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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):119-124
酰基辅酶 A 合成酶（acyl-CoA synthetase，ACS）
也称为脂肪酸：CoA 连接酶，一般情况下，ACS 根据
其脂肪酸底物的碳链长度而被分为短链 ACS、中链
ACS、长链 ACS 三类［1，2］。ACS 广泛存在于真核和
原核生物中，多含两个高度保守区域 ：AMP-binding
domain 和 fatty acid acyl-coA synthetase（FACS） 区。
其中 FACS 区作为脂肪酸绑定位点，特异存在于中
长链 ACS 中，对酶催化活性有重要影响［3，4］。ACS
能将细胞内脂肪酸活化成与之对应的辅酶 A 硫酯底
物，该底物能参与胞内脂肪酸碳链延长、三脂酰甘
收稿日期 ：2015-01-21
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31100582，31470431），中国博士后科学基金项目（2014M562199），深圳市科技计划项目
（JCYJ20120613112512654）
作者简介 ：宋燕子，女，硕士研究生，研究方向 ：海洋生物学 ；E-mail ：swallowsong@163.com
通讯作者 ：黄瑛，女，博士，副教授，研究方向 ：藻类生物能源 ；E-mail ：huangy@szu.edu.cn
莱茵衣藻酰基辅酶 A 合成酶 cDNA 克隆及其酵母表达
宋燕子  贾彬  林柏成  胡章立  黄瑛
（深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室 深圳市海洋藻类开发与应用工程实验室 深圳大学生命科学学院，深圳 518060）
摘 要 ： 旨在预测并克隆莱茵衣藻酰基辅酶 A 合成酶 cDNA（cracs），分析其在酵母中的功能。RT-PCR 克隆 cracs 序列，
ClustalW 和 MEGA6.0 软件分别分析其编码蛋白保守序列和进化树，表达并分析其在酵母 YB525 中的底物偏好性。结果表明，首
次在莱茵衣藻中克隆获得一个 cracs，测序表明其序列大小为 2 004 bp，编码 667 个氨基酸，编码蛋白 crACS 的预测分子量为 72.3
kD，包含酰基辅酶 A 合成酶的两个保守区 ：AMP-binding 区和 FACS 区。进化树比对显示，crACS 与拟南芥的长链酰基辅酶 A 合
成酶 LACSs 具有较高的同源性。酵母表达显示 cracs 编码蛋白能互补酵母 YB525 LACS 的缺陷表型，活化并优先利用 C16∶1 和
C14∶0。莱茵衣藻 cracs 编码蛋白可活化外源脂肪酸，属于酰基辅酶 A 合成酶家族。
关键词 ： 莱茵衣藻 ；酰基辅酶 A 合成酶 ；酵母 YB525 ；进化树 ；脂肪酸
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.016
cDNA Cloning and Yeast Expression of Acyl-CoA Synthetase of
Chlamydomonas reinhardtii
Song Yanzi Jia Bin Lin Baicheng Hu Zhangli Huang Ying
（Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresource and Eco-environmental Science，Shenzhen Engineering Laboratory of Marine Algae
Biotechnology，College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060）
Abstract: This work aims to predict and clone cDNA of Chlamydomonas reinhardtii acyl-CoA synthetase（gene cracs）, and analyze its
function in yeast Saccharomyces cerevisiae YB525. The cracs sequence was cloned by RT-PCR, its conserved sequence of encoded protein and
phylogenetic tree were analyzed with ClustalW and MEGA6.0, then the substrate specificity in YB525 of expressed gene was analyzed. As the
results, a cracs was cloned for the first time with sequence of 2 004 bp and encoded a 72.3 kD protein crACS of 667 amino acids containing two
conserved regions of including acyl-CoA synthetase ：the AMP-binding domain and the FACS motif. The phylogenetic tree analysis indicated that
crACS shared high homology with LACs of Arabidopsis thaliana. Yeast expression experiments showed that crACS restored acyl-CoA synthetase
deficient phenotype of YB525 and assimilated foreign palmitoleic acid and myristic acid. Conclusively, cracs of C. reinhardtii can activate
exogenous fatty acid and belongs to acyl-CoA synthetase family.
