全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
混合菌发酵 1, 3丙二醇的初步研究
郭铃 1 杜丽琴 2 韦宇拓 2 孙靓1 黄日波1
( 1国家非粮生物质能源工程技术研究中心,南宁 530007; 2广西大学生命科学与技术学院,南宁 530005)
摘 要: 将表达酿酒酵母 3磷酸甘油脱氢酶基因 ( GPD1)和 3磷酸甘油酯酶基因 ( HOR2 )的质粒 PSEgpd1ho r2转化到
甘油激酶基因 ( g lpK )和甘油脱氢酶基因 ( g ldA )双缺失的大肠杆菌 JM 109C中, 构建产甘油的工程菌 JM 109C /PSEgpd1hor2。
接种 JM 109C /pSEgpd1hor2和 K lebsiella在含 1%葡萄糖的摇瓶发酵培养基中 37 发酵 56 h, 1, 3丙二醇的最高产量为 1. 28
g /L,葡萄糖摩尔转化率为 37. 5% ; 在 30 L发酵罐中发酵 68 h, 1, 3丙二醇的最高产量为 24. 09 g /L, 葡萄糖摩尔转化率为 38.
0% ; 5 g /L的乙酸、乳酸, 10 g /L的乙醇分别使 1, 3丙二醇的产量降低了 91. 41%、54. 68%和 51. 56%。
关键词: 混合菌 发酵 甘油 1, 3丙二醇
Prelim inary Study on Production of 1, 3Propanediol byM ixed Bacterias
Guo L ing
1
Du L iqin
2
W eiYutuo
2
Sun L iang
1
Huang R ibo
1
(
1
National Engineer ing R esearch Center forN onfood B ioref inery, N anning 530007;
2
Co llege of Life Science and T echology, Guangxi University, N anning 530005)
Abstrac:t The plasm id PSEgpd1ho r2 conta in ing GPD1 andHOR2 from S. cerevis iae was transform ed into JM 109C w ith the de
fic iency of g lpK and g ldA. The h ighest y ield o f 1, 3propanedio l in Er lenm eyer flasks from 1% g lucose at 37 by constructed JM 109C /
PSEgpd1hor2 w ith K leb siella is 1. 28 g /L a fter 56 h and the m o lar conversion o f g lucose is 37. 5% . In 30 L fe rm entor, the h ighest
y ield o f 1, 3propaned io l is 24. 09 g /L and them o lar conversion o f g lucose is 38. 0% after68 h. The byproducts 5 g /L acetic ac id, 5 g /
L lactic acid and 10 g /L ethano l can decrease the y ie ld of 1, 3propanedio l 91. 41% , 54. 68% and 51. 56% , respective ly.
Key words: M ixed bac terias Ferm entation G lycero l 1, 3propaned io l
收稿日期: 20100504
基金项目:国家高技术研究发展计划 ( ! 863∀计划 ) ( 2006AA020103 )
作者简介:郭铃,男,硕士,研究实习员,研究方向:基因工程菌的构建与酶工程; Em ai:l glby@ 163. com
通讯作者:黄日波,男,教授,博士生导师; Em ai:l rbhu ang@ gxas. cn
1, 3丙二醇 ( 1, 3propanedio,l 1, 3PD )是一种重
要的化工原料,主要用于合成聚对苯二甲酸丙二醇
酯 ( polytrimethy lene terephalate, PTT ), PTT由于具有
优良的性能而引起广泛的关注。目前生物法生产
1, 3PD分为两种,一种是利用天然微生物将甘油转
化为 1, 3PD;另一方法是利用基因工程技术构建可
以将其它廉价碳源如葡萄糖转化为 1, 3PD的基因
工程菌。由于甘油价格高昂,用做原料不利于降低
1, 3PD生产成本,所以构建基因工程菌将葡萄糖转
化为 1, 3PD就成为降低其生产成本的有效途径。
