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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):125-130
1993 年，ASR（Abscisic acid-stress-ripening）基
因首次在番茄中被发现［1］，随后多个物种的 ASR 基
因被分离到。有趣的是，ASR 基因在拟南芥基因组
中不存在［2，3］。ASR 基因编码的蛋白具有转录因子
和 LEA（Late embryogenesis abundant protein） 蛋 白
的基本特征。ASR 基因的功能主要是参与调控植物
生长发育、衰老、果实成熟、激素信号转导以及对
逆境胁迫的应答［2，3］。
多个物种的 ASR 基因都被报道受水分胁迫（干
旱、渗透、脱水胁迫）以及 ABA 诱 导［2，3］，ASR 基
因也因此而得名。2005 年 Yang 等［4］研究表明，百
合的 ASR 基因（LLA23）受 ABA、脱水胁迫和高盐
胁迫诱导。随后，在拟南芥中过量表达百合 ASR 基
因（LLA23）发现，LLA23 过表达株系提高了对干旱
胁迫的耐受性。生理学分析表明，在干旱处理条件
下，转基因株系具有较低的水散失率 ；在甘露醇渗
收稿日期 ：2015-02-02
基金项目 ：中央级公益性科研院所基本科研业务费（1630052014003，ITBB140204），海南省自然科学基金项目（314122），海南省重大科技
专项（ZDZX2013023-1）
作者简介 ：胡伟，男，助理研究员，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：huwei2010916@126.com
通讯作者 ：彭明，男，博士生导师，研究方向 ：植物分子遗传和作物遗传育种 ；E-mail ：mmpeng_2000@yahoo.com
木薯 MeASR 基因克隆及表达分析
胡伟  颜彦  韦运谢  王文泉  夏志强  卢诚  侯晓婉  彭明
（中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）
摘 要 ： 脱落酸 - 胁迫 - 成熟诱导蛋白（Abscisic acid-stress-ripening，ASR）在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着
重要作用。利用 PCR 技术从木薯中克隆了第一个 ASR 基因 MeASR，序列分析表明该基因开放阅读框（ORF）330 bp，编码 109 个
氨基酸。多序列比对和进化树分析表明该基因所编码的蛋白具有 ASR 家族蛋白的保守结构域，与番茄 ASR 家族蛋白 SlASR4 具有
较近的亲缘关系。亚细胞定位分析表明 MeASR 定位在细胞核，实时荧光定量 PCR 分析表明该基因的表达显著受渗透胁迫和 ABA
诱导。结果表明，MeASR 可能作为转录因子参与木薯对干旱逆境胁迫应答及 ABA 信号调节。
关键词 ： 木薯 ；MeASR 基因 ；基因克隆 ；表达分析 ；亚细胞定位
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.021
Clone and Expression of MeASR Gene in Cassava
Hu Wei Yan Yan Wei Yunxie Wang Wenquan Xia Zhiqiang Lu Cheng Hou Xiaowan Peng Ming
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou 571101）
Abstract:  Abscisic acid-stress-ripening induced protein（ASR）plays an important role in response to abiotic stresses. In the present
study we isolated a first ASR gene designated MeASR from cassava. Sequence analysis showed that the open reading frame of MeASR gene
contained 330 bp, encoding 109 amino acids. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis indicated that MeASR protein contained
the conserved domains as ASR family had, and had a close genetic relationship with SlASR4 of tomato. Subcellular location assay showed that
MeASR protein was localized in nucleus. Real-time quantitative PCR assay revealed that expression of MeASR was induced by osmotic stress and
ABA treatments. These results suggested that MeASR might function as a transcription factor to involve in response to drought stress and ABA-
signal regulation in cassava.