Key words: Chlamydomonas reinhardtii ；acyl-CoA synthetase ；yeast YB525 ；phylogenetic tree ；fatty acid
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9120
油合成、蛋白脂酰化、脂肪酸氧化降解等过程［5］。
莱茵衣藻作为微藻研究的模式生物，已被广泛
地应用于微藻油脂合成研究［6-8］，但其酰基辅酶 A
合成酶 crACS 却鲜有报道，在油脂合成与代谢中的
功能尚不明确。本研究通过生物信息学方法预测一
条莱茵衣藻酰基辅酶 A 合成酶基因，对其 cDNA 进
行克隆，并通过酵母互补实验初步研究其生物学功
能，以期为莱茵衣藻油脂合成与分解代谢研究提供
依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 藻 株 和 菌 株 莱 茵 衣 藻（Chlamydomonas
reinhardtii CC849）由本实验室藻种库提供。酿酒酵
母（Saccharomyces cerevisiae YB525）由中国海洋大
学潘克厚教授慷慨提供［9］。
1.1.2 酶及试剂 RNA 提取试剂盒 TaKaRa RNAiso
Plus、反转录试剂盒、酵母基因组提取试剂盒均购
于 TaKaRa 生物工程（大连）有限公司。引物由上
海生物工程有限公司合成。脂肪酸标准品购于上海
安普生物科学仪器有限公司。尿嘧啶缺陷型培养基
购于北京泛基诺科技有限公司。其他均为常规分子
和化学分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 培养方法 莱茵衣藻生长培养基为 TAP，培
养温度 23℃，100 μE/m2/s，持续光照 12 h/d ；YB525
生长培养基为 YPD，筛选培养基为尿嘧啶缺陷型培
养基添加 2%（W/V）葡萄糖，诱导培养基为尿嘧
啶缺陷型培养基添加 2% 半乳糖，功能分析培养基
为诱导培养基添加不同碳链长度的脂肪酸（分别为
C12∶0、C14∶0、C16∶0、C16∶1 和 C18∶0， 浓
度 100 μmol/L），培养温度 30℃，转速 220 r/min。
1.2.2 总 RNA 的提取 取对数末期 CC849 藻液 2
mL，去上清后用 TaKaRa RNAiso Plus 试剂盒提取
总 RNA，具体步骤参照试剂盒说明书。经 Nanodrop
ND2000 和琼脂糖凝胶电泳分析，质量合格的 RNA
置 -80℃保存备用。
1.2.3 cDNA 克 隆 及 序 列分 析 取 1 μg CC849 总
RNA，用 TaKaRa 反转录试剂盒，合成 cDNA 第 1 条
链。根据 NCBI 数据库中同源物种酰基辅酶 A 合成
酶序列 XM_001702895，设计引物 crACSF 和 crACSR
（表 1），使用 GC buffer I、LA-Taq 酶扩增莱茵衣藻
酰基辅酶 A 合成酶 cDNA cracs。PCR 条件为 ：94℃
预变性 5 min ；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，35
个循环 ；72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物切胶回收
后连接到 pEASY-T1 simple 载体并转化感受态细胞，
挑选阳性克隆测序，测序正确的质粒命名为 cracs-T。
MEGA6.0 分析基因家族的系统进化树，采用
Bootstrap 方 法 重 复 1 000 次 分 析，Neighbor-Joining
算法构建进化树。DNAMAN 软件分析 cracs 编码蛋
白的属性。ClustalW 分析保守序列。
表 1 引物序列
名称 引物序列（5-3） 酶切位点
crACSF GGGGTACCATGGAGCCGGCCCGCCCGGCTGGT Kpn I
crACSR CCGCTCGAGTCACGACGCCGGCGCTC Xho I
VF TAATACGACTCACTATAGGGAAT
VR TAAGCGTGACATAACTAAT
1.2.4 YB525 表达载体构建 利用限制性内切酶
Kpn I 和 Xho I 分别双酶切质粒 pYES2 和 cracs-T，酶
