遗传改良与生物技术重点实验室，南宁 530007）
摘 要： 根据核苷酸同源性设计简并引物，克隆了一段大小为 665 bp 的木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因（sAGP）
片段，并根据已知序列设计特异引物，克隆分离得到 GBSS 基因和 SBE 基因的 cDNA 片段。半定量 RT-PCR 分析结果表明，在木
薯不同生长时期，3 种淀粉合成相关酶基因的时空表达规律不同，GBSS 基因表达有时期特异性和组织特异性，只在块根形成期和
块根成熟期表达，在组织部位茎中表达最多，并且在这 3 种基因中表达水平相对较低。而 sAGP 基因在这 3 种基因中表达水平最
高，在木薯块根成熟期竟达超量表达水平，并且在华南 124 和辐选 01 中有品种差异，差异明显，在辐选 01 中的表达要优于华南
124 的表达。SBE 基因表达较平稳，在各个时期表达水平都处于中间水平，在 4 个时期中，块根成熟期时的表达水平相对较高，块
根形成期和苗期其次，收获期最低，也具有品种间差异，在辐选 01 中的表达要优于华南 124 的表达。
关键词 ： 木薯 淀粉合成相关酶基因 克隆 半定量 RT-PCR 基因表达
Cloning and Expression of Starch Synthesis Related Enzyme Gene in
Common Cassava
Xu Juan1 Luo Xinglu1 Zhao Dezheng1，2
（1College of Agriculture，Guangxi University，Nanning 530004 ；2Guangxi Crop Genetic Improvement and
Biotechnology Lab，Nanning 530007）
Abstract:  In this research，the 665 bp gene fragment were received from cassava adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase
small subunit gene，named sAGP. According to the known sequence that design specific primers，we got GBSS and cDNA fragment of SBE
gene through cloning separation. Semi-quantitative RT-PCR assay was used to detect the expression of genes in cassava，which showed the
results that in different growth periods，three kinds of starch synthesis gene expression pattern has a different rules in time and space. GBSS
gene expression has specific period and tissue，only expressed in the mature and formatting root. What’s more，Most of the expression is the
organization’s stem，and it has a relatively low level in these three genes. However，the expression of sAGP gene is the highest levels in these
three genes that has an over-expression level in maturiture roots. The expression in FX01 stems is superior to SC124. SBE has a relatively stable
gene expression. All the expression is in an intermediate level in each period. Descending order of gene expression is maturity，formation，
seedling and harvest in the four periods. What’s more，the expression in FX01 stems is much stronger than that in SC124.
Key words:  Cassava Starch synthesis related enzyme gene Clone Semi-quantitative RT-PCR Gene expression
米、木薯和甘蔗列入未来生产燃料酒精的主要原料
的颁布，提高木薯单产和鲜薯淀粉含量以及改良加
工型木薯淀粉品质将是研究的重点和热点，而对木
