全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-10
基金项目:国家高技术研究与发展计划863项目(2006AA10Z413)
作者简介:宋琴(1981-),女,硕士研究生,研究方向:环境生物技术;E-mail:song_qin@163.com
通讯作者:许雷,研究员,Tel:010-68919695,E-mail:xuleimgd@yahoo.com.cn
水体的氮污染不仅可以引起水体富营养化,还
可直接影响动物及人体的健康,所以脱氮成了污水
处理过程中的一个重要环节。传统生物脱氮包括好
氧硝化和缺氧反硝化两个过程,分别由硝化菌和反
硝化菌作用完成。一般认为,硝化菌是化能自养型
微生物,由于其自身存在着许多难以解决的缺点,
限制了其大规模的普及应用。随着近年来异养硝化
菌的发现,其在脱氮方面的一些特性引起了人们的
关注。许多异养硝化菌也是好氧反硝化菌,这使得
同时硝化反硝化得以实现。这为脱氮新方法的研究
提供了新的思路。
1 异养硝化作用的发现
异养硝化现象早在 19世纪末和 20世纪初,就
在土壤的硝化过程中被发现[1],但有关这方面的报
道一直较少。这主要是因为硝化作用通常是通过测
定其氧化产物(硝酸盐和亚硝酸盐)来确定,而异养
硝化很少积累这类产物。所以长期以来,人们总认
为自然界的硝化过程基本上由自养硝化菌完成的,
异养硝化在硝化过程中的重要性不大。
在 Quastel和 Scholefield[2,3]以丙酮酸肟作为选
择性培养基,采用连续灌注土柱的方法分离获得具
有产生 NO2-能力(不经过氨化)的异养菌株以来,异
养硝化微生物和异养硝化作用重新引起研究者们
的广泛关注。同时,由于异养硝化菌在生物脱氮中
特有的优势,自 20世纪 80年代以来,国内外许多
生物科学家先后投入了对它的研究。
与自养微生物不同,异养微生物除了可以氧化
铵、羟胺和亚硝酸盐以外还可以利用很多有机氮化
合物:如肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等[4]。从现有
的研究来看,异养硝化微生物的硝化途径、机理可
能与自养硝化细菌不同,它们可在氧化过程中形成
多种无机和有机氮化合物[5,6],包括一些气态氮产
物如氧化亚氮等[7]。有些异养硝化菌如粪产碱菌
(Alcaligenessp.)可以氧化羟胺生成亚硝酸盐同时
在合适的条件下还可以合成完整的反硝化酶系进
行反硝化作用[8]。异养硝化、好气反硝化的同时存
在被认为是异养硝化微生物硝化作用产物(NO2-和
NO3-)积累量偏低的原因。
异养硝化作用酶学研究进展
宋琴 许雷
(中国农业科学院研究生院,北京 100081)
摘 要: 对异养硝化作用作了简单的概述,着重从异养硝化作用和好氧反硝化作用的偶联机理、其中涉及的关键
酶和相关基因几方面综述了异养硝化作用的研究进展,最后还提出了研究展望。
关键词: 异养硝化 酶学 机理 氨单加氧酶 羟胺氧化酶
AdvancementofEnzymologyofHeterotrophicNitrification
SongQin XuLei
(GraduateSchoolofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081)
Abstract: Inthisoverview,heterotrophicnitrificationwaspresentedbriefly.Studiesonheterotrophicnitrification
whichfocusedonmechanism ofheterotrophicnitrificationcoupledwithaerobicdenitrification,enzymesandfunctional
genesofheterotrophicnitrification,weremainlyreviewed.Intheend,researchprospectswerealsoproposed.