Key words:  cassava ；MeASR gene ；gene clone ；expression analysis ；subcellular location
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10126
透胁迫处理条件下，转基因株系的发芽率高于野生
型。此外，LLA23 的过量表达能够改变转基因植株
中 ABA 和胁迫相关基因的表达水平。这一结果首次
从遗传学上证明了 ASR 基因参与调控 ABA 信号转
导，并能增强植物对干旱胁迫的耐受性。随后，来
自于番茄、香蕉、玉米、水稻、小麦的 ASR 基因都
被报道在提高植物抗旱性上发挥着重要作用［5-10］。
这些研究结果证明了 ASR 基因通过减少水分散失、
促进渗透平衡、减少细胞损伤、降低活性氧积累、
诱导抗氧化系统等生物学过程增强植物对干旱和渗
透胁迫的耐受性［5-10］。所以可以肯定，ASR 基因参
与 ABA 信号转导，并能提高植物对干旱胁迫的耐受
性，但是其作用机制仍然有待于进一步研究。
木薯（Manihot esculenta Crantz）是三大薯类作
物之一，全球第六大粮食作物，被誉为“淀粉之王”，
是世界近 8 亿人口赖以生存的粮食。在我国，木薯
作为新型能源、工业原料和潜在的粮食作物，具有
良好的发展潜力，是热带和亚热带地区最重要的经
济作物之一。木薯具有耐旱的生物学特性，一般情
况下，木薯能够忍耐 4-6 个月的干旱胁迫，是一种
典型的耐旱作物［11］。木薯特殊的耐旱能力表现在
通过丰富的根系从土壤深层吸收水分（地下 2 m），
通过快速的气孔关闭减少水分散失，通过老叶片脱
落减少水分消耗，最终提高木薯对水分的利用效
率，从而使木薯具有耐旱的特性。而且，在干旱胁
迫后恢复浇水，木薯能够快速地再生新叶片，维持
正常的新陈代谢，并补偿生物量［12］。木薯在干旱
胁迫下对水分的吸收、气孔运动、叶片脱落等生物
学过程都是受 ABA 控制的关键生物学过程。因此，
Okogbenin 等［12］提出 ABA 生物合成及信号转导可
能是调控木薯特殊耐旱性的关键途径之一。最近的
研究表明，木薯在适应干旱胁迫的过程中可能通过
减缓生长，从而延长对干旱胁迫的耐受时间 ；或者
通过老叶片的脱落维持一定的生长，从而抵抗干旱
胁迫［13］。虽然，近年来的研究取得了一定的研究进
展，但是对木薯耐旱机理的研究还不深入。本研究
从木薯克隆第一个 ASR 基因（MeASR），分析 MeASR
的细胞定位，并研究该基因在干旱和 ABA 处理的表
达水平，旨在研究木薯中的干旱胁迫应答基因，为
进一步解析木薯的耐旱机理提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用木薯品种为 KU50，由中国热带农业
科学院热带生物技术研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 将木薯茎秆用刀切成约 10 cm 长
的小节，每一小节含数个芽眼。将茎秆插入含有营
养土和蛭石的盆中，待其发芽、生根。将生长两
个月、且长势一致的木薯幼苗作为供试材料，以
不处理的木薯幼苗作为对照，设置两个处理组 ：
（1）甘露醇处理组共 24 颗木薯幼苗，每个样品 3
颗，用 300 mmol/L 甘露醇对木薯幼苗进行 0 h、2 h、
6 h、3 d、14 d、18 d、24 d 和 36 d 灌根处理 ；（2）
ABA 处理组共 21 颗木薯幼苗，每个样品 3 颗，用
100 μmol/L ABA 对木薯幼苗进行 0、2、6、10、24、
48 和 72 h（甘露醇、脱落酸等生化试剂购自上海生
工生物工程有限公司）喷施。取每个处理的木薯幼
苗叶片用液氮冷冻，并放入 -80℃超低温冰箱保存。
1.2.2 RNA 的提取及 cDNA 的合成 分别取 1.2.1 不
同处理后的幼苗叶片，按照 RNA 提取试剂盒（天根
生化科技有限公司）的使用方法提取木薯总 RNA。
同时，利用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
（Fermentas 公司）将提取的总 RNA 反转录成 cDNA，
并于 -20℃保存备用。