薯淀粉合成酶相关基因的研究也变得尤为重要。
淀粉是高等植物碳水化合物的主要储存形式，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期102
淀粉的合成是一个复杂的过程。目前，普遍认为 ADP-
葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，
AGP）、淀粉合酶（starch synthase，SS）、淀粉分歧酶
（Starch branching enzyme，SBE）是淀粉合成的 3 个
关键酶［2］。AGP（EC2.7.7.27）催化由葡萄糖 -1- 磷
酸（G-1-P）和腺苷三磷酸（ATP）合成腺苷二磷酸
葡萄糖（ADPG），并释放焦磷酸（PPi）。这一反应
在植物淀粉合成中是主要的调节步骤，是植物光合
和非光合组织中淀粉合成的起始步骤。AGPase 催化
产生 ADP-葡萄糖进行淀粉合成时，该酶表达水平的
高低在决定淀粉积累方面起着至关重要的作用［3］。
在植物中该酶是由两个大亚基（bAGP）和两个小亚
基（sAGP）组成的异源四聚体。AGPase B 和 S 首次
被克隆，在玉米［4］、拟南芥［5］和马铃薯［6］中都发现
了 AGPase S 亚基。据报道，木薯中克隆了 3 个 AGP-
ase 亚基 ：AGPaseB、AGPase S2 和 AGPase S3［7］。但
GenBank 未见序列公布。
淀粉合酶（SS）根据在提取液中与淀粉粒的结
合程度，分为颗粒结合型淀粉合成酶（Granule Bound
Starch Synthase，GBSS）和可溶性淀粉合成酶（Soluble
Starch Synthase，SSS），但这种划分并不是绝对的。
GBSS 是 合 成 直 链 淀 粉 的 关 键 酶， 多 数 时 候 是 指
GBSS Ⅰ。GBSS Ⅰ基因最先在水稻中被克隆，继而
在多种植物中克隆。康国章等［8］克隆了 GBSS Ⅱ基
因并对其功能作了鉴定。根据基因核苷酸序列同源
性显示 ：木薯的 GBSS 基因与马铃薯 GBSS 基因同源
性达 74%，而与其他植物的 GBSS 同源性达 60% 以上。
分支（歧）酶（SBE）基因与作物籽粒中支链淀粉
的合成密切相关。SBE 在淀粉合成过程中的作用主
要是通过形成 α-1，6 糖苷键，从而形成分支的糖链。
Salehuzzaman［9］从木薯块根中克隆得到一个基因的
cDNA 序列，该 cDNA 序列与其他植物中得到的 SBE
核苷酸序列有 70%-75% 同源性，这个酶在不同的
木薯基因型中有不同的表达，并且该酶在木薯块根
的品质和质量方面有着很重要的影响。
分离克隆淀粉合成相关基因的工作是阐明淀粉
合成机理以及利用基因工程技术改良木薯淀粉品质
的基础，具有重要的理论和实践意义。目前对木薯
淀粉合成相关酶基因的表达未见报道。为此，本研
究先克隆分离得到木薯淀粉合成相关酶基因片段 ：
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因（文中命
名 sAGP），GBSS 基因，SBE 基因，利用半定量 RT-
PCR 技术分析各基因在木薯不同淀粉含量的品种，
不同时期和不同组织部位的表达规律，为进一步利
用基因工程技术改良木薯品质奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 试验以 2 个木薯品种华南 124（S-
C124）和辐选 01（Fuxuan01，简称 FX01）为材料，
辐选 01 是由华南 124 经过辐射筛选出的高淀粉含量
品种。木薯于 2010 年 3 月 22 号种植于广西大学教
学科研基地的木薯试验地。试验地经一犁一耙，试
验采用随机区组排列，按照区组设计 SC124 和 FX01
都设有 3 个重复，小区种植规格为 70×90 cm，每个
小区种植木薯 6 行，7 排，即每个小区木薯总株数为
42 株。田间管理与常规一致。分别于生长 60、120、
180 和 210 d 后采取木薯叶片、茎段、块根进行后续
试验，每个品种的重复小区都采集，最后将样品全
部混合，经液氮速冻后存于 -80℃冰箱保存备用。
1.1.2 主要试剂和仪器 大肠杆菌（Escherichia coli）
JM109 菌株和 DL2000 DNA Marker 购于北京全式金
生物技术有限公司 ；pMD18-T 载体、M-MLV 逆转录
酶 均 购 自 TaKaRa 公 司 ；dNTP、Taq DNA 聚 合 酶、
Qiagen DNA-freeTM 试剂盒和氨苄青霉素（Amp）购
自上海生工生物工程技术服务有限公司 ；凝胶回收
试剂盒购自 Bioer 公司，NaCl、异硫氰酸胍、Tris-
HCl、EDTA 等试剂均为市售进口或国产分析纯。PCR
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
试验使用的仪器有 PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像
