全 文 ：城物杖术通报
研 究 报告 刀云口2万日阴W 双刀 G Y B U L L E 刀万 2 X )9 年 增 刊
红恺木内生菌的分离和培养研究
吕梅 曹鹏 高彩云 方炎明
(南京林业大学森林资源与环境学院 ,南京 21 0 37 )
摘 要: 以红艳木等四种植物的 3 株根瘤内生菌为研究材料 ,主要分离 培养和观察了其菌丝 泡众和抱子众形态结
构分离的这些菌株分别来自红艳木 四川艳木 江南艳木和杨梅根瘤
关妞词: 红艳木 内生菌 分离 培养
Iso la ti o n a n d C u ltru e o f N o d u le E n d oP h y te s fr o m A 加us ru b ra
Lv m ei C ao P eng G ao C 七y u n F an g Y anu n g
了肠止花梦 of Fo re st R esourc e: 朗d En.ironme 形, 刀运杯ing Fo re s勺 乙恤动ers勿, 刀呵吨 210037)
A b阁 ra ot : 33 endo Phyt e st右ns (几粗止抽), 肋m 月IOus ru 如 (LH o l一LH o s), A .
(N L0() 卜N L(X) 6 , zP 卜ZP7) 翻d M 州ca ru 如 (ZY 卜Z Y S) , w er e de 血 俪 th in thi stu 御,
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K e y W o rd : 月如us ru bra E n doph yt es 150助 on C ul tu re
SM 0() 1~S M 0 10), A . tra boeuIO
fo eus ing on 150 颐 o n and eultu re o f end oPh yt e ,
弗兰克氏根瘤放线菌 (肠 nkia )是一类能够诱
导大范围的放线菌根瘤植物 (ac tino th iz al 讨an t) 结
瘤共生固氮的放线菌 20 世纪 80 年代以来 ,人们
开始关注弗兰克氏菌诱发非豆科植物结瘤固氮的
机理 , 19 78 年 , Cal ah am 等 ]首次采用酶消化法 ,从
香蔗木属(肠川ptonia p吧几沼刀na)植物根瘤中分离出具
有侵染结瘤能力的纯培养菌 CPI一l;1982 年 Di em
等I2J 又成功地从木麻黄根瘤中分离出弗兰克氏菌 ,
其他学者相继获得更多的弗兰克氏菌纯培养 为了
了解红恺木的的固氮机理 , 探讨接种放线菌技术 ,
本文收集了红恺木 恺木 江南恺木和杨梅的根瘤 ,
对其进行分离 ,研究内生弗兰克氏菌的形态和生理
特征
1 材料与方法
1.1 材料
根瘤收集主要在 2以拓年 1 月下旬 ,根瘤的来
源地 土壤状况及宿主植物如下 : 菌株 IJ o l-
J o s (5 株 ),来自南京六合试验地红枪木根瘤 ,土
壤 pH S.9; 菌株 N l工旧1一N l刀肠(6 株 ) ,来 自南京林业
大学树木园恺木根瘤 , 土壤 pH 6.85 ; 菌株 SM o l-
SM 01 0 (10 株 ) , 来 自四川名山恺木根瘤 , 土壤
pH6 .7 9; 菌株 zPI 一zP7 (7 株 ) ,来 自浙江磐安江南恺木根瘤 ,土壤 pH S.3; 菌株 zy l一zY S (5 株 ) ,来 自