1.2.3 基因克隆 以获得的 cDNA 第一链为模板，设
计正向引物 P1 ：5-ATGGCAGAAGAGAATAAGCA-3
和 反 向 引 物 P2 ：5-TTAAAAGAGATGGTGATGCTT-
CT-3 进 行 PCR 扩 增。 反 应 体 系 为 ：Taq DNA 聚
合酶（康为世纪生物公司）0.5 μL，dNTP 0.5 μL，
10× Buffer 2 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板
1 μL，ddH2O 15.5 μL ；反应程序为 ：94℃预变性 5
min ；94℃变性 20 s，48℃退火 20 s，72℃延伸 30 s，
35 个循环 ；72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物经回收、
连接、转化后，挑取单克隆在 LB 液体培养基中培养，
并进行 PCR 鉴定。然后将已鉴定的阳性克隆送华大
基因生物科技公司测序。
1.2.4 生 物 信 息 学 分 析 利 用 DNAMAN 软 件 和
BLAST（http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 进 行
序列比对和保守结构预测 ；利用 ORF Finder（http ：//
2015,31(10) 127胡伟等 ：木薯 MeASR 基因克隆及表达分析
www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 及 GENSCAN
（http ：//genes.mit.edu/GENSCAN.html）进行基因开放
阅读框预测 ；利用 MEGA 5.0 软件构建进化树。
1.2.5 亚细胞定位分析 根据 MeASR 基因的 ORF
序列设计带有酶切位点 Nco Ｉ /Spe Ｉ且不含终止子
的引物 ：P3 ：5-CATGCCATGGCGATGGCAGAAGAG
AATAAGCA-3 ；P4 ：5-GGACTAGTAAAGAGATGGT
GATGCTTCT-3。从正常生长两个月的木薯幼苗叶片
cDNA 中扩增 MeASR 基因的开放阅读框，将扩增产
物回收后连接到克隆载体 pMD18-T 上，获得重组质
粒，阳性克隆测序正确后，用 Nco Ｉ /Spe Ｉ进行双
酶切并回收目的片段。同时，利用 Nco Ｉ /Spe Ｉ双
酶切 pCAMBIA1304 载体，并回收载体片段。利用
T4 连接酶将目的片段和载体片段进行连接，将连接
产物转化大肠杆菌 DH5α 后，挑取单克隆扩大培养，
经 PCR 和质粒双酶切验证后，进行测序分析，构建
成植物表达载体 pCAMBIA1304-MeASR-GFP。将测
序正确的阳性克隆的质粒转入农杆菌 LBA4404 中。
利 用 农 杆 菌 介 导 的 瞬 时 转 化 法 将 pCAMBIA1304-
MeASR-GFP 导入洋葱表皮细胞中，随后将洋葱表皮
放在铺有滤纸的 MS 培养基上，25℃暗培养 16-24 h，
然后制作装片，通过 FluoViewTM FV1000 激光扫描共
聚焦显微镜观察荧光信号。
1.2.6 基因的表达分析 根据 TaKaRa 实时荧光定
量标准说明书设计 qRT-PCR 引物（MeASR ：P5 5-
TCACAAGGAAGGCGAAGA-3 ；P6 ：5-GCAAAGGC-
AAATCCAATA-3 ；MeEF1 引 物 ：P7 ：5-TGAACC-
ACCCTGGTCAGATTGGAA-3，P8 ：5-AACTTGGG-
CTCCTTCTCAAGCTCT-3），引物均由上海生工生物
工程有限公司合成。为了保证引物的特异性，引物
设计在非保守区域，PCR 产物的长度维持在 300 bp
以内，并进行了测序分析。以 1.2.2 中得到的 cDNA
为模板，以木薯 MeEF1 基因为内参进行 qRT-PCR
分析。实时荧光定量 PCR 采用 SYBR Green Ⅰ试剂
盒（TaKaRa 公司），按照操作说明在 Mx 3005P 荧光
定量 PCR 仪（吉泰生物科技有限公司）上进行。荧
光定量 PCR 的反应程序 ：95℃预变性 3 min ；95℃
变性 7 s，55℃退火 10 s，72℃延伸 15 s，循环 40 次。
