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Protective Effects on Dermal Fibroblasts Under the UVA Oxidative Stress by Lycopene

番茄红素对UVA氧化损伤皮肤成纤维细胞的保护作用



全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
紫 外 线 UV(ultraviolet) 可 分 为 长 波 黑 斑 效
应 紫 外 线 UVA(320-400 nm)、 中 波 红 斑 效 应 紫
外 线 UVB(275-320 nm)、 短 波 灭 菌 效 应 紫 外 线
UVC(200-275 nm) 和 真 空 紫 外 线 UVD(100-200
nm)[1]。大量研究表明,在紫外线(UV)辐射下,
皮肤会产生急性光毒性反应,导致弥散性灰黑色色
收稿日期 :2013-04-22
基金项目 :国家基础科学人才培养基金项目(J0630858),全国大学生创新实验计划
作者简介 :杨娜,女,研究方向 :药理学及药物代谢动力学 ;E-mail :shillingyang@163.com
通讯作者 :张剑,男,博士,副教授,硕士生导师,研究方向 :中药生物技术 ;E-mail :wilson1978@163.com
番茄红素对 UVA 氧化损伤皮肤成纤维
细胞的保护作用
杨娜1  李明2  胡家栋1  姜涛2  巩思嘉1  张剑3
(1. 中国药科大学药学院,南京 211198 ;2. 中国药科大学中药学院,南京 211198 ;3. 中国药科大学中药复方研究室,南京 211198)
摘 要 : 以小鼠皮肤成纤维细胞为材料,给予 5 J/cm2 强度 UVA 照射建立模型,通过 MTT 法检测细胞增殖活力,同时检
测细胞内超氧化物歧化酶 SOD(Superoxide dismutase)、过氧化氢酶 CAT(catalase)、谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-PX(glutathione
peroxidase)和丙二醛 MDA(malondialdehyde)的活力,观察细胞内氧自由基含量和清除能力,探索番茄红素对 UVA 氧化损伤皮肤
成纤维细胞保护作用。结果表明,番茄红素保护组较模型组细胞死亡率降低,SOD、CAT、GSH-PX 活力上升,脂质过氧化物 MDA
含量下降,自由基清除能力有明显改善,说明番茄红素可改善成纤维细胞中自由基清除酶活力,提高成纤维细胞对紫外损伤的抗
氧化能力。
关键词 : 番茄红素 成纤维细胞 UVA 抗氧化
Protective Effects on Dermal Fibroblasts Under the UVA Oxidative
Stress by Lycopene
Yang Na1 Li Ming2 Hu Jiadong1 Jiang Tao2 Gong Sijia1 Zhang Jian3
(1. School of Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198 ;2. School of Traditional Chinese Medicine,China
Pharmaceutical University,Nanjing 211198 ;3. Department of Complex Prescription of TCM,China Pharmaceutical
University,Nanjing 211198)
Abstract:  The aim of this study is to test the protective effects of lycopene on the dermal fibroblasts under UNV oxidative stress. The
model used in this experiment was established by exposing the mouse dermal fibroblasts to UVA(5 J/cm2)in X min and the cell proliferative
activity was detected by MTT method. The activities of superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase(GSH-PX)
and malondialdehyde(MDA)were also tested to illustrate the protective effect of lycopene. Results showed that the mortality of dermal
fibroblasts was improved by subjecting the lycopene to the culture while the cells exposure in the UVA and the activity of SOD, CAT and GSH-
PX increased significantly while the the level of lipid hydroperoxide, MDA decreased. In general, lycopene can protect the dermal fibroblasts
against the UVA radiation by improving the activity of enzymes which involved in the clearace of oxygen radicals.