浙江超山杨梅根瘤 ,土壤 pH 3.92 菌株总数 3
1.2 培养基
内生菌的分离培养主要采用 BA P 培养基 BA P
培养基配方参照 M u 叮 et al .(1954)的方法[, 无氮
BA P 培养液中不含 N H4+CI
1.3 分 离方 法
弗兰克氏菌的分离主要采用根瘤切片法和根
瘤压片法
1.3.1 新鲜幼嫩的根瘤 ,小心除去表面污染物和土
粒 ,尽量不使根瘤表面破损 用解剖刀将大根瘤分
成小的瘤簇或单瓣瘤 ,用自来水洗净
收稿 日期 :2(尤旧一03 一2
基金项 目:国家林业局 94 8 项 目美国材用阔叶树 良种选育及造林技术引进 (20 3一4一o )
作者简介 :吕梅 (197 8一),女 ,汉 , 山东蓬莱人 ,博士生 ,研究方向为发育植物学研究;E 一ha 卜l~ 171 78 卿 ab o .co o .cn
通讯作者:方炎明 ,男 ,教授 ,博士生导师 ,从事发展植物学研究
2(X) 健物杖术通稚刀勿tec hno 城盯 2以拍 年 增 刊
1.3. 2 将洗净根瘤移入灭菌的培养皿中 , 以 70%
酒精浸泡 30 一60 5, 然后 0.1% H邪l:表面灭菌 5一10
m in 后 ,用无菌水冲洗数次
1.3. 3 在灭菌培养皿中 , 小心地去掉根瘤的表皮 ,
用无菌解剖刀将根瘤切成 l一Zlun 大小的薄片 ,用
无菌镊子或解剖刀移人固体培养基中 ;或将灭菌后
的瘤瓣放在灭菌后的载玻片上 ,将瘤瓣压碎 ,滴一
滴无菌水稀释被压挤出来的含菌汁液 ,然后用无菌
吸管转入培养基中
1.3.4 28 暗处培养 ,不定期观察培养基中菌丝体
的生长状况 ,并淘汰污染的分离菌 在菌丝体生长
后 ,挑取菌落至液体培养基中纯化培养
1.4 内生菌的观察
转人新的培养液 ,生长 28d 后 ,采用显微压片
法和扫描电镜法 ,观察菌丝的生长状况
2 结果与分析
2.1 内生菌在 BA P 培养液中生长的形态特征
将 BA P 固体培养基分离出来的单菌落 , 用液
体培养基培养时 ,该菌仍表现出单一形态 ,对各菌
株的观察如表 l 根据菌落在培养液中的着生位置
可分为 :悬浮 贴壁和培养液表面生长三种 ;菌落形
态不尽相同 ,呈大颗粒状 小颗粒状 粉末状 絮状
和块状 ,或两到三种状态并存 颜色也是多样的 ,最
常见的是白色 ,浅黄色 ,黄色和浅粉色(图版 I)
不同的内生菌在生长后期表现出较大的颜色
差异 ,生长前期(0一28d) 菌丝多为白色或无色 ,后期
(28 d 以后 )菌丝多能够产生色素 (图版 I)
状 ; 4 . N 旧1 : 菌落 白色 , 大顺较状 , 贴壁生长或惫浮 ; 5.
Nl丈旧3 :菌落白色妞状 ,悬浮; 6. Nl众M :菌落白色细小顺粒状 ,
悬浮 ;7 .SM以拓:菌落浅粉色片状 ,悬浮 ; 8.SM (X) 8 :菌落浅黄色
片状 ,悬浮; 9. SM 01 0 :菌落浅粉黄色片状 ,悬浮 ; 10 . Z PI :苗
落悬浮在液面 , 形成白色块状 , 在溶液中的菌丝呈粉 色;11.
ZY I: 菌落深黄色 , 在培养液中呈絮状或顺粒状相互联结; 12.
ZY S :菌落呈黄色块状
圈版 !!内生苗在液体培养甚中不同时期的生长状态
1.苗株 N l工旧1 , N l X) 2 , N l众)3 的生长前期.少童菌落悬浮在培养
液表面 ,均为白色; 2 .菌株 Nl(旧1 生长后期 ,菌落呈黄色片状 .