荧光定量 PCR 的反应体系 ：SYBR Green Ⅰ 10 μL，
ROX 0.4 μL，引物 0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 7.6
μL。每个样品的 qRT-PCR 实验都在相同的反应体系
下进行 3 次生物学重复。结果分析计算采用 2-ΔΔCt
法［14］：
ΔΔCt=（CT，Target-CT，Actin）Time x-（CT，Target-CT，Actin）Time 0。
2 结果
2.1 MeASR基因的克隆及生物信息学分析
根 据 木 薯 数 据 库 中 的 序 列 信 息， 发 现 一 个
cDNA 序列与 ASR 家族基因具有较高的同源性。利
用 P1/P2 引物对正常生长两个月的木薯幼苗叶片
cDNA 进行 PCR 扩增，克隆该基因的 cDNA 全长序
列（图 1）。将扩增产物插入 T 载体并测序后，经
GENSCAN、Blast 和 ORF Finder 分析发现，该 cDNA
序列中存在一个 330 bp 的开放阅读框（ORF），编码
109 个氨基酸，将其命名为 MeASR。BLASTN 分析
表明，MeASR 与大豆的 ASR 基因（NM_001250558）
具有较高的一致性（84%）。多序列比对分析（图 2）
表明，该基因编码的氨基酸序列具有一个保守的组
氨酸富集区，两个丙氨酸富集区，一个豆蔻酰化位
点。进化树分析（图 3）表明，MeASR 蛋白与番茄
SlASR4 亲缘关系较近。
2000
bp
M 1
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；1 ：MeASR 基因的 cDNA 全长
图 1 MeASR 基因的 cDNA 全长电泳图
2.2 MeASR的亚细胞定位分析
利 用 农 杆 菌 介 导 的 瞬 时 转 化 法 将 构 建 成 功
的 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA1304-MeASR-GFP 和
pCAMBIA1304 空载体分别导入洋葱表皮细胞，25℃
暗培养 24 h 后，在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧
光蛋白信号在细胞内的分布，结果（图 4）显示，
pCAMBIA1304-MeASR-GFP 仅在洋葱表皮细胞的细
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10128
胞核中表达，而 pCAMBIA1304 空载体在细胞膜、细
胞质和细胞核中都有分布。这些结果表明 MeASR 蛋
白定位在细胞核上。
2.3 MeASR基因的表达分析
利用实时荧光定量 PCR 的方法研究了木薯在渗
透胁迫及 ABA 处理下 MeASR 基因的表达水平。结
果表明，经甘露醇处理 2 h 和 6 h，MeASR 表达水
平显著增强，处理 3-18 d 轻微下降，处理时间延长
至 24 d 时其表达水平最高（图 5-A）。在 ABA 处理
10 h，MeASR 表达无显著变化，在处理 24 h 和 48 h
显著增强（图 5-B）。这些结果表明，MeASR 能够在
SlASR2
OsASR5
ZmASR1
ZmASR2
MeASR
20
39
39
31
18
SlASR2
OsASR5
ZmASR1
ZmASR2
MeASR
His *
55
79
79
71
51
SlASR2
OsASR5
ZmASR1
ZmASR2
MeASR
95
119
119
111
91
SlASR2
OsASR5
ZmASR1
ZmASR2
MeASR
114
137
137
130
109
Ala
Ala
ABA/WDS 结构域用方框表示 ；豆蔻酰化位点用星号表示 ；组氨酸富集区和丙氨酸富集区用单横线表示
图 2 MeASR 与其它 ASR 的多序列比对分析
ZmASR2
ZmASR1
ZmASR5
ZmASR6
ZmASR4
ZmASR7-1
ZmASR3
ZmASR7-3
ZmASR7-2
OsASR2
OsASR1
OsASR6
OsASR4
OsASR3
OsASR5