系统、低温高速离心机、台式离心机、超净工作台等。
1.2 方法
1.2.1 sAGP 基因片段的克隆 以生长 120 d 以上的
SC124 叶片作材料，采用 CTAB 法提取 SC124 叶片
的 DNA，根据已发表的植物 sAGP 基因的核苷酸序
列及文献上找到的木薯 sAGP 氨基酸序列设计一对
简并引物，Sense primers ：5-CACAATTCAACTCTGC-
（G/C）TCT-3 ；Antisense primers ：5-AATGCGTCCT-
TCTTCGTCAA-3， 引 物 由 Primer5 和 Oligo6.0 两 个
引物设计软件综合评价而成。用于扩增木薯华南
2012年第11期 103许娟等 ：木薯淀粉合成相关酶基因的克隆及表达分析
124sAGP 基因片段，推测目的片段长度为 660 bp。
PCR 扩 增 反 应 总 体 系 为 25 μL，DNA 模 板 为
1 μL，dNTP 为（10 mmol/L）0.5 μL， 上 下 游 引 物
（10 mmol/L）各 0.5 μL，Taq 酶 0.2 μL，缓冲液 2.5 μL，
加双蒸水 19.8 μL。扩增程序为 ：94℃预变性 4 min ；
94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，36
个循环；72℃延伸 8 min。取 PCR 产物 5 μL，用 1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测。
将 PCR 扩增得到的预期片段经胶回收，并与
pMD18-T 载体连接，转化大肠杆菌 JM109 菌株感受
态细胞，从转化后的平板上随机挑取 8 个阳性克隆，
将这些克隆体摇菌培养，一定时间（8 h）后进行菌
液 PCR 检测，测序比对。
1.2.2 sAGP、GBSS 和 SBE 基 因 和 内 参 基 因 Actin
（ACT）的克隆 取华南 124（SC124）和辐选 01（FX
01）生长中期叶片采用异硫氰酸胍—过柱法提取
RNA（参照潘华清等［10］的方法有所改动），参照
M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit（上海生工）操作
步骤合成 cDNA。sAGP 基因核苷酸序列，根据同源
性设计简并引物，GBSS 和 SBE 可根据 NCBI 数据库
提供的木薯 GBSS 基因、SBE 基因 cDNA 序列，根
据其较保守的区域设计特异性引物。内参基因 ACT
片段扩增参照许娟等［11］发表的基因序列片段，设
计引物序列。引物由 Primer Primer5.0 软件设计。然
后在 NCBI 上进行 BLAST 以保证引物的专一性。
引物序列（S 表示正义链，A 表示反义链）如下：
sAGPS：5-GTGGCTACAAGAATGAAGGT-3；sAGPA：
5-TCATCGACGAGATGGTTACC-3。GBSSS：5-TCCA-
CTACGATGCCACAACT-3；GBSSA：5-CCACAGGGC-
TCAAATCTACTT-3。SBES ：5-AGTCACGCAAGTA-
ACAATA-3 ；SBEA ：5-CAGAAGGAAGCGAATAA-
C-3。ACTS ：5-CTTCGTCTGGACCTTGCTG-3 ；
ACTA ：5-CAATGAGGGATGGCTGGAA-3。
sAGP 基因、SBE 基因、GBSS 基因和 ACT 基因
用上述得到的 cDNA 作为模板。PCR 反应体系 ：（模
板）DNA 或 cDNA 2 μL，缓冲液 10×Taq Buffer 2.5
μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上下引物（10 μmol/L）
各 1 μL，Taq（5 U/μL）0.3 μL，加双蒸水补足 25 μL
体系。
sAGP 基 因 扩 增 程 序 为 ：94 ℃ 预 变 性 3 min ；
94℃变性 40 s，56℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，33
个循环 ；72℃延伸 8 min。
ACT 基因扩增程序为 ：94℃预变性 3min ；94℃
变性 40 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，30 个循
环 ；72℃延伸 8 min。
GBSS 基因与 SBE 基因扩增程序为 ：94℃预变
性 3 min ；94℃变性 40 s，57℃退火 40 s，72℃延伸
50 s，36 个循环 ；72℃延伸 8 min。
将获得的基因片段经 T4 连接酶与 pMD18-T 连
接后，转化大肠杆菌 JM109（上海生工），经菌落
PCR 和质粒酶切鉴定为阳性的单克隆进行测序。将
上述阳性克隆送至上海生物工程技术有限公司进行
测 序。 测 序 结 果 在 NCBI 数 据 库（http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/blast/）上进行同源性比较分析。
