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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
狂犬疫苗单克隆抗体制备过程中细胞融合条件的探索
李云霞 1  司静 1, 2  李煜1
( 1内蒙古大学 哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室, 呼和浩特 010021;
2北京林业大学微生物研究所,北京 100083)
  摘  要:  在充分了解 SP2 /0细胞系的生长、增殖和遗传特性后,以聚乙二醇 ( PEG )诱导动物细胞融合为契机, 意在探索
不同分子量、不同浓度的 PEG作融合剂对诱导 SP2 /0细胞与脾细胞融合的最适条件,在 HAT选择培养基下通过细胞融合率
的变化进行比较。结果表明,分子量为 4 000, 浓度为 50%的 PEG诱导的细胞融合率最高,为下一步制备狂犬病毒疫苗单克隆
抗体奠定基础。
关键词:  SP2 /0细胞  生长曲线  染色体计数  PEG 细胞融合  HAT选择培养基  融合率
A Study on the Fusion Frequency in the Process of Preparation and
Application onM onoclonal Antibodies AgainstRabiesV irus
L iYunx ia
1  S i J ing1, 2  L iYu1
(
1
K ey Laboratory of M inistry of Education of China forM ammal Rep roductive B iology and Biotechno logy of
InnerM ongolia University, H uhho t 010021;
2
Institute of M icrobiology, Beijing Forestry University, Beij ing 100083)
  Abstrac:t  Based on a com prehensiv e understanding o f the property of the grow th, pro life ra tion and genetic character istics of
SP2 /0 cell line, an im al ce ll fusion m ethod w as per fo rm ed to exp lo re the optim a l condition fo r the fus ion be tw een SP2 /0 cell and
spleen cells unde r d iffe rentm o lecularw e ight and g rad ient of PEG as fusion agent. The com pa rison w as carried out by the va riation of
the cell fusion in HAT se lection m ed ium. The conc lusion indicated that the ce ll fusion y ie ld w as much h igherw hen the concentra tion
o f PEG w as 50% and the m o lecu lar w e ight wa s 4 000, wh ich prov ides a basis fo r the prepa ra tion o f m onoc lona l antibodies in next
step.
Key words:  SP2 /0 cell G row th curve Chrom osome count PEG Cell fusion HAT selective culturem edium  Fusion frequency
收稿日期: 2010
04
30
基金项目:国家自然科学基金 ( 30460054 ),国家基础科学人才培养基金 ( J0730648)
作者简介:李云霞,女,硕士研究生,研究方向:动物细胞工程; E
m ai:l liyunx ia831130@ 163 com
通讯作者:李煜,男,博士,教授,硕士生导师,研究方向:动物细胞工程; E
m ai:l liyu _cn@ hotm ai.l com
细胞融合现象最初在动物细胞中发现 [ 1]。
1974年, M ichal Luk发现高效融合剂 PEG, 使不同