大t 悬浮在培养液表面 ; 3.菌株 N l X) 2 生长后期 ,苗落细小黄
色顺粒状 .大最沉积在培养液下方; 4 .菌株 LH 朋3 生长后期 ,苗
落呈黄色 ,絮状悬浮在培养液中; 5 .菌株 ZPI 生长前期 ,菌落呈
白色团絮状 ,悬浮在培养液中; 6 .菌株 ZPI 生长后期 ,菌落在液
面上形成白色片状 ,相互粘连 .培养液中的菌丝呈粉色
圈版 l 内生蔺在液体培养甚中的生长状态
1.LH o l:菌落白色 ,小顺粒状 ,贴壁生长或悬浮 ;2.LH(X) 3 :菌落
白色粉状 ,悬浮 3. LH(X 拓:菌落 白色 ,相互粘连呈顺粒状或片
2. 2 菌丝的显微观察
菌株在液体培养基中具有菌丝 泡囊和抱子囊
结构 不同来源的菌株形态特征分述如下
2. 2.1 六合试验地红恺木的内生菌丝特征 :出 0 1
菌丝体细丝状 ,有分支 ,直径约 0. 3卜m 左右 泡囊
较少 ,大小与菌丝等径 抱子球形 ,紧密 ,成簇分布
(图版 m 一l) LH o Z 菌丝体相对较短 ,直径约 0一
0. 6卜m 泡囊大量 ,泡囊柄较短 (图版 1卜2) 抱子大
量 ,成簇或散落在菌丝中 (图版 川一3)
LH o 3 菌 丝体菌丝细长 ,分支 ,直径约 0. 2一0. 3卜m
泡囊少 ,泡囊柄不明显 抱子紧密成团分布 (图版
m 一4) LH (X 菌丝体细长 ,分支 ,直径约 0. 2卜m 左
右 泡囊大量 ,泡囊柄不明显 ,未观察到抱子囊结构
(图版 m 一5) LHo s 菌丝体细 ,分支多 ,直径约
0.3卜m 左右 泡囊较少 ,泡囊柄较短 有大量弯曲
分支 有隔 ,杆状的生殖丝 (图版 m 一6)
2以为 年 增刊 吕梅等 :红恺木内生菌的分离和培养研究 20 1
圈版 川 六合试脸地红艳木根摘内生菌的显橄结构
1.示菌株 LH o l 的苗丝 泡囊和抱子;2.示菌株 LH(X) 2 的菌丝
泡续 ;3.示菌株 LH(X) 2 的泡子 ;4.示菌株 LH o 3 的菌丝 泡囊和
抱子;5 .示菌株 LH (X抖 的菌丝 泡囊 ;6.示菌株 LH (X) 5 的生殖丝
2. 2. 2 树木园枪木的内生菌丝特征 :N l工k) 1菌丝体
细长 ,多分支 ,直径约0.3林m 左右 泡囊有柄 (图版
W 一1) 有大的抱子囊群和生殖丝 (图版 W 一2) 生
殖丝多呈梨形 (图版 w 一3) 串珠状 (图版 Iv 一4) 或
杆状 (图版 Iv一5) ,并可产生芽体 (图版 Iv 一5 ,6) 生
殖丝细胞破裂后可产生大量的抱子 (图版 W 一7)
N以刃2 菌株形态与 LH o l相似 (图版 Iv 一8) N l 刃3
菌丝体菌丝细长 , 直径约 0. 4卿 左右 泡囊较少 ,
有大量的散落的抱子和杆状生殖丝 (图版 IV 一9)
2. 2. 3 四川名山恺木的内生菌丝特征 :SM o 3 菌丝
体细长 ,直径约 0. 2一0. 3林m 泡囊有长的泡囊柄或
无 (图版 v一l) 生殖丝杆状或纺锤形 (图版 v一2)
SM仪 菌丝体细长 ,直径约 0.3一0.4卜m 泡囊大量 ,
无明显泡囊柄 (图版 v一3) SM o 6 菌丝体细长 ,弯
曲 ,直径约 0. 3一0.4 林m 泡囊较多 ,有长的柄或无
(图版 v 一4) 生殖丝弯曲 , 有分支 (图版 v 一5)
SM o 7 菌丝体细长 ,直径约 0.2一0.3林m 泡囊较多
具有明显的生殖丝 ,并在生殖丝中间或顶端长有抱
子囊球 (图版 v一6) 抱子囊球涨破夹膜后 ,先形成
球形的抱子囊群 (图版 V一7) ,由基部向上 ,进一步
发育呈火炬形 (图版 v 一8) 抱子囊群中部膨胀 ,呈
纺锤形 (图版VI 一l) ,成熟的抱子囊群可解螺旋 (图