1.2.3 sAGP 基因、GBSS 基因和 SBE 基因的表达分
析 以两个木薯品种华南 124（SC124）和辐选 01
（FX01）为材料，分别于生长 60、120、180 和 210 d
后采取木薯叶片、茎段、块根进行试验，提取 DNA
及 RNA，RNA 逆转录合成 cDNA，按 1.2.1 方法并
对 sAGP、GBSS 和 SBE 基因进行扩增。通过半定量
PCR 法，对此基因在 SC124 和 FX01 不同部位及不
同生长期的表达进行分析。
1.2.4 淀粉含量的测定 参照上海植物生理学会主
编《植物生理学实验手册》中蒽酮比色法。从块根
形成期开始采样，主要测定块根中淀粉的含量，连
续测定 3 个时期即 120、180 和 240 d 以及收获时候
（300 d）的淀粉含量
2 结果
2.1 sAGP基因的克隆及序列分析
用 DNA 作模板，进行 PCR 扩增。扩增产物用
1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图 3）显示，在
500 bp 与 750 bp 之间有一条亮带，并且与预期片
段大小一致，大约 600 bp，回收目的片段连接到
pMD18-T 克隆载体上，转化 E. coli JM109 感受态细胞，
培养 8 h 进行菌液 PCR 检测，菌液扩增片段大小约
600 bp（图 1）。
将重组质粒进行测序，获得一段大小为 665 bp
的基因片段，由于是用 DNA 作模板，获得的序列经
GenBank Blast 在线软件分析，含有大于 300 bp 的内
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期104
含子，核苷酸碱基序列如图 2 所示。
将该片段的核苷酸序列与基因库中已注册的
其他植物 sAGP 基因的核苷酸序列经 Blast 同源性
分析比较，结果（表 1）显示，该木薯基因片段的
核苷酸序列与基因库中登录的大戟科的蓖麻（登录
号 ：XM002524537）的 sAGP 基因 mRNA 序列同源
性达 89%，与其他淀粉类作物，如红薯（登录号 ：
AY544765）、鹰嘴豆（登录号 ：AF356005）、马铃薯
（登录号 ：X61186）、水稻（登录号 ：FJ235712）、玉
米（登录号 ：AF334960）的 mRNA 序列同源性分别
达到 89%、86%、85%、83% 和 82% ；与木本科的图 1 RT-PCR 产物及阳性克隆的 PCR 鉴定凝胶电泳图
M. DNA Marker ；1. sAGP 基因 PCR 产物 ；2. sAGP 基因
PCR 产物回收带 ；3. sAGP 基因阳性克隆
2000
bp
1000
750
500
250
100
M 1 2 3
图 2 木薯 sAGP 基因片段的核苷酸序列
方框处表示正、反引物序列 ；下划线表示内含子
CACAATTCAACTCTGCGTCTCTTAATCGTCACCTTTCACGGGCATATGCA
AGCAACATGGGTGGCTACAAGAATGAAGGTTTTGTTGAAGTTCTTGCAGC
CCAGCAGAGCCCAGAGAATCCAAATTGGTTCCAGGTACTGATTGATAAAT
TCTTTTACGGTGCATGCAGAGAGGGGAGTTTGAAATTGAAGTATCCACTC
AGTTTTTAGTCCATATTATGCAATTTTATTTGAGGCTTGTGAAGGAGAAT
GAGAAAAACATGGTGAAATCAAATATGAAATATTGCAGTTGACCATAATT
TTGCTTGGGATTAAGATAATAAAGATGCATACCTAACCAAATGCAATCTT
ATGCATTTGAAATCAGTAACTTTATCTTGTGGTCTTTTTTCTTACTTTTT
GTTGTCACTATTTTCCCTCATGATTTTTTTAAATGATTTACAGGGCACAG
CTGATGCTGTCAGACAGTACTTGTGGTTGTTTGAAGAGCACAATGTTCTG
GAATTCTTGATTCTTGCTGGGGATCATTTATACCGCATGGATTATGAAAG
GTTTATTCAAGCACACAGAGAAACTGATGCAGATATAACAGTAGCTGCTC
TACCAATGGATGAAAAACGTGCAACAGCCTTTGGTCTGATGAAAATTGAC
GAAGAAGGACGCATT
1
51
101
151
201
251
301
351
401
451
501
551
601
651
其他植物如蜜桔（登录号 ：AF184597）、梧桐（登
录 号 ：AM293613）、 陆 地 棉（ 登 录 号 ：EU268018）
的 mRNA 序列同源性分别达到 87%、86% 和 84% ；
与模式植物拟南芥（登陆号：AY096379）和烟草（登
录 号 ：DQ399915） 的 同 源 性 分 别 为 82% 和 87%。