科属原生质体之间都可以融合, 融合率可达 30%
以上 [ 2]。为了发挥 PEG促进细胞融合的效力, 必
须采用较高的浓度 ( 40% - 50%, M r= 4 000) , 但
高浓度可导致细胞因脱水而受到破坏。因此, 选
择合适的分子量、浓度等是 PEG融合技术的关键。
PEG诱导细胞融合由于具多种优点, 大量的研究
仍采用此法 [ 3- 9]。同时, 细胞融合在很多方面得
以应用 [ 10- 16] , 尤其是使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞
融合形成杂交瘤细胞作为生产单克隆抗体等, 具
有广阔的应用前景。此外, F ie ld[ 17, 18]于 1964年首
先发现的 HAT选择培养基可使缺陷型亲本细胞无
法生存, 只有融合以后的杂种细胞才能生长,可以
有效筛选。
本试验在充分了解小鼠骨髓瘤细胞 SP2 /0后,
以 PEG诱导动物细胞融合为契机, 意在探索不同分
子量 (M r= 2 000、4 000、6 000和 8 000)、不同浓度
( 45%、50%、55%和 60% )的 PEG作融合剂对诱导
SP2 /0细胞与脾细胞融合的最适条件, 在 HAT选择
培养基下筛选杂交瘤细胞, 从而为下一步制备狂犬
疫苗单克隆抗体奠定基础。
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
1 材料与方法
11 材料
8周龄, 雌性 Ba lb /c小鼠由中国医学科学院血
液病研究所提供;小鼠骨髓瘤细胞 SP2 /0由内大细
胞工程实验室传代保存;次黄嘌呤 (Hypoxan th ine)、
氨基喋呤 (Am inopterin)、胸腺嘧啶核苷 ( Thym idine)
购自 S igma公司、秋水仙素、HEPES均购自 S igma公
司;聚乙二醇 (M r= 2 000、4 000、6 000和 8 000)购
自 Merck公司; DMEM ( h igh g lucose)购自 G ibco公
司;胎牛血清和新生牛血清购自杭州四季青公司; 96
孔培养板购自 Corn ing公司。
12 SP2 /0细胞的生物学特性分析
121 SP2 /0细胞生长曲线的测定  取生长状态良
好的细胞,采用一般传代方法, 制成细胞悬液; 在 24
孔培养板内准确接种相同数量的细胞。常用接种浓
度: 1 104 - 1 105细胞 /mL; 每天取 3个孔计数, 用
04%台盼蓝染液等体积染色 5 m in后作活细胞计
数,测出每孔中的细胞总数 (未被染色的细胞 ) ,求出
每组平均值,持续计数 7 d;绘制生长曲线。
122 SP2 /0细胞核型的制备  选择生长浓度较高
的 SP2 /0细胞, 加入秋水仙素 70
L, 使终浓度为
005- 01
g /mL,置于 37! , 5% CO2的培养箱内继
续培养 4 - 6 h; 后将培养瓶内的细胞吹打均匀,
1 000 r/m in离心 5m in,弃上清 (内含秋水仙素 );加
入 37! 预热的 03% KC l低渗溶液 5mL, 37! 处理 30-
50m in;加 2mL固定液,室温置 5 m in, 1 000 r /m in离
心 5 m in, 弃上清。加固定液 5 mL, 室温置 10m in,
1 000 r/m in离心 5m in,弃上清;加少量固定液 (视细胞
数目而定 )制成悬液, 取 2滴滴片 (载片预先冷处理 ),
放 37! 温箱干燥;干燥过程中取 1份 G iemsa干液、9份
pH72的 PBS,混匀 (现用现配 )备用,采取扣染法,染色
10m in(勿使染色液干燥 );流水洗去染色液;将载片自
然干燥或鼓风干燥箱内 37! 烘干;在显微镜下观察染
色体形态并照相,计算出平均染色体数目。
13 PEG诱导 SP2 /0细胞与脾细胞融合的条件
探索
131 饲养细胞和脾细胞的制备  将 Balb / c小鼠
脊椎脱臼处死,浸泡于 75%酒精内 5 m in,置超净工
作台无菌平皿内;剪开腹部皮肤并分离;用无菌注射
器吸取适量 HAT培养基注入小鼠腹腔, 轻轻震动小
鼠腹壁,并反复抽吸, 令腹腔细胞充分进入培养液;
用注射器抽出腹腔内液体,移入 15mL离心管中,进
行细胞计数;调整 HAT培养基体积, 使细胞浓度在
10
5个 /mL左右,分装到 96孔细胞培养板, 100
L /
孔, 置于 37! , 5% CO2的培养箱内培养; 18- 24 h后
观察细胞生长状态。除脂肪及结缔组织,无菌取出
小鼠脾脏,放入盛有 5- 10 mL DMEM培养液的平
皿中,轻轻漂洗;将脾脏移入另一盛有 10 mL DMEM