SIASR4
SIASR1
MeASR
SIASR2
SIASR5
95
97
77
71
36 94
49 99
52
71
81
36
59
60
84
96
89
0.1
SIASR3
图 3 MeASR 与水稻、番茄、玉米 ASR 家族成员的系统
进化树
A
B
C
D
E
F
A ：pCAMBIA1304 的绿色荧光信号图 ；C ：pCAMBIA1304 的明场图 ；
B ：A 与 C 的叠合图 ；D ：MeASR-GFP 的绿色荧光信号图 ；F ：明场图 ；
E ：D 与 F 的叠合图
图 4 MeASR 亚细胞定位分析
2015,31(10) 129胡伟等 ：木薯 MeASR 基因克隆及表达分析
转录水平受渗透胁迫和 ABA 诱导。
3 讨论
干旱胁迫是影响植物生长发育以及作物产量和
品质的重要环境因子。植物对干旱胁迫的应答主要
是通过对胁迫信号的感知和转导，促进胁迫相关基
因的表达和蛋白质的合成，导致生理生化的变化和
代谢物的合成，从而降低胁迫所导致的伤害。植物
对干旱胁迫的响应是一个非常复杂的过程，其中转
录调控是植物应答干旱胁迫的一种重要方式。所以，
转录因子在植物对干旱胁迫的应答过程中起着至关
重要的作用［15］。ASR 蛋白具有转录因子和 LEA 蛋
白的基本特征。一些研究表明 ASR 蛋白定位在细胞
核中，具有转录激活活力，能够以 Zn2+ 依赖的方式
与 DNA 结合，从而激活转录。然而，ASR 蛋白也
被认为属于第 7 类和胚胎发育晚期丰富蛋白（Late
embryogenesis abundant protein，LEA），具有分子伴
侣功能，能够对细胞进行直接地保护［2，3］。因此，
可以推测，不同的 ASR 家族成员可能具有不同的
生化特征。亚细胞定位分析表明，MeASR 蛋白定位
在细胞核，这与转录因子的特征相符，这一结果与
小麦 TaASR1 和葡萄 ASR 定位在细胞核中的结果一
致［9，16］，为进一步研究 MeASR 转录因子的基本特
征提供参考。
ASR 家族基因被报道广泛地参与植物对干旱胁
迫的应答，并且多个物种的 ASR 基因都被报道在提
高植物抗旱性上发挥着重要作用。而且，值得注意
的是，在玉米中过表达 ZmASR1 发现，在正常生长
条件下转基因株系的产量比野生型高 7%-17%。而
且，在干旱胁迫下，ZmASR1 转基因植株仍然能够
维持这一产量性状［7］。一些 ASR 家族基因的进化
被证明是植物对干旱性状正向选择的结果。所以，
ASR 基因是作物抗性育种较为重要的候选基因。本
研究分析了 MeASR 基因在干旱及 ABA 处理下的表
达模式，结果表明该基因能够在转录水平显著受干
旱和 ABA 诱导。这一研究结果与番茄 ASR1、水稻
OsAsr1、香蕉 MpASR、玉米 ZmASR1、小麦 TaASR1
等基因在干旱及 ABA 处理下的表达模式相似［5-10］。
而且，这些基因已经从遗传学上被证明能够提高植
物对干旱胁迫的耐受性。因此，木薯 MeASR 可能具
有抗旱功能。
4 结论
本研究克隆了木薯 ASR 基因 MeASR，亚细胞
定位结果表明 MeASR 蛋白定位在细胞核上。此外，
利 用 实 时 荧 光 定 量 PCR 对 MeASR 基 因 在 干 旱 及
ABA 处理下的表达模式也进行了分析，结果表明该
基因在转录水平受渗透胁迫和 ABA 诱导。
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A
0
2
4
6
0 h 2 h
*
*
**
**
** **
*
**
6 h 3 d 14 d 18 d 24 d 36 d༴⨶ᰦ䰤⴨ሩ㺘䗮䟿
B
0
1
2
3
0 2 6 10 24 48 72༴⨶ᰦ䰤/h⴨ሩ㺘䗮䟿
A ：甘露醇处理 ；B ：脱落酸处理。误差线表示 4 次重复的标准差 ；* 表示 t-
检验的显著性分析（*P<0.05 ；**P<0.01）
图 5 MeASR 基因在甘露醇和脱落酸处理下的表达分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10130
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（责任编辑 马鑫）