当前, 国内外研究利用葡萄糖生产 1, 3PD有两种技
术路线,第一种路线是构建基因工程菌一步法生产
1, 3PD;第二种路线是分别利用能转化葡萄糖合成
甘油的菌株和产 1, 3PD的天然菌株进行混合发酵
生产 1, 3PD。由于构建基因工程菌一步法生产 1,
3PD的产量极低,因此国内研究大多倾向于混合菌
的发酵。
目前,国内混合发酵法生产 1, 3PD, 主要应用
假丝酵母 ( Candida )和克雷伯氏菌 (K. pneumoniae )
两步发酵生产 1, 3PD[ 1- 6]。但是用酵母发酵甘油
时间长,残糖含量高, 副产物多分离困难,造成生产
成本较高,而且着色深影响了产品的品质,不利于第
二步克雷伯氏菌的发酵,因此在发酵过程中,我们构
建能利用葡萄糖合成甘油的大肠杆菌作为宿主菌发
酵产生甘油。利用大肠杆菌发酵生产甘油具有容易
培养,副产物少,产物分离简单等优点 [ 7, 8 ]
2010年第 11期 郭铃等:混合菌发酵 1, 3丙二醇的初步研究
1 材料与方法
1. 1 菌株和质粒
大肠杆菌 ( E. coli ) JM 109由本实验室保存,
JM 109C( g lpK、g ldA基因缺失 )本试验构建,表达质
粒 pSEgpd1hor2由本实验室构建; 克雷伯氏菌
(K lebsiella )购自微生物保藏中心。
1. 2 培养基
1. 2. 1 LB培养基 ( L ) 蛋白胨 1 g, 酵母提取物
05 g, N aC l 1 g, pH7. 0。
1. 2. 2 摇瓶发酵培养基 ( L ) ( NH 4 ) 2 SO4 12. 6 g,
K 2HPO4 13. 7 g, 酵母提取物 0. 2 g, NaHCO3 1. 0 g,
维生素 B12 5 mg, M od ified B alch# s T raceE lement Su
lo tion
[ 9]
5mL,用盐酸调 pH至 6. 8。
1. 2. 3 种子培养基 ( L ) KH 2PO 4 30 g,柠檬酸 2 g,
M gSO4 7H 2O 2 g, 98% H 2 SO4 2 mL, 酵母提取物 5
g,葡萄糖 10 g, T raceMetals So lut ion 5 mL, Amp icil
lin100mg, 用 NH 4OH调 pH6. 8,过滤灭菌。
1. 2. 4 发酵培养基 ( L ) KH 2 PO4 6. 8 g,柠檬酸 2
g, M gSO4 7H 2O 2 g, 98% H 2 SO4 2 mL, 柠檬酸铁铵
0. 3 g, CaC l2 2H2O 0. 2 g,葡萄糖 10 g,乳糖 4 g,酵
母提取物 5 g,维生素 B12 5mg, Amp icillin 100mg,用
NH4OH调 pH6. 7。
1. 3 产甘油菌株的构建
将表达酿酒酵母 3磷酸甘油脱氢酶基因
( GPD1)和 3磷酸甘油酯酶基因 ( HOR2 )的质粒
PSEgpd1hor2转化到甘油激酶基因 g lpK和甘油脱
氢酶基因 g ldA双基因缺失的突变菌株 JM 109C中,
构建产甘油的双突变体的大肠杆菌工程菌 JM 109C /
PSEgpd1hor2。
1. 4 摇瓶发酵
接种甘油保存的 JM 109C /PSEgpd1hor2菌液
到含 100 g /mL Amp的 LB / 1%葡萄糖液体培养
基中, 37 、220 r /m in培养 12 h; 将上述的菌液按
2. 0%的接种量接入盛有 50 mL发酵培养基的 250
mL三角瓶中, 37 、220 r /m in培养 24 h。后按 1%
的接种量接入 K lebsiella, 37 、220 r/m in培养 16 h,
然后静止培养 14 h, 从接种 K lebsiella后每 4 h取样
进行 1, 3PD产量检测。
1. 5 发酵罐发酵
接种甘油保存的 JM 109C / PSE gpd1hor2菌液
于 LB /1%葡萄糖 ( 100 g /mL Amp)的培养基中,
37 振荡培养 12 h; 按 1%量接种上述菌液于盛有
100 mL种子培养基的 500 mL三角瓶中, 30 振荡
培养至 OD600为 0. 5- 0. 7; 按 2. 0%的量将种子接
种于盛有 25 L发酵培养基 /1%葡萄糖 (含 100 g /
mL Amp)发酵罐中, 发酵 4 h后开始流加葡萄糖, 通
过流加氨水来保持发酵液 pH 7. 0。稳定发酵 28 h
后按 5%的接种量接入 K lebsiella厌氧发酵 40 h, 用
10mo l的 KOH维持 pH 7. 0,从接种 K lebsiella后每 4
h取样进行 1, 3PD产量检测。
1. 6 产物的检测
取 1 mL 发酵液, 离心后, 过滤上清液用于
HPLC测定。进样量 10 L;色谱柱:氨基柱, 流动相
乙腈 ∃水 ( 75∃25) ;流速 1. 0 mL / m in; 检测器 R ID。