培养液 (未加血清 )并放置有铜网的平皿中,用灭菌
的注射器活塞研磨脾脏,使脾脏内的细胞释放出来,
移入 15mL离心管内, 1 000 r /m in离心 5 m in,弃上
清, 重悬稀释计数备用。
132 HAT选择培养基条件下 SP2 /0细胞、脾细胞、
饲养细胞生长曲线的测定  将一定密度 HAT选择培
养基下的 SP2 /0细胞、脾细胞、饲养细胞悬液接种到 96
孔培养板中,每孔接种相同数量的细胞;每天取 3孔计
数;求出每组平均值,持续计数 7 d;绘制生长曲线。
133 融合方法  称量 PEG (M r= 2 000、4 000、
6 000和 8 000) 09、10、11和 12 g置于青霉素瓶
内, 封口。放入恒温水浴锅 67! , 待溶解后分别加
入 DMEM 培养液 (未加血清 ) 11、10、09和
08 mL,混匀,使 PEG (共 20 mL)终浓度为 45%、
50%、55% 和 60%。最后用 75% N aHCO 3调至
pH 76- 78, 过滤除菌, 封口备用; 将处于对数生长
期的 SP2 /0骨髓瘤细胞计数, 用 04%台盼蓝染液
等体积染色 5m in,计数细胞悬液中的活细胞 (未被
染色的细胞 ); 取 1 105个 /mL与 5 105个 /mL脾
细胞充分混合, 1 600 r/m in离心 6 m in; 吸出上清液
弃掉,尽量弃干净,以免加入的 PEG被稀释。用手
指轻轻弹击管底, 使沉淀细胞松散均匀成糊状。以
下在 37! 水浴中操作: 一手均匀转动融合管, 另一
手吸取上述配好的 PEG融合剂 10mL,沿转动的融
合管壁缓缓加入,控制在 1 m in内加完; 加入 15 mL
10%血清的 DMEM 培养液终止 PEG (M r= 2 000、
4 000、6 000和 8 000)的作用, 第 1分钟缓缓加入
1mL DMEM液,第 2分钟加入 4mL DMEM液,然后
在 3m in内加入 10 mL DMEM液; 1 600 r/m in离心
6m in,弃上清, 加入适量的 HAT培养基轻轻吹吸;
将细胞悬液加入有饲养细胞的 96孔培养板中,
100
L /孔,置于 37! , 5% CO 2的培养箱内培养; 每
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2010年第 12期 李云霞等:狂犬疫苗单克隆抗体制备过程中细胞融合条件的探索
天记录细胞生长情况。
融合率 = ( 96孔细胞培养板中孔内融合细胞克
隆总数 /所融合的 SP2 /0细胞总数 ) 100%
134 观察培养  融合后第 3天,每孔补加 50-
100
L HAT培养基。前 4 d尽量不要移动; 第 5天
换液, 同时仔细观察细胞生长状况, 若有污染, 立即
弃掉其及周围孔内液体, 滴加 2 mo l/L N aOH
100
L,以免污染扩散, 如果细胞生长太慢可补加
50- 100
L 饲养细胞; 第 7天补加 HAT 培养基
100
L;第 10天在原孔内补加 100
L HAT 培养
基;第 14天检板, 改换 HT培养基继续培养。
135 杂交瘤细胞核型的制备  将一些长势良好的
杂交瘤细胞从 96孔细胞培养板中吸出, PBS冲洗, 移
入离心管中, 1 000 r/m in离心 5m in,弃上清。加入一
定量的 HT培养基 (视细胞数量而定 ), 混匀制成悬
液,移入细胞培养瓶中,置于 37! , 5% CO2的培养箱
内培养 1- 2 d;以下与制备 SP2/0染色体步骤相同。
2 结果
21 SP2 /0细胞的生长曲线
SP2 /0细胞生长曲线为典型的 ∀ S#形。刚接种
呈现一段适应期,接种后第 3天开始进入对数生长
期,第 6天开始保持生长稳定, 最后进入衰老期。
SP2 /0细胞倍增时间为 24 h。生长曲线测定值见表
1、生长曲线见图 1。
表 1 接种 7 d内的细胞密度变化
天数 ( d) 0 1 2 3 4 5 6
细胞密度 ( 104 /mL ) 10 18 39 91 140 165 157
图 1 SP2 /0细胞生长曲线
22 SP2 /0细胞的核型
显微镜下对其中 25个中期分裂相的染色体进
行计数。染色体数目为 34- 65,染色体主要分布在
46- 52之间 ( 64% )。染色体见图 2、染色体众数分
析见表 2。
图 2 SP2/0细胞染色体 ( 400 )
表 2 染色体众数分析
染色体数目 34 37 40 43 44 46 47 48 49 50 51 52 54 57 62 65
融合细胞 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 2 2 1 1 1 1