Key words:  Lycopene Fibroblast UVA Antioxidant
素沉着和炎症因子的产生,而且细胞内氧自由基
(ROS)产生超过其清除速度,过多的 ROS 可直接
攻击细胞膜脂质和蛋白质 DNA,导致了表皮和真皮
细胞的广泛氧化损伤并抑制细胞增殖,最终引起皮
肤炎症反应、免疫抑制、皮肤癌变及皮肤光老化等。
其中以长波黑斑效应 UVA 为主的紫外线有很强的穿
2013年第11期 143杨娜等 :番茄红素对 UVA 氧化损伤皮肤成纤维细胞的保护作用
透力,能够直达皮肤真皮层破坏弹性纤维和胶原蛋
白纤维,造成表皮和真皮层的广泛损伤,对真皮层
的成纤维细胞损伤作用尤为明显,是皮肤真皮衰老
的主要原因。
番茄红素(lycopene)又称 ψ-胡萝卜素,属于
异戊二烯类化合物,是一种类胡萝卜素的脂溶性红
色色素,广泛存在于番茄、西瓜、葡萄柚等水果和
蔬菜中。近年来研究发现番茄红素具有抗氧化、增
强免疫力、预防和治疗心血管疾病、抗癌等活性[2]。
已知机体内存在清除氧自由基的体系,当细胞受到
UV 辐射后,细胞内部会产生大量氧自由基致使自由
基清除速度小于生成速度,造成氧自由基堆积产生
细胞毒性。番茄红素可通过多个方面降低氧化损伤,
其可通过物理或化学的方式(如吸收光能和电子激
发能)淬灭单线态氧和过氧自由基[3,4],将其转变
为基态氧。其对于胃肠道心血管方面的抗氧化性多
有研究,但缺少对于皮肤抗氧化机制方面的研究。
本试验基于番茄红素较强的抗氧化能力,首创性地
将其对 UVA 紫外氧化损伤成纤维细胞进行细胞水平
的研究。由于典型防氧酶系中 SOD、CAT 和 GSH-PX
是机体抵抗外源性氧化损伤的主要途径,因此试验
通过对防氧酶系中 SOD、CAT、GSH-PX 活力的检测
结合脂质过氧化物 MDA 含量变化,旨在验证番茄红
素在 UVA 辐射后对成纤维细胞的抗氧化保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验原料 樱桃番茄 :购自南京市江宁天印
山农贸市场。
1.1.2 主要仪器和试剂 酶标仪 :Sunrise 奥地利
TECAN 公司 ;UV-2550 分光光度计 :日本岛津公司 ;
旋转蒸发仪、超声清洗机、超净台:苏净集团安泰公
司 ;UVA-340 光老化灯管 :南京华强电子有限公司 ;
冷冻离心机(Z-323K):德国 HermLe 公司 ; Milli-Q
超纯水仪 :美国 Millipore 公司 ;细胞培养箱 :德国
Heraeus 公司 ;超低温冰箱 :美国 Thermo 公司。
DMEM 培 养 基(GIBCO), 胎 牛 血 清 :FBS 杭
州四季青公司 ;BCA 试剂盒 :碧云天公司 ;MTT :
美国 Amersco 公司 ;过氧化氢酶 CAT、超氧化物歧
化酶 SOD、谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-PX、丙二醛
MDA 试剂盒 :南京建成生物工程研究所 ;环己烷、
石油醚、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、氯仿、正己烷、
酒精 :上海凌峰化学试剂有限公司。
1.1.3 动物 ICR 小鼠用于成纤维细胞的提取,由
扬州大学提供。
1.2 方法
1.2.1 番茄红素提取 参考番茄红素的已有提取方
法[5],取新鲜樱桃番茄整果捣碎成番茄糊,于 -70℃
速冻冰箱中反复冻融 3 次(对番茄细胞进行破壁处
理)[6],后用 95% 乙醇洗涤 3 次(料液比 1∶1)过
滤,滤渣用氯仿[7]浸提 4 h,重复 2 次(料液比 1∶5),
过滤,合并滤液,旋蒸法除去溶剂。溶质用正己烷
配成饱和溶液(40℃),0℃静置析晶得番茄红素粗
品。通过改变不同提取溶剂、浸提时间、料液比和
提取法等方式,得出番茄红素最佳提取条件,最大
可能地获得具有较强活性的番茄红素。