Keywords: Heterotropicnitrification Enzymology Mechanism Ammoniamonooxygenase Hydroxylamineoxidase
2008年第5期
由于异养硝化菌种类繁多,并且其可以利用的
基质范围广泛,这使得异养硝化机理的研究异常困
难。因此,异养硝化作用的代谢途径还不完全清楚,
许多研究者提出了不同的假想途径。
2 异养硝化与好氧反硝化的偶联机理
在 Robertson等于 1985年发现了具有异养硝
化和好氧反硝化能力的异养硝化菌 T.pantotropha
后,陆续有报道发现类似的异养硝化菌,对它们的
脱氮能力也展开了研究。
1988年 Robertson等[9]就提出了好氧反硝化和
异养硝化的工作模型(图 1),认为好氧反硝化菌能
够同时进行好氧反硝化及异养硝化,这过程中产生
的过剩还原力,被用于聚 β羟基丁酸合成。
Richardson等[10]在对这类异养硝化菌进行深入
研究后,提出了较为详细的脱氮假想途径(图 2),
认为硝化作用和反硝化作用的结合点在亚硝酸盐
水平,在能同时进行硝化作用和反硝化作用的细菌
中有 3类关键酶参与了亚硝酸盐的形成,它们分别
是 NAP、AMO和 HAO。他们还认为异养硝化菌利
用氨单加氧酶(AMO)将氨氮氧化为羟氨,而羟氨又
在异养硝化菌特有的不含血红素的羟氨氧化酶
(HAO)的作用下转化为亚硝酸盐或 N2O。具体在好
氧情况下,异养的 HAO可将羟氨转化为亚硝酸盐
及少量 N2O;在厌氧或微好氧情况下将羟氨转化为
N2O。
Wehrfritz[11]又于 1993年提了提出一种硝化和
反硝化偶联机理的模型(图 3),认为电子首先从泛
醇通过 AMO和 HAO传到细胞色素 C551,细胞色素
C551被还原同时产生亚硝酸盐。接着利用羟氨氧化
产生的电子亚硝酸盐被继续还原成 NO,N2O和 N2。
3 异养硝化作用的关键酶
3.1 氨单加氧酶(Ammoniamonooxygenase,AMO)
与自养硝化细菌氨单加氧酶不同,异养硝化细
菌氨单加氧酶在细胞提取液中比较稳定。Moir等[12]
从脱氮副球菌 Pd1222中获得了部分纯化的氨单加
氧酶。以 NADH、硫辛酰胺脱氢酶以及四甲基对苯
醌为电子受体,监测细胞悬液或细胞提取液依赖于
胺的氧消耗速率的方法来确定氨单加氧酶酶活。
纯化的酶含有 2个亚基,大小分别是 38kD和
46kD,与欧洲亚硝化单胞菌(自养硝化菌)的 AmoA
和 AmoB相似,与产甲烷菌 Methylococcuscapsulatus
的 PmoA和 PmoB同源。该酶是一种醌醇氧化酶,在
10mMTris-HCl(pH8.0)中透析 24h失活,加入如
100μMCuCl2的加入可恢复酶的活性。1mM二乙基
二硫代氨基(diethyldithiocarbamate)或 0.5mM烯丙
基硫脲(alylthiourea)的加入都可以完全抑制酶活,
普通实验室光照 1h以上也能使酶失活。与欧洲亚
硝化单胞菌不同,1mmol/L的乙炔并不能抑制 Parac
occusdenitrificans中该酶的活性,这可能是由于乙
图 1 好氧反硝化和异养硝化的工作模型
图 2 硝化作用与好氧反硝化作用偶联图
图 3 异养硝化-好氧反硝化偶联机理模型
宋琴等:异养硝化作用酶学研究进展 61
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
炔不能进入该酶的活性位点。因此,乙炔有可能被
用于区分环境中异养硝化菌和自养硝化菌。
因菌株的不同,异养硝化细菌的 amo基因存在
很大的差别。如恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的
amo基因和自养硝化细菌:欧洲亚硝化单胞菌(N.