23 HAT选择培养基条件下 SP2 /0细胞、脾细胞
和饲养细胞的生长曲线
在 HAT 选择培养基条件下, 接种 7 d后
SP2 /0细胞基本死亡, 11 d后脾细胞和饲养细
胞基本死亡。生长曲线测定值见表 3、生长曲线
见图 3。
表 3 接种 11 d内的细胞密度变化
天数 ( d) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
SP2 /0细胞密度 ( 104 /mL) 126 78 48 42 8 2 05 0
脾细胞密度 ( 104 /mL) 372 178 125 64 41 34 18 9 5 3 0
饲养细胞密度 ( 104 /mL) 196 99 48 23 10 8 6 3 09 05 0
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
图 3 HAT选择培养液条件下 SP2 /0细胞、
脾细胞和饲养细胞的生长曲线
24 融合细胞形态
融合细胞形态如图 4所示, 在倒置相差荧光显
微镜下观察,融合细胞逐渐形成均匀、透亮的一个克
隆,形态饱满,呈良好生长趋势。
25 细胞融合计数结果与分析
依照公式计算得到分子量为 4 000, 浓度为
50% 的 PEG 诱导细胞融合的融合率最高, 为
006428%。细胞融合率见表 4。根据统计学原理,
对所得到的融合率进行了数据差异性分析, 结果如
表 5、表 6所示。由表 5可知, 相同分子量下, 不同
浓度的 PEG诱导细胞融合所得到的融合率 90%以
上无差异,由此可见,浓度对于诱导细胞的融合并无
明显影响。由表 6可知, 相同浓度下,不同分子量的
PEG诱导细胞融合所得到的融合率 50%以上有差
异,并且 25%存在显著差异,由此可见, 浓度对于诱
导细胞的融合有较明显影响。
图 4 倒置相差荧光显微镜下的融合细胞 ( 200 )
表 4 不同分子量、不同浓度下的细胞融合率 (% )
PEG浓度 (% ) PEG分子量
2 000 4 000 6 000 8 000
45 0. 05974 0. 06390 0. 06256 0. 05811
50 0. 06056 0. 06428 0. 06138 0. 05749
55 0. 06135 0. 06327 0. 05982 0. 05625
60 0. 06222 0. 06314 0. 05846 0. 05543
表 5 相同分子量、不同浓度条件下细胞融合率 (% )的比较
PEG分子量 PEG浓度 (% )
45 50 55
PEG浓度 (% )
2 000 0057 ND ∃ ∃ 50
0063 ND 0055 ND ∃ 55
0054 ND 0052 ND 0071 ND 60
4 000 0055 ND ∃ ∃ 50
0086 ND 0078 ND ∃ 55
0067 ND 0064 ND 0 068 ND 60
6 000 0072 ND ∃ ∃ 50
0085 ND 0075 ND ∃ 55
0020 D 0071 ND 0063 ND 60
8 000 0053 ND ∃ ∃ 50
0078 ND 0084 ND ∃ 55
0066 ND 0085 ND 0079 ND 60
 ND表示无显著性差异 (P > 005) ; D有显著性差异 (P < 005) ; SD表示差异极显著 (P < 001) ,下同
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2010年第 12期 李云霞等:狂犬疫苗单克隆抗体制备过程中细胞融合条件的探索
经分析可知,在一定范围内, 分子量越大,浓度
越大, PEG的作用效果越明显, 但 PEG对细胞的毒
性也越大,所以到一定程度后, 融合率反而降低。试
验得到分子量为 2 000和 4 000,浓度为 50%和 55%
的 PEG作为融合剂诱导细胞融合相比之下可得到
较高的融合率,基本达到了预期试验结果。
表 6 相同浓度不同分子量条件细胞融合率 (% )比较
PEG分子量 PEG分子量
4 000 6 000 8 000
PEG浓度 (% )
2 000 0020 D 0068 ND 0067 ND 45
0023 D 0057 ND 0054 ND 50
0096 ND 0072 ND 0000 SD 55
0065 ND 0030 D 0000 SD 60
4 000 ∃ 0088 ND 0000 SD 45
∃ 0059 ND 0000 SD 50
∃ 0018 D 0000 SD 55
∃ 0000 SD 0000 SD 60