根据同源性分析结果，该序列与其他植物的 AGPase
小亚基基因核苷酸序列的同源性均在 80% 以上，推
测本研究获得的基因片段为木薯 AGPase 小亚基基
因片段，本研究将该基因命名为 sAGP。
2.2 ACT、sAGP、GBSS和SBE基因的克隆
经 PCR 扩增后得到大小约与预期相符的 ACT、
sAGP、GBSS 和 SBE 基因 cDNA 片段（图 5）。其中
ACT 基因的 cDNA 片段约 270 bp，sAGP 的 cDNA 片
段约 250 bp，GBSS 基因的 cDNA 片段约 500 bp，SBE
的 cDNA 片段约 200 bp ；与预期的 ACT 基因 cDNA
片段 276 bp，sAGP 基因 cDNA 片段 254 bp，GBSS 基
因 cDNA 片 段 475 bp，SBE 基 因 cDNA 片 段 216 bp
相符合。
回收目的基因片段，分别与 pMD18-T Vector 载
体连接并转化感受态细胞 E. coli JM109。用阳性克
隆的菌液及其质粒为模板进行 PCR 鉴定，结果如图
3 所示。
2012年第11期 105许娟等 ：木薯淀粉合成相关酶基因的克隆及表达分析
2.4 SC124和FX01sAGP、GBSS和SBE基因的RT-
PCR半定量分析表达检测
以内参基因 ACT 作为对照，对木薯淀粉相关合
成酶基因（sAGP、GBSS 和 SBE）进行表达研究分析。
分别提取华南 124 和辐选 01 四个时期，不同组织
部位叶片、茎、块根共 22 个 cDNA 进行半定量 RT-
PCR 分析。在不同时期，3 种淀粉合成相关基因在
华南 124 和辐选 01 中的表达分析见图 5。
用相关半定量软件 Quantity one 图像分析系统分
析（图 5）中各条带的灰度得出灰度值，再用 Excel
软件求出目的基因条带灰度与内参基因 ACT 灰度之
间的比值（图 6）。
由 半 定 量 RT-PCR 结 果（ 图 5 和 图 6） 显 示，
在木薯不同生长时期，3 种淀粉合成相关酶基因的
时空表达规律不同，GBSS 基因表达有时期特异性
和组织特异性，只在块根形成期和块根成熟期表达，
在组织部位茎中表达最多，并且在这 3 种基因中表
达水平相对较低。而 sAGP 基因在这 3 种基因中表
达水平最高，在木薯块根成熟期竟达超量表达水平，
并且在 SC124 和 FX01 中有品种差异，且差异明显，
在 FX01 中的表达要优于 SC124 的表达。SBE 基因
表达较平稳，在各个时期表达水平都处于中间水平，
在四个时期中，块根成熟期时的表达水平相对较高，
块根形成期和苗期其次，收获期最低，也具有品种
间差异，在 FX01 中的表达要优于 SC124 的表达。
2.5 SC124和FX01总淀粉含量比较
木薯是收获块根为主的经济作物，块根的主要
表 1 木薯 sAGP 基因与其他 sAGP 基因的同源性相似结果
基因名称 登录号 同源性（%）
Ricinus communi glucose-1-phosphate adenylyltransferases XM002524537 89
AY544765 89
Cicer arietinum ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit CagpS2 AF356005 86
S. tuberosum ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit X61186 85
Oryza sativa ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit FJ235712 83
Zea mays ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit AF334960 82
Citrus unshiu ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit AF184597 87
Platanus acerifolia ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit AM293613 86
Gossypium hirsutum ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit EU268018 84
Arabidopsis thaliana ADPG pyrophosphorylase small subunit AY096379 82
Nicotiana tabacum ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit DQ399915 87
M. DNA Marker ；1. PCR 目的带 ；2. 菌液 PCR 目的带
图 3 菌落 PCR 和质粒 PCR 的 GBSS、sAGP、ACT 和
SBE 基因的中间片段