europaea)的 amoA存在明显的序列相似性[13];而脱
氮副球菌Pd1222(ParacoccusdenitrificansPd1222)与
自养硝化细菌又存在较大差异[14]。
Paracoccusdenitrificans的 amo基因已经在 Pseu
domonasputida和 Methylobacteriumextorquens中成
功表达。amo基因在 M.extorquens中表达使该菌能
利用甲烷生长并且合成大量内膜以适应 amo基因
的过量表达,在 Ps.Putida中表达未引起细胞结构
变化,但对它们的生长均产生了毒害作用。在 M.
extorquens中光培养或以谷氨酸盐代替铵盐作为氮
源可以明显减轻 amo对细胞的毒害,表明是 amo的
活性对细胞产生了毒害,然而在 Ps.Putida中光照
只能微弱地减轻毒害,表明在 Ps.Putida中是 amo
基因的表达而非其活性对细胞产生了毒害作用[14]。
3.2 羟胺氧化酶(Hydroxylamineoxidase,HAO;也
称羟胺-细胞色素 C还原酶,Hydroxylamine-
Cytochromecreductase)
目前,研究者已经分别从球形节杆菌(Arthroba
cterglobiformis)、脱氮副球菌 GB1(Paracoccusdenit
rificansGB17)即泛养硫球菌 LMD82(Thiosphaera
pantotrophaLMD82)[11,15]、假单胞 菌(Pseudomonas
sp.)[16]、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)中获得了部
分纯化的羟胺氧化酶,从现有的研究来看,它们与
自养硝化细菌的羟胺氧化酶存在明显或部分不同
的特点。
3.2.1 异养硝化细菌的 HAO结构想对简单,只是
一个单体蛋白,并且不含血红素。对 Paracoccus
denitrificans的研究显示该类酶每个分子含有 3~5
个铁离子,酶的羟胺氧化活性可明显被 Fe(I)或
Fe(II)激活而被 EDTA抑制,说明该类酶含有易变
铁离子并且其对维持酶活是必需的。有研究者认为
可能非血红素 Fe的羟胺氧化酶在异养硝化细菌中
广泛分布[15]。
3.2.2 可能与自养硝化细菌 HAO的蛋白序列无序
列同源性。
3.2.3 在好氧情况下,异养的 HAO可将羟胺转化
为亚硝酸盐及少量 N2O;在厌氧或微好氧情况下可
将羟胺转化为 N2O。这说明异养的 HAO催化羟胺
转化为亚硝酸盐需要 O2,而自养硝化细菌 HAO催
化羟胺形成亚硝酸盐不需要 O2。
3.2.4 假单胞菌和脱氮副球菌或泛养硫球菌 HAO
的产物为硝酰化合物,亚硝酸盐产生需要与 O2反
应,每分子羟胺的氧化产生 2个电子,可以用于所
产生的亚硝酸盐的还原。该过程用于驱除细胞内多
余的还原力并不产生能量,同时也偶联了硝化过程
和发硝化过程。而欧洲亚硝化单胞菌,每分子羟胺
的氧化生成 4个电子,这 4个电子中的 2个用于还
原辅酶 Q,另 2个必须用于还原细胞色素 C554,以生
成 ATP和 NADH[11]。
4 结语
异养硝化与自养硝化相比,由于其在生物脱氮
过程中特有的优势,已日益成为国内外研究者研究
的热点,国内外学者也不断有对该类微生物的培养
筛选和机理方面的报道。但是从已有的研究结果
看,由于硝化微生物菌株不同或是培养条件的不
同,其脱氮机理和酶学特征等都有较大的差异,这
在很大程度上使得对该类菌的研究相对失去了借
鉴性,增加了研究的难度。
目前国内对异养硝化微生物的研究很多还只
停留在菌种的分离、纯化和生理生化特性研究,很
少涉及到深入的机理及分子方面的研究。所以对该
类菌的基因工程改造以及最后投入应用还有待进
一步研究。
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