切产物 pYES2 和 cracs 回收后进行酶连，转化大肠杆
菌，经过 PCR、双酶切和测序验证正确的重组载体
被命名为 pYES2-cracs。
1.2.5 YB525 转化子的筛选及鉴定 将重组载体
pYES2-cracs 和 pYES2 以 电 转 化 的 方 法［10］ 转 入
YB525，30℃培养一周，用筛选培养基筛选转化子。
随机选取转化子并培养后提取基因组 DNA，以表 1
引物 VF/VR 对其进行 PCR 鉴定和测序分析。pYES2
和 pYES2-cracs 的酵母阳性转化子分别命名为 YPES2
和 YPACS。
1.2.6 crACS 在 YB525 中的表达与功能验证 筛选
培养基 30℃，220 r/min 培养 YPES2 和 YPACS 至对
数中后期，收集 100 mL 菌体，2 mol/L 山梨醇洗两次，
诱导培养基培养 4 h。取 100 μL 培养液接种于 10 mL
功能分析培养基，培养 240 h 后测定其 OD600 值。
2 结果
2.1 cDNA克隆及序列分析
克隆 cDNA 序列片段及将其连接到 pEASY-T1
simple 载体后的双酶切结果如图 1 所示，测序显
2015,31(9) 121宋燕子等：莱茵衣藻酰基辅酶 A合成酶 cDNA 克隆及其酵母表达
示 其 大 小 为 2 004 bp， 与 NCBI 数 据 库 登 录 号 为
XM_001702895 的序列一致。根据核苷酸序列测定
结果和比较基因组学分析，推测出该基因包含 16 个
外显子，15 个内含子，内含子均以 GT 开始并以 AG
结尾，基本符合内含子的特征。该基因外显子与内
含子的分布，见图 2。DNAMAN 分析表明，cracs 编
码的蛋白质含有 667 个氨基酸残基，推测其分子量
为 72.3 kD，等电点为 6.87。
存在两段高度保守的区域。保守序列分别为“YTS-
GTTGDPK”和“DGXXHTGDXGXXXXXGXLK-IIDRKK”，
前 者 为 AMP-binding 蛋 白 家 族 成 员 中 高 度 保 守 的
AMP-绑定位点，该序列普遍存在于所有已报道的酰
基活化酶超家族成员中，后者恰为脂肪酸的绑定位
点 FACS 区。这两个保守区基本存在于所有物种的
中长链 ACS 中。因此，初步推测 crACS 为莱茵衣藻
酰基辅酶 A 合成酶。
2.2 进化树分析
基于 crACS 与拟南芥、三角褐指藻等 9 个物
种的 23 条 ACS 蛋白序列绘制的进化树（图 4）显
示，所有的 ACS 都起源于同一个祖先。莱茵衣藻
crACS 与 拟 南 芥 AtLACS1、AtLACS2、AtLACS3、
AtLACS4、AtLACS5 及甘蓝型油菜 BnLACS 同属一
个 进 化 分 支， 而 与 拟 南 芥 AtLACS6、AtLACS67、
AtLACS68、AtLACS9 聚 类 于 不 同 的 进 化 分 支。 进
化树还显示 crACS 与人、褐家鼠、铜绿假单胞菌
的 ACS 的 亲 缘 均 较 远。 此 外， 两 个 超 长 链 ACS
AAC17118.1/ NP_003636 处于进化分枝的最外围，与
crACS 的亲缘关系最远，据此推测 crACS 不属于超
长链 ACS。
2000
bp
1A BM 2 M
2000
bp
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：RT-PCR 产物 ；2 ：cracs-T 双酶切产物
图 1 莱茵衣藻 cracs 的 RT-PCR 产物（A）和 cracs-T（B）
双酶切产物凝胶电泳分析
用 Bioedit 软件比对 crACS 与拟南芥等 9 个物种
的 10 条 ACS 氨基酸序列，结果（图 3）显示 crACS
1
119 548 913 1296 1675 2068 2310 2630 2961 3258 3649 3996 5172 5426 5881 6230
337 824 1169 1549 1914 2258 2525 2869 3111 3509 3904 5071 5364 5650 6077ཆᱮᆀ˖ ޵ਜ਼ᆀ˖
数字表示外显子所在的起始和终止位置
图 2 cracs 基因示意图
BAA33581.1
AGZ03886.1
XP_002293417.1
AAM28873.1