2000
bp
1000
750
250
500
100
M 1 2 M 1 2 M 1 2 M 1 2
GBSS sAGP ACT SBE
2.3 木薯ACT基因在各个时期不同组织部位的RT-
PCR半定量分析表达
为了研究木薯淀粉合成相关基因表达量的多与
少，必须先找出一个表达相对恒定的基因作为标准
来衡量，内参基因就具有该特征 ：在植物各个器官
和组织部位中表达基本恒定。由于木薯中还未见报
道 Actin 的克隆及表达情况，因而本试验需要先验证
ACT 基因的恒定表达。分别提取华南 124 和辐选 01
四个生长时期的叶片、茎、块根的总 RNA 进行半定
量 RT-PCR 分析。
由半定量 RT-PCR 结果（图 4）显示，ACT 基
因在木薯不同品种，不同时期不同组织部位的表达
量基本一致，可以将 ACT 基因看成是木薯内参基因
的一种，能够作为本试验内标基因来检测其他不同
来源的特定基因（目标基因）表达水平的变化规律。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期106
a ：60 d，b ：120 d，c ：180 d，d ：240 d ；1-3. SC124 叶片、茎、块根 ；4-6. FX01 叶片、茎、块根 ；M. DNA Marker
图 4 SC124 和 FX01 的 ACT 基因在不同生长天数不同组织部位的表达特征
1M 2 4 5 1M 2 3 4 5 6
1M 2 3 4 5 61M 2 3 4 5 6
2000
bp
1000
750
250
100
500
2000
bp
1000
750
250
100
500
A B
C D
ACT
1 2 4 5 1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
sAGP
SBE
GBSS
ACT
sAGP
SBE
GBSS
a b
c d
a ：60 d，b ：120 d，c ：180 d，d ：240 d ；1-3. SC124 叶片、茎、块根 ；4-6. FX01 叶片、茎、块根
图 5 SC124 和 FX01 的 sAGP、SBE、GBSS 基因在不同生长天数不同组织部位的表达特征
2012年第11期 107许娟等 ：木薯淀粉合成相关酶基因的克隆及表达分析
成分是淀粉，淀粉主要贮藏在块根中。本试验主要
测定淀粉的块根含量来探究淀粉合成相关酶基因表
达与淀粉含量的关系。从图 7 可以看出，木薯品种
SC124 和 FX01 块根淀粉含量的变化均随着生育期的
推移而不断增加，其中高淀粉木薯品种 FX01 各个
时期的淀粉含量都高于低淀粉品种 SC124。
将每 60 d 左右淀粉增加的百分率作为淀粉积累
速率，SC124 和 FX01 品种在测定期内块根积累速率，
如图 8 所示。由图 8 可知，SC124 和 FX01 块根淀粉
积累速率在测定期内的变化趋势基本一致，在木薯
生长 180 d（块根膨大期）时淀粉增加率最高，增加
速率的数值达到 90 以上，随着木薯生长时间的推移，
块根淀粉积累速率呈降低趋势，从 240 d（块根成熟
期）开始到收获时期，块根淀粉积累速率降到最低，
说明木薯成熟后期木薯块根淀粉合成能力明显下降。
从总体趋势来看，高淀粉木薯品种在各个时期淀粉
增加率都比低淀粉高，表明高淀粉木薯品种其淀粉
合成能力比低淀粉木薯品种合成能力强。
图 6 SC124 和 FX01 的 sAGP（A）、GBSS（B）和 SBE（C）
基因在不同生长天数不同组织部位的相对表达量分析
A
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
60 120 180 240ཙᮠd
SC124ਦ⡷
SC124㤾
SC124ඇṩ
FX01ਦ⡷
FX01㤾
FX01ඇṩ
⴨ሩ
㺘䗮
䟿
B
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
60 120 180 240ཙᮠd
⴨ሩ
㺘䗮
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图 7 木薯不同时期块根淀粉含量变化
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图 8 木薯不同时期块根淀粉积累速率变化
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SC124 FX01
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3 讨论
半定量 RT-PCR 是近年来常用的一种具有较高
灵敏度、简捷、快速、特异的基因表达定量 RNA 检
测方法。其最主要的一个特点是选择一个参照标准
即内参基因，用于消除试验误差，各样本间用于比
较的值不是绝对值，而是相对值。本方法只能测定
mRNA 的相对含量，但用于各样品之间特异 mRNA
的表达差异时足以提供依据，因此常用于基因表达
的定量研究。