6 000 ∃ ∃ 0086 ND 45
∃ ∃ 0034 D 50
∃ ∃ 0017 D 55
∃ ∃ 0064 ND 60
26 杂交瘤细胞的核型
显微镜下对其中 25个中期分裂相的染色体进
行计数。染色体数目为 76- 98, 染色体主要分布在
85- 94之间 ( 72% )。杂交瘤细胞染色体见图 5、染
色体众数分析见表 7。
图 5 杂交瘤细胞染色体 ( 400 )
表 7 染色体众数分析
染色体数目 76 79 81 83 84 85 86 88 89 90 91 93 94 95 98
融合细胞 1 1 1 1 1 2 2 2 3 2 2 2 3 1 1
3 讨论
31 SP2 /0细胞培养及核型
培养 SP2 /0细胞时, 培养液的 pH值应在 70-
72之间。在进行 SP2/0细胞核型分析过程中, 发现
低渗时间 40- 50m in之间,秋水仙素作用时间 5- 6 h
之间,染色体分散较好,可得到较清晰的染色体中期
相滴片。 SP2 /0细胞活体染色观察发现,中期细胞呈
明亮圆球状,与培养瓶壁接触不紧密, 有时可观察到
清晰的纺锤体,摇荡可使其脱落,以此收集中期细胞。
32 HAT选择培养基下 SP2 /0细胞、脾细胞、饲养
细胞生长曲线的测定
在接种 7 d后 SP2 /0细胞基本死亡, 11 d后脾
细胞、饲养细胞基本死亡。第 14天时, 96孔细胞培
养板中存活的仅是融合细胞,所以选择此时检板,以
保证所得融合率的准确性。
33 细胞融合
源于同种异体和异种动物的细胞, 如脾细胞、巨
噬细胞等,均有促进细胞繁殖、提供杂交瘤细胞所需
群体环境等作用,最常用的是小鼠腹腔巨噬细胞,即
饲养细胞。因此在融合以前, 往往要在细胞培养板
中加入适量的小鼠腹腔细胞。饲养细胞一般在融合
前 1- 2 d制备;试验中所用的 SP2 /0细胞为不分泌
抗体、对 HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞株, 选择处于
良好生长状态、对数生长期和无支原体污染 [ 19, 20]是
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
获得高融合率的关键条件。
在融合前,一定要将离心的细胞团残存的培养基
倾倒干净,否则将改变 PEG的浓度,影响细胞融合
率;细胞团融合时, 要轻轻敲打融合管壁, 将其分散,
以便使细胞和 PEG充分接触; PEG对细胞是有毒性
的,残存的 PEG会影响杂交瘤的生长, 甚至死亡, 因
此要严格控制细胞和 PEG接触的时间, 应用无血清
的 DMEM培养液终止 PEG作用;洗涤过程中,要小心
操作, 避免用力吹打过猛而使刚融合的细胞发生损
伤,影响细胞融合率; 另外, PEG溶液的浓度、加入
PEG时离心管的转动速度对细胞融合也有一定影响。
34 制备杂交瘤细胞失败原因的分析
试验所采用的水、血清等的质量直接影响细胞
的生长、增殖以及细胞融合的效果。一旦选用某种
血清, 就不要轻易改换。 PEG的 pH、渗透压均对细
胞融合有影响; 污染主要由细菌、霉菌和支原体引
起。一旦发现有霉菌污染,应及早将污染板弃去,或
用 2 mo l/L NaOH及时处理污染孔及其周围。支原
体的污染主要来源于牛血清, 此外, 其它添加剂、实
验室工作人员及环境也可能造成污染; 在保证融合
技术的前提下, 杂交瘤不生长主要考虑: PEG的毒
性或作用时间过长;牛血清的质量太差;骨髓瘤细胞
污染了支原体; HAT有问题, 主要是 A含量过高或
HT含量不足。
35 关于杂交瘤细胞的保存
用来冻存的细胞一般选择在细胞约铺满 90%
的时候,这时细胞生长状态良好, 数量较多, 并且在
收获细胞前 24 h换 1次培养液; 细胞冻存中,一般
使用 DMSO作为保护剂。本试验采用含 10% DM

SO的小牛血清作为冻存液,效果良好; 本试验采取
先在 - 20! 降温 2 h,然后转入液氮罐半空中, 5 m in
后再转入液氮中。
36 杂交瘤细胞的核型
经染色体制备、计数和众数分析得到, SP2 /0细
胞的染色体数目为 34 - 65, 主要分布在 46- 52之
间 ( 64% ),杂交瘤细胞的染色体数目为 76- 98,染
色体主要分布在 85- 94之间 ( 72% ), 而小鼠正常
脾细胞的染色体数目是 40,符合杂交细胞染色体数
目为相杂交的两细胞数目之和的原则。此方法从另
一方面反映出所得到的细胞确实为 SP2 /0和脾细胞
融合而成的杂交瘤细胞。
参 考 文 献
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