CAA64327.1
AAM28871.1
NP_014962.3
NP_004448.2
BAA22195.1
NP_251989.1
crACS
AMP-bing domain
FACS signature motif
所 有 的 蛋 白 序 列 来 自 NCBI ：BAA33581.1/ BAA22195.1 ：褐 家 鼠（Rattus norvegicus）；AGZ03886.1 ：三 角 褐 指 藻（Phaeodactylum
tricornutum）；XP_002293417.1 ：假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）；AAM28873.1/ AAM28871.1 ：拟南芥（Arabidopsis thaliana）；
CAA64327.1 ：甘 蓝 型 油 菜（Brassica napus）；NP_014962.3 ：酿 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae）；NP_004448.2 ：人（Homo sapiens）；
NP_251989.1 ：铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）
图 3 莱茵衣藻 crACS 与其他物种的 ACS 比对的部分结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9122
2.3 YB525转化子的鉴定
YPES2、YPACS 基因组 PCR 结果（图 5）显示，
分别得到约 160 bp 和约 2 000 bp 的基因片段，测序
结果表明 PCR 结果与 cracs 序列完全一致。
因后可恢复生长。YPES2、YPACS 在 YB525 中的功
能验证结果（图 6）显示，YPACS 在含有 C14∶0 和
C16∶1 的功能分析培养基上生长良好，而 YPES2
在所有的功能分析培养基中基本不生长，表明 cracs
转入后成功互补了 YB525 ACS 基因的缺陷。此外，
YPACS 在含有 C12∶0、C16∶0 或 C18∶0 的功能分
析培养基中都不能正常生长，说明 crACS 具有底物
BnACS CAA64327.1
AtLACS4 AAM28871.1
AtLACS5 AAM28872.1
AtLACS3 AAM28870.1
AtLACS2 AAM28869.1
AtLACS1 AAM28868.1
CrACS
AtLACS6 AAM28873.1
AtLACS7 AAM28874.1
RnACS5 BAA33581.1
PtLACS5 AGZ03886.1
TpLACS XP_002293417.1
ScFAA1 NP_014962.3
ScFAA4 NP_013974.1
PtLACS1 AGZ03882.1
AtLACS8 AAM28875.1
AtLACS9 AAM28876.1
HsLACS3 NP_004448.2
RnACS BAA22195.1
PtLACS3 AGZ03884.1
PaLACS NP_251989.1
ScVLACS AAC17118.1
HsVLACS NP_003636.2
100
100
100
94
99
100
100
100
84
70
99
100
50
100
100
100
98
99
99
100
100
0.2
所有的蛋白序列都来自 NCBI ：RnACS BAA22195.1，RnACS5 BAA33581.1 ：褐家鼠（Rattus norvegicus）；PtLACS1 AGZ03882.1，
PtLACS3 AGZ03884.1，PtLACS5 AGZ03886.1 ：三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）；TpLACS XP_002293417.1 ：假微型海
链藻（Thalassiosira pseudonana）；AtLACS1-9 AAM28868.1-AAM28876.1 ：拟南芥（Arabidopsis thaliana）；BnACS CAA64327.1 ：
甘蓝型油菜（Brassica napus）；ScFAA1 NP_014962.3，ScFAA4 NP_013974.1 ：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；ScVLACS