依据 1%标准样品的峰面积来定量。
2 结果与讨论
2. 1 摇瓶发酵 1, 3PD
以 1%的葡萄糖初始浓度进行甘油发酵, 发酵
结束后离心除去大肠杆菌细胞, 将 pH 值调整到
7. 0, 并补充维生素 B12等发酵 1, 3PD所需的其它成
分, 接种 K lebsiella进行 1, 3PD发酵。以 1%分析纯
1, 3PD为标样, 测 1, 3PD的产量, 结果如图 1所
示。结果 (图 2)表明, 混合菌摇瓶发酵有 1, 3PD
生成。
图 1 标样的高效液相色谱分析
经 HPLC分析结果显示, 混合菌摇瓶发酵葡萄
糖有 1, 3PD生成, 1%的葡萄糖初始浓度, 1, 3PD
最高浓度达到 128 g /L,葡萄糖摩尔转化率为 375%,
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
从图 3可以看出, 22 h后 1, 3PD产量趋于稳定。
图 2 JM 109C /PSEgpd1hor2和 K lebsiella摇瓶
发酵产物的高效液相色谱分析
图 3 1, 3丙二醇产量曲线图
2. 2 副产物对 1, 3丙二醇产量的影响
1, 3丙二醇发酵过程中会产生大量的副产物,
其中主要是有机酸和醇类,如乙酸、乙醇、乳酸及 2,
3丁二醇等。这些副产物在一定程度上影响了 1, 3
丙二醇的合成和菌体的生长,本试验通过对K lebsiel
la厌氧发酵生产 1, 3丙二醇代谢特点的研究, 分析
了乙酸、乙醇和乳酸等几种最主要的副产物对 1, 3
丙二醇产量的影响。在摇瓶发酵培养基中分别加入
乙酸、乳酸和乙醇溶液,使得培养基中乙酸、乳酸、乙
醇不同的初始浓度,再按照 1. 4方法进行摇瓶发酵,
其结果如图 4-图 6。
由图 4-图 6可知, 乙酸对 1, 3丙二醇产量的
影响最大,当乙酸浓度达到 5 g /L时,发酵液中几乎
图 4 乙酸对 1, 3丙二醇产量的影响
图 5 乳酸对 1, 3丙二醇产量的影响
图 6 乙醇对 1, 3丙二醇产量的影响
测不到 1, 3丙二醇; 乳酸对 1, 3丙二醇产量的
影响次之,当乳酸浓度达到 5 g /L时,发酵液中 1, 3
丙二醇浓度是最大值的 45. 3% ;乙醇对 1, 3丙二醇
产量的影响最小,乙醇浓度达到 5 g /L时, 1, 3丙二
醇浓度约是最大值的 90% , 乙醇浓度达到 10 g /L
时, 1, 3丙二醇浓度是最大值的 48. 4%。
2. 3 发酵罐发酵 1, 3PD
以 10%的葡萄糖初始浓度进行甘油发酵, 发酵
结束后将 pH值调整到 7. 0, 并补充维生素 B12等发
酵 1, 3PD所需的其它成分, 按 5%的接种量接种
K lebsiella进行 1, 3PD发酵。先 37 高速搅拌通气
发酵 8 h, 之后 37 , 50 r/m in搅拌厌氧发酵 32 h。
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2010年第 11期 郭铃等:混合菌发酵 1, 3丙二醇的初步研究
每 4 h取样进行生物量和 1, 3PD浓度测定,结果如
图 7。
图 7 5%接种量的 1, 3丙二醇发酵结果
从图 7中可以看出, 接种 K lebsiella后发酵 8
h内由于是通风搅拌发酵, 因此 K lebsiella菌株生
物量急剧上升, 但几乎没有 1, 3PD生成, 8 - 32
h之间菌株进入稳定生长期, 1, 3PD产量开始积
累, 36 h后产量趋于稳定, 并略有下降。 1, 3PD
最大浓度达到 24. 09 g /L, 葡萄糖摩尔转化率为
38. 0%。
3 结论
试验结果显示, 利用 JM 109C /PSEgpd1ho r2
和 K lebsiella混合发酵葡萄糖生产 1, 3PD是可行
的, 特别是发酵时间上比利用酵母发酵缩短了一
半, 但是同时副产物产量很高, 这对 1, 3PD的产
量影响非常大, 与利用相同浓度的分析纯甘油发
酵的产量相比, 只有 30% 左右 [ 10 ]。在添加不同的
副产物进行发酵研究中发现, 主要是有机酸的影
响最明显, 根据甘油在 K lebsiella中的代谢途径可
以知道, 1, 3PD合成过程中需要大量的游离氢进
行氧化还原反应, 而大量的有机酸不仅会抑制相
关酶的酶活, 也会抢占大量的游离氢,使得甘油代
谢流向着其它支路进行 [ 11 - 16]。另外, 混合菌发酵
过程中不同阶段的条件要求不同也对 1, 3PD产
量影响很大。由于甘油发酵阶段极度好氧发酵,
而 1, 3PD发酵阶段却极度厌氧发酵, 因此无法进
行同时发酵, 只能分步进行。发酵工艺的难度直
接导致发酵过程中中间产物甘油的滞留量很大,
这些问题将在以后的研究中亟待解决。
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