1.2.2 原代成纤维细胞的提取与培养 取出生 24
h 内的新生小鼠背部的皮肤组织若干块,用组织块
培养法分离真皮和表皮[8],眼科剪剪碎,每块约 1
mm2,剪切过程中可适量滴加培养液,保持湿润。
取培养瓶,用眼科镊小心将剪碎的组织块夹入培养
瓶中,用探针将组织块摆好,每块间距约 5 mm,每
瓶 20-30 块 /50 mL 左右,可滴加 4-6 滴胎牛血清。
轻轻将培养瓶翻转,注入 6 mL 含 20% 胎牛血清(4
mL/25 mL,6 mL/50 mL)的培养基,盖好瓶盖放入
孵箱静置 2-4 h。待组织块贴附牢固后,缓慢侧面翻
转平放,静置培养(若组织块不易贴壁,可预先在
瓶底壁贴薄层血清或者鼠尾胶原)[9,10],即得原代
成纤维细胞。
1.2.3 UVA 氧化损伤模型建立及 MTT 法测定番茄
红素最适浓度 将贴满培养瓶 80% 成纤维细胞以
0.25% 胰蛋白酶消化,收集细胞悬液。细胞计数,
以密度为 5×104/mL 接种于 96 孔板,每孔 100 μL,
于 37℃ 5% CO2 孵箱中孵育,细胞贴壁后取出细胞
培养板。用 0.5‰ DMSO 溶解番茄红素,分为纯空白
组(不含 DMSO 培养基)、空白对照组(含 DMSO
培养基,不给药不照射)、模型组(含 DMSO 培养
基,不给药照射)和给药组(梯度为 2.5、5、10、
20 μg/mL)。模型和给药组(用各浓度番茄红素提前
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期144
孵育 24 h)分别用 5 J/cm2 UVA 照射 5 min,光源离
细胞 15 cm。照射完弃原培养液加入新鲜培养液继
续孵育每组设 6 个复孔。设 3 个板平行 MTT 法检测
细胞增殖活性通过酶标仪测各孔的吸光度(A)值。
照射剂量(J/cm2)= 照射强度(w/cm2)× 照射
时间(s)
1.2.4 MDA 含量及 SOD、CAT、GSH-PX 活力检测
探索出最适浓度的番茄红素后,加入阳性对照药,
设计试验为 4 组 :空白组、模型组、番茄红素组、
熊果苷对照组,其中试验组和阳性药对照组浓度相
同。6 孔板培养细胞,每组设 2 个复孔。造模后孵
育 24 h,取细胞悬液检测脂质过氧化物 MDA 含量,
每孔分别用 PBS 清洗 2 遍,各孔加入 300 μL 双蒸水
并用刮刀刮下细胞,将细胞悬液转移至玻璃匀浆器
中 4℃手动匀浆 3 min。3 500 r/min 离心 10 min,取
上清检测 SOD、CAT、GSH-PX 活力。方法按试剂盒
说明书上进行,每次同时进行总蛋白检测,重复 3
次[11]。
1.2.5 统计学方法 用 SPSS13.0 软件对数据结果进
行统计学分析,模型组和空白组以及番茄红素组和
阳性药组均进行 t 检验、F 检验,P<0.05 结果具有
统计学意义。
2 结果
2.1 番茄红素的提取条件
2.1.1 前处理方法对提取率的影响 精密称取 15.0
g 的番茄糊 3 份,加入氯仿各 75 mL 用反复冻融法
(-70℃下速冻 30 min 后,解冻 5 min,重复 3 次)、
超 声 波 提 取 法(30 min)、0.5 mol/L NaOH 皂 化 法
(30 min)处理番茄糊后,在 490 nm 处测各提取液
的吸光度。试验结果(表 1)表明,相对于超声波
提取法和 NaOH 皂化法,反复冻融法对于番茄细胞
的破壁处理效果明显。
表 1 不同前处理方法对提取率的影响
前处理法 吸光度
反复冻融法 0.291
超声波提取法 0.265
NaOH 皂化法 0.272
2.1.2 浸提溶剂对提取率的影响 精密称取 8 份
15.0 g 左右的番茄糊,分别加入 75 mL 的石油醚、
环己烷、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯 / 丙
酮(2∶3)、丙酮、氯仿,25℃密闭避光静置 4 h,