AAC17118.1 ：酿 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae）；HsVLACS NP_003636.2，HsLACS3 NP_004448.2 ：人（Homo sapiens）；
PaLACS NP_251989.1 ：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
图 4 莱茵衣藻 CC849 crACS 与其他 8 个物种 22 条 ACS 的进化树
2000
bp
1 2 M
100
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：YPACS ；2 ：YPES2
图 5 YB525 转化子 YPES2 和 YPACS 的鉴定
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
YPES2
YPACS
O
D
60
0
C12䍊0 C14䍊0 C16䍊0 C18䍊0C16䍊1
脂肪酸（100 μmol/L）
图 6 培养 10 d YPES2 和 YPACS 的生长状况
2.4 莱茵衣藻crACS功能验证
YB525 是 ACS 基因部分缺失的酵母，不能以脂
肪酸为唯一碳源生长，转入具有 ACS 功能的外源基
2015,31(9) 123宋燕子等：莱茵衣藻酰基辅酶 A合成酶 cDNA 克隆及其酵母表达
偏好性。因此，莱茵衣藻 crACS 具有酰基辅酶 A 合
成酶活性。
3 讨论
ACS 广泛存在于真核和原核生物中，并在脂肪
酸代谢过程中起重要作用，越来越多的研究表明，
ACS 与脂肪酸碳链延长、三脂酰甘油合成和脂肪酸
β-氧化降解等途径紧密相关［5，12］。目前一些高等植
物、细菌和微藻的 LACS 家族基因已经被克隆和分
析［13-16］，其中油菜 LACS 参与油脂的合成，铜绿假
单胞菌 LACS 可以催化长链脂肪酸且参与脂肪酸 β-
氧化反应，假微型海链藻 LACS 与 DHA、EPA 的代
谢关系密切。因此，克隆莱茵衣藻 cracs 及分析其编
码蛋白的功能，有助于了解莱茵衣藻脂肪酸和油脂
代谢调控机制。
莱茵衣藻 crACS 进化树比对发现，crACS 与拟
南芥 AtLACS1-5 在同一个进化分枝，而与 AtLACS6
-7 处于临近分枝。拟南芥的 LACS 家族成员各具
不 同 的 功 能， 其 中 AtLACS1-3 不 仅 能 利 用 酵 母
的脂肪酸还具有脂肪酸转运蛋白酶的功能［11，17］。
Faldua［18］进一步研究表明 AtLACS6 和 AtLACS7 编
码的过氧化酶体 ACS 蛋白参与脂肪酸 β-氧化。因此，
可推测 crACS 参与脂肪酸的合成途径。进化树还显
示 crACS 与进化树中所有的长链 ACS 分布于一个大
分枝，与进化树中两个超长链 ACS（AAC17118.1/
NP_003636.2）亲缘关系较远，因此认为 crACS 不是
超长链酰基辅酶 A 合成酶。
微 拟 球 藻 的 LACS NOLACS 偏 好 C14∶0、
C16∶0、C18∶0 等脂肪酸底物，且优先利用长链脂
肪酸［9］。YPES2 和 YPACS 的生长状况所示的研究
结果与此相似，crACS 偏好利用 C16∶1、C14∶0 等
长链脂肪酸作为底物，这些长链脂肪酸是莱茵衣藻
脂肪酸的主要成分，说明 crACS 可能活化莱茵衣藻
中的长链脂肪酸并参与其代谢反应。一般同一个物
种中存在多个 ACS，如拟南芥［11］和三角褐指藻［19］
中分别分离鉴定了 9 个和 5 个 ACS。目前本研究仅
克隆并初步分析了莱茵衣藻的 1 个 ACS，未来将进
一步研究 crACS 的功能并寻找更多的 crACS 同工酶，
同时将通过基因调控 crACS，研究其对脂肪酸合成
与代谢的影响。
4 结论
本研究运用生物信息学的方法首次从莱茵衣藻
中预测并克隆一个酰基辅酶 A 合成酶的 cDNA 序列，
酵母表达实验证实该基因能互补缺陷型酵母 YB525，
具有酰基辅酶 A 合成酶的活性，能活化外源脂肪酸。
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（责任编辑 马鑫）