本 研 究 通 过 分 离 克 隆 淀 粉 合 成 相 关 酶 基 因
sAGP、GBSS 和 SBE，提取各个时期不同组织部位
样 品 RNA， 并 利 用 DNA 消 化 酶 去 除 mRNA 中 的
DNA，防止 DNA 污染模板的准确性，确保 RT-PCR
扩增得到的目的基因表达量是由该基因的 cDNA 量
决定。只有保证模板的准确性才能探讨分析各个基
因在不同木薯品种和不同时期及不同组织部位的时
空表达特征，并综合品种的产量及总淀粉含量分析
淀粉生物合成的机理。
AGPase 基因的表达模式在不同品种间存在相
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期108
当大的差异，即使在同一品种不同组织器官，其大
小亚基表达也具有特异性。本试验仅研究了 AGPase
小亚基基因（sAGP）在木薯 SC124 和 FX01 品种不
同时期，不同组织部位的表达特征。sAGP 在木薯块
根膨大期（180 d 后）达到超量表达，表达水平在四
个时期中最高，这个时期淀粉的积累速率达较高值，
数值达 90% 以上。与 Anderson 等［12］在水稻籽粒胚
乳中有关 AGPase 基因的表达水平相一致，AGPase
基因 mRNA 转录物在花后 15 d 达到最高水平，这时
候的淀粉积累速率也最高，转录水平与淀粉积累相
一致。另外，sAGP 基因在 FX01 的不同时期中表达
量水平均高于 SC124，只有少数时期的特定部位低
于在 SC124 中的表达量，如块根形成期的块根。同
一品种不同组织部位表达也有差异，sAGP 在不同组
织器官的表达量块根 > 叶片 > 茎，各个组织都有表达。
与姚新灵［13］在 AGPase 及其基因表达研究中提到的
大豆 AGPase 小亚基有组织表达专一性，仅在叶和子
叶内表达不一致 ；与小麦 AGPase 小亚基的表达规律
相符合［14］。在木薯生长前两个时期 sAGP 在叶片和
茎中的表达均多于块根中，原因可能与 AGPase 基
因是淀粉合成的起始酶相关，并且也能解释在苗期
相对于 GBSS 和 SBE 基因的高表达量水平。AGPase
基因在淀粉生物合成中主要参与直链淀粉的形成。
GBSS 基因的表达调控具有组织和发育时期的专
一性，本试验的研究也证实了这一结论。GBSS 基因
在木薯 SC124 和 FX01 两个品种中时间表达规律一
致，只在块根形成期（120 d 后）和块根膨大期（180
d 后）表达，组织部位表达规律不一样，在 SC124
的叶片中表达水平相对较高，而在 FX01 茎中表达
较多。GBSS 基因主要参与决定直链淀粉的合成，已
经有大量的研究证实了这一点。时岩玲等［15］在颗
粒结合型淀粉合成酶的研究进展中提到小麦 3 种
Waxy 基因同时缺失时，胚乳中直链淀粉含量几乎
为零，淀粉结构完全由支链淀粉构成，变成全糯小
麦。闫素辉等［16］在两种小麦直链淀粉的研究中表
明，同时具有 3 个 Waxy 蛋白亚基（GBSS）的不同
品种，品种间籽粒直链淀粉含量差异却很大，其一
个关键原因是 Waxy 蛋白亚基（GBSS）表达量的差
异。GBSS 基因只在木薯块根形成期（120 d 后）和
块根膨大期（180 d 后）表达，表明这两个时期主要
是木薯直链淀粉的形成。
在作物的不同组织和不同发育时期，SBE 基因
表达具有特异性。Morell 等［17］研究发现小麦中 SBE
I 的两种不同表型基因在胚乳发育后期表达，而 SBE
II 基因则在早期表达较高，随后下降并呈现稳定表
达水平。本试验的研究也表明了 SBE 基因表达在不
同品种不同生长时期和不同组织部位具有特异性，
SBE 基因表达较平稳，在各个时期表达水平都处于
中间水平，在四个时期中，块根膨大期（180 d）时
的表达水平相对较高，块根形成期和苗期其次，块
根成熟期相对较低。在不同品种间表达也有差异，
总体来看在 FX01 中的表达要优于 SC124 的表达。
这表明高淀粉木薯品种中淀粉合成关键酶基因的表
达量较高。
4 结论
本研究克隆了木薯 3 种淀粉合成关键酶基因片
段，并用半定量 RT-PCR 技术分析了 3 种淀粉合成
相关酶基因在不同品种、不同生长时期、不同组织
部位的时空表达规律 ：GBSS 基因表达有时期特异性
和组织特异性，只在块根形成期和块根成熟期表达，
在组织部位茎中表达最多，并且在这 3 种基因中表
达水平相对较低。sAGP 基因在这 3 种基因中表达水
平最高，在木薯块根成熟期竟达超量表达水平，在
FX01 中的表达要优于 SC124 的表达。SBE 基因表达
较平稳，在各个时期表达水平都处于中间水平，在
四个时期中，块根成熟期时的表达水平相对较高，
块根形成期和苗期其次，收获期最低，在 FX01 中
的表达要优于 SC124 的表达。淀粉含量高的品种
FX01 比低淀粉含量品种 SC124 的淀粉合成相关酶基
因表达水平高，并且在淀粉积累速率较大时，3 种
淀粉合成相关酶基因的表达水平较高。
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（责任编辑 马鑫）