抽滤。取 1 mL 左右浸取液测定最大吸收波长处的吸
光度 OD 值。试验结果(表 2)表明氯仿为最佳浸提
溶剂。
表 2 不同浸提溶剂对提取率的影响
溶液溶剂 吸光度
石油醚 0.280
环己烷 0.295
二氯甲烷 0.318
正己烷 0.295
乙酸乙酯 0.376
乙酸乙酯 / 丙酮(2∶3) 0.313
丙酮 0.318
氯仿 0.437
2.1.3 料液比对提取率的影响 精密称取 6 份 15.0
g 左右番茄糊,依次加入不同剂量的浸取液分别为
15、30、60、75 和 90 mL,密封避光 4 h。取相同适
量的浸出液测量 OD 值,结果(图 1)表明,由于料
液比较低时色素浓度高故舍去,根据浸取到达平衡
的规律以及数据结果显示,在尽量节省材料的前提
下 1∶5 最合适。
0.50
0.40
0.30
1ĩ1 1ĩ2 1ĩ3 1ĩ4 1ĩ5 1ĩ6
0.35
0.45
ᯉ⏢∄ g/mL
O
D
٬
图 1 料液比对提取率的影响
2.1.4 提取时间对提取率的影响 精密称取 7 份
15.0 g 左右番茄糊,分别在室温密封遮光条件下用
75 mL 氯 仿 浸 提 1、2、3、4、5、6 和 7 h, 各 取 1
mL 浸出液,测定最大吸收波长处吸光度。试验结果
(图 2)表明,浸提 4 h 时吸光度有明显提高,且更
长时间后也无明显提高,可知浸提 4 h 效果最佳。
综上,本试验选择以反复冻融法,氯仿为溶剂,
料液比为 1∶5,浸提 4 h 为番茄红素粗品的最佳提
取条件。
2013年第11期 145杨娜等 :番茄红素对 UVA 氧化损伤皮肤成纤维细胞的保护作用
2.2 MTT法测定番茄红素浓度对细胞增殖活性影响
通过 MTT 法检测不同组细胞的增殖活性(图
3),试验分为空白组、模型组、和不同浓度的给药
组。模型组和给药组分别给予 5 J/cm2 UVA 照射,数
据表明,模型组细胞的增殖活性低于空白组细胞
(P<0.05),存在显著性差异,表明建模成功。不同
浓度的番茄红素对成纤维细胞均有不同程度的保护
作用,其中 10 μg/mL 浓度的番茄红素与空白组比较
保护作用最为明显(P<0.01),具有统计学意义。且
在 20 μg/mL 处有保护作用下降,表明此方法获得的
番茄红素在 10 μg/mL 处为保护成纤维细胞的最适浓
度。图 4 为真皮组织块周围游离出的成纤维细胞。
分析下降可能存在两个原因,一是增加番茄红素浓
度,可能使细胞中参与番茄红素摄取的受体减敏,
机体细胞存在应激和自我保护机制,在外界物质浓
度不断变化的情况下,受体会发生相应的增敏和减
敏现象 ;二是在番茄红素天然提取的过程中可能存
在有机溶剂残留的情况,当增加番茄红素的浓度,
残留物质较低浓度高,存在细胞毒作用。
剂量的 UVA 辐照成纤维细胞后造成脂质过氧化物
MDA 含量的上升,SOD、CAT、GSH-PX 防氧酶活性
均有降低。模型组和空白组比较,具有显著性差异
(P<0.05)。番茄红素和阳性药熊果苷具有抗氧自由基
作用,能保护细胞缓解氧化损伤,降低脂质过氧化物,
增强防氧酶活力。番茄红素各组中 SOD、CAT 以及
GSH-PX 的活性差异有统计学意义(P<0.01),其中
番茄红素的保护作用明显强于熊果苷。说明番茄红
素通过加强典型防氧链中酶的活性,降低脂质过氧
化物 MDA 来降低细胞的氧化损伤(图 5)。
0.5
0.4
0.3 

0.2䞦ḷ
ԚO
D
٬
0.1
0.0
2.5 μg/mL⁑රオⲭ
㓴࡛
5 μg/mL 10 μg/mL 20 μg/mL
0.3
0.4
0.2
O
D
٬
0.1
0.0
1 2 3⎨ᨀᰦ䰤 h 4 5 6 7
图 2 提取时间对提取率的影响
#P<0.05,##P<0.01 VS 空白组 ;*P<0.05,**P<0.01 VS 模型组
图 3 不同浓度的番茄红素对细胞的保护作用
2.3 MDA含量及防氧酶活力检测
选用熊果苷为阳性对照药,由表 3 表明,5 J/cm2
图 4 真皮组织块周围游离出的成纤维细胞