版 VI 一2) , 形成多条串珠状的抱子囊丝 (图版 Vl -
3) SM o s 菌丝体多弯曲 ,分支 ,直径约 0.4 林m 左
右 泡囊较少 具有不规则的抱子囊团 (图版 VI -
4)
SM !X旧菌丝体多弯曲 ,分支 ,直径约 0.4 林m 左右 泡
囊较少 具有大量散落的球形抱子囊 (图版 VI 一5)
SM 01 0 菌丝体多弯曲 ,分支 ,直径约 0.3一0.4林m 泡
囊有柄或无 具有大量散落的球形抱子囊 (图版
V l一6)
圈版IV 树木圈枪木根摘内生菌的显徽结构
1.示曲株 N l刀旧1 的菌丝 泡囊和生殖丝 ;2 .示菌株 Nl丈旧1 的抱子
囊群和生殖丝 ;3 . 示菌株 Nj工心I 的梨形生殖丝 ;4 示菌株 Nl刀旧l
的申珠状生殖丝 ;5 . 示菌株 N L(X )1 产生分支的杆状生殖丝 ;6 .示
菌株 N l刃K) l 产生分支的梨形生殖丝 ;7. 示菌株 N I刀旧l 破裂的抱
子囊和抱子 ;8.示菌株 N l工K)2 的菌丝 泡囊和抱子囊群;9.示菌株
N l X) 3 的菌丝 泡囊和生殖丝
圈版 V 四川名山四川艳木根泊内生苗的显徽结构
1.示菌株 SM o 3 的菌丝 泡囊和生殖丝 ;2 .示菌株 SM o 3 的纺锤
形生殖丝 ;3.示菌株 S M侧抖 的菌丝和泡囊 ;4 .示菌株 SM 以拓 的菌
丝和泡囊 ;5 .示菌株 SM X拓 的生殖丝 ;6 .示菌株 SM o 7 的菌丝
泡囊和产生抱子囊的生殖丝 ;7 .示 菌株 SM o 7 的球形抱 子囊群;
8.示菌株 SM 加7 的火炬形抱子囊群
2. 2. 4 浙江磐安江南枪木的内生菌丝特征 :ZPI 菌
丝较粗 ,串珠状 ,直径约 0.6一0.8林m 有饱子囊群存
在 (图版 vi l一l) zP3 菌丝较粗 , 直径 约 0 .6 ~
0. 8林m ,泡囊较少 ,菌丝中有串珠状的抱子囊 (图版
20 2 吐物杖术吸很刀勿. 加 城盯 2 (X 为 年增 刊
衰 1 内生菌在 BAP 培养液中生长的, 落形态特征及曹丝特点
曹株
N l刀旧l
N U X) 2
N l丈旧3
N 刀M
N l X) 5
N l刀肠
L H (X) 1
LH (X 犯
L H 加 3
LH (X 抖
L H 侧
SM (X) l
SM (X) 2
SM 加 3
S M 以抖
SM (X) 5
SM (X 场
SM (X) 7
SM 叨 8
S M 月洲为
SM 010
ZP 1
Z 力
Z 曰
Z P4
Z 玛
Z 巧
Z 价
ZY 1
Z Y Z
Z Y 3
Z Y 4
Z Y S
生长状况
良好
一般
一般
良好
良好
一般
一般
良好
一般
一般
一般
一般
一般
差
一般
良好
良好
良好
良好
一般
良好
良好
良好
一般
一般
一般
良好
一般
良好
良好
良好
良好
良好
菌落形态
顺粒状
絮状顺粒
絮状
架状顺粒
顺粒状
架状顺粒
膜状
顺粒状
膜状
絮状顺较
翔状获较
膜状
奴状
膜状
絮状顺粒
腆状
腆状
架状顺粒
絮状顺较
架状倾较
絮状顺较
腆状
膜状
翔状顺较
腆状
腆状
硕粒状
腆状
膜状
腆状
板粒状
腆状
获粒状
菌落颜色
浅白 ,浅粉 ,黄色
浅白色
浅白 ,浅粉 ,黄色
浅白色
浅白色
浅白色
浅白色
浅白色
黄色
浅白色
浅白色
浅白色
浅 白色
浅 白色
浅 白色
浅 白色
浅粉色
黄色
粉 黄色
浅白色
祖黄色
浅粉色
浅粉色
浅粉色
浅白色
浅白色
浅白色
浅白色
浅 白,黄色
浅粉色
浅白色
浅粉色
黄色
若位
a ,b ,d
d
a , b ,d
泡囊
少t
中等
中等
a ,d
抱囊
少t
少t
少t
大t
少t
少t
大t
大t
少t
d
b ,d
b ,d
b ,d
b ,e
d
b
b
d
d
a ,d
d
b ,e ,d