≗㠚⭡ส
㓶㜎∂ᙗ 䜘࠶㓶㜎∂ᙗ
⮚㤴㓒㍐ 㠤ⱼᙗ
ᰐ㓶㜎∂ᙗ
ROS
SOD
fibroblast
MDA
GSH CAT
H2O2 H2O
图 5 番茄红素对 UVA 辐射后成纤维细胞的抗氧化保护作用
3 讨论
近些年来抗氧化、抗光老化、清除氧自由基一
直是生物保健品和化妆品行业研究的热门话题,其
中以红养白的新理念异军突起,含有红色素的天然
植物被逐渐研究应用,如红景天中的红景天苷类化
合物[12]和红石榴中的多酚类以及花青苷类化合物
的研究日趋热门[13,14]。番茄红素作为一种取材广泛
的天然抗氧化物,近些年来的研究不在少数。诸多
研究表明其可防止前列腺癌[15]、乳腺癌及消化道癌
症[16]的发生,但其应用多为生物保健品方面,缺
少对于皮肤抗光老化和防晒方面的研究。特别对于
受 UVA 损伤最为严重的真皮成纤维细胞,以茶多
酚[17]、白藜芦醇[18]为代表的多酚类化合物和芦荟
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期146
苷等类黄酮化合物[19]的研究较多,但对于番茄红
素这种类胡萝卜素类的天然抗氧化物的研究非常匮
乏。客观来说本试验对于其研究和日后的开发应用
具有较大的现实意义。
大量资料表明熊果苷是抗氧化活性很强的抗氧
化剂[20],本试验比较了番茄红素和阳性药熊果苷
对细胞氧化损伤的保护作用。已知超氧化物歧化酶
SOD 可将细胞内一些氧自由基通过歧化的方式转变
为 H2O2,再由过氧化氢酶 CAT 和谷胱甘肽过氧化物
酶 GSH-PX 将其转变为对细胞无毒性的水,而脂质
过氧化反应是 H2O2 诱导细胞膜损伤最为常见的途径
之一[21]。因此,试验结果较好地验证了番茄红素可
以通过以上各种抗氧化酶相互作用,将氧自由基逐
渐减毒以抵抗光老化。
鉴于熊果苷在化妆品中的较好应用和其活性的
广泛验证[22],设想可将番茄红素和熊果苷抗氧化机
制进行充分的探寻对比,并将两者进行有效的结合,
形成天然的抗氧化复方。
此外,基于本试验的研究对象为皮肤真皮层成
纤维细胞,已知当 UV 辐射后机体会进行自我防卫,
通过麦拉宁细胞激活酪氨酸酶逐渐产生多巴等黑色
素前体化合物[23,24]。为进一步进行应用研究可将研
究对象转变为黑色素瘤细胞,来探索番茄红素等天
然植物色素对此类细胞的作用。
4 结论
成功实现真皮成纤维细胞的原代分离培养和番
茄红素提取的优化,并通过建立了一个快速的氧化
损伤模型,比较了番茄红素和阳性药熊果苷对 UVA
辐照光老化后真皮成纤维细胞损伤的保护作用。通
过对防氧酶链的活力检测数据表明,按照此种提取
方法所得 10 μg/mL 左右浓度的番茄红素可以加强这
一典型防氧酶链的活力并减少脂质过氧化物来缓解
氧化损伤,对 UVA 紫外损伤细胞具有明显保护作用。
参 考 文 献
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表 3 MDA 活力,SOD、CAT 以及 GSH-PX 的活性差异
组别 MDA 活力(nmol/mg prot.) SOD(U/mg prot.) CAT(U/mg prot.) GSH-PX(U/mg prot.)
空白 0.1833±0.0015 138.6±2.1 81.18±0.19 292.1±24.0
模型 0.2281±0.0045# 134.2±0.2# 64.71±0.15## 159.6±22.8#
番茄红素 0.1877±0.0027** 142.3±1.1** 93.49±0.17** 450.2±11.5*
熊果苷 0.1989±0.0052 136.9±0.9 78.51±0.06 350.1±15.6
#P<0.05 ,##P<0.01 VS 空白组 ;*P<0.05,**P<0.01 VS 模型组
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(责任编辑 马鑫)