未观察到
少t
有
少 t
未观察到
大 t
有
大 t
少 t
少 t
大 t
少 t
大 t
大 t
大t
矢t
大t
大t
大t
大t
未观察到
大t
未观察到
中等
未观察到
少t
少t
少t
未观察到
少t
大t
少 t
大t
大 t
大t
大 t
大t
大t
大t
有
有
大 l
未观察到
少 t
未观察到
中等
中等
未观察到
未观察到
少t
中等
中等
少t
大t
生殖菌丝
大t
未观察到
少 t
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
未观寮到
未观察到
未观察到
未观察到
少t
未观察到
未观察到
有
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
未观察到
中等
大 t
未观察到
大t
未观察到
注 :菌株在培养液中的着位状况:a :贴培养瓶底部 ;b :悬浮;c :附着在培养瓶壁上;d :在培养液表面生长
Vl l一2) zP4 菌丝较粗 ,有分支 ,直径约0.6一0.8阿
菌丝中有膨大的球形抱子囊 有不规则的抱子囊群
(图版 vi 卜3) 2肠 菌丝较粗 ,直径约 0.6一0. 8卜m ,
有大t 串珠状的抱子囊 (图版 VI 卜4)
2. 2. 5 浙江超山杨梅的内生菌丝特征 :ZY I 菌丝较
粗 ,呈杆状或串珠状 ,有分支 ,直径约 0. 6一0.8卜m
(图版 Vl l一5) ZY Z 菌丝较粗 ,串珠状 ,直径约 0.6-
0. 8卜m (图版 V ll一6) ZY 3 菌丝较粗 ,直径约 0. 6-
0.8卿 ,能产生火炬形抱子囊 (图版 vl l一7) zY4 菌
丝较粗 ,串珠状 ,有分支 ,直径约 0.6一0.8卜m (图版
V ll一8)
3 小结与讨论
2O( 为 年 增 刊 吕梅等 :红枪木内生菌的分离和培养研究 20 3
6 .示菌株 ZY Z 的串珠状菌丝;7.示菌株 ZY 3 的火炬形抱子囊群;
8.示菌株ZY4 的申珠状菌丝
圈版VI 四川名山恺木根. 内生蔺的显徽结构
1.示菌株 SM (X) 7 中部膨大的抱子囊群 ;2.示菌株 SM (X 刀解螺旋
的抱子囊群 ;3 .示菌株 SM (X) 7 成熟 的抱子囊群 ;4 .示菌株 SM (X) 8
的菌丝 泡囊和性状不规则的抱子囊群;5. 示菌株 SM IX为 的菌
丝 泡囊和散落的抱子囊 ;6 .示菌株 SM o lo 的菌丝和泡囊
许多研究者通过多种培养基培养出大量的弗
兰克氏菌 ,到目前为止国际上已报道的放线菌结瘤
植物总数达 7 目 8 科 24 属 279 种 ,而且随着研
究的进展不断有新种发现Il 本研究发现 ,不同内
生菌的生长状况和显微结构差异较大 同一根瘤
内可分离出不止一株内生菌 ,但从来自同一地点 ,
同一宿主的根瘤中分离到的不同菌株 ,生长状况和
显微结构相近
本试验采用压片法 ,不仅可很好地避免由于灭
菌不彻底造成地污染 ,而且可以排除根瘤表面的其
它放线菌菌株 试验中 ,利用 BA P 培养基共分离
得到 3 株来自不同宿主的根瘤内生菌 ,而且分离
出的内生菌多数能够在 BA P 液体培养基中很好的
生长 因此 , BA P 培养基适合多种根瘤内生菌的分
离和培养15, 61
圈版 vl l浙江磐安江南恺木和超山杨梅根右内
生蔺的超徽结构
1.示菌株 ZP I 串珠状菌丝和抱子囊群 ;2 .示菌株 ZP3 产生抱子龚
的粗壮菌丝;3. 示菌裸 ZP4 产生抱子囊的粗壮菌丝 ;4. 示菌株
Z P6 产生抱子囊的粗壮菌丝 ;5 .示菌株 Z Y I 的串珠状 杆状菌丝 ;
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