全 文 ：吐物技术通银
幼 述 与 专 论 刀了口2万C 月刊刀乙口 G Y B U L L E Z I N 2 X沟 年 增 刊
高效液相色谱和气相色谱在放线菌分类鉴定中的应用
曲直 ,2 阮继生 3 洪葵
, 中国热带农业科学院生物技术研究所 , 海口 571 101 ;2海南大学食品学院.循州 571737 ;
,中国科学院徽生物研究所,北京 10 864 )
摘 要: 随肴新菌株不断被分离及已有的大1 菌株 , 快速 准确的分类鉴定及高效排重时徽生物资源开发日益重要 , 而
快速发展的色讲技术使之逐渐成为可能以标准菌林和标准品优化了色讲技术中的高效液相色语(H PL c )和气相色讲(G C) 在
放线菌的 D N A (G 十c) m ol % 甲基茶砚和脂肪改中的鉴定方法及浏定参数优化的色讲鉴定方法不但有利于各个指征的分析更
快 ,更精确,也有利于高效排重 ,甚至也可检脸已有的分类鉴定是否正确而纠正错误属 种的划分
关. 词: 化学分类 高效液相色语 气相色讲 脂肪睦 甲基茶砚 D N A G十C) mo l%
A P licati on of H igh P erfo rm ance L iquid C hrom atograPhy and G as
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(G + C ) m of %
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随着色谱技术在微生物领域的广泛应用 ,放
线菌的分类鉴定已从传统的表型特征描述深人到
细胞成分的化学分析和分子生物学鉴定1 ,依据这
些分析可以在属的水平上对菌株做出精确鉴定 ,对
许多菌株之间的亲缘关系做出判断 高效液相色谱
(H PLC ) 应用于放线菌的分子鉴定和细胞化学成
分分析可直接测定菌株 D N A 的碱基组成和甲基蔡
酿型 ,为菌种的分类鉴定提供有利的证据 气相色
谱 (G C )应用于放线菌的鉴定 ,可直接测定菌株主
要脂肪酸的组成及含量 ,该分析是化学鉴定中重要
的指标之一 本文就 H PL C 在放线菌 D NA 的 G + C
摩尔百分比含量测定 甲基蔡醒测定和 G C 对菌种
脂肪酸测定在放线菌分类鉴定中的应用综述如下
1 放线菌 DN A 的 G +C 摩尔百分含t 测定
DN A 碱基组成比例 , 特别是 G +C 摩尔百分含
量在生物的分类鉴定 生物进化和物种亲缘关系研
收稿 日期 :2创拍一03 一02
基金项目: 国家 863 海洋生物资源开发利用技术(2(X) 7从 的24 15 ),国家自然科学墓金重点项 目一广东联合基金(U肠 3 0 8)
作者简介 :曲直(1982 一),女 ,硕士研究生 ,研究方向:放线菌的分类鉴定 ;E一耐 卜qu zh i082 施 ho tha l.com
通讯作者:洪葵 ,女 ,博士 ,博导 ,研究员 ,应用徽生物;E -.坦jl: k1 02 2@ 163.ne t
性扮杖术通报召白血沁丙肋枷盯 刀以翻加 2(X 刃 年 增 刊
究方面 ,作为一种稳定可靠的遗传指标 ,应用广泛
在伯杰细菌系统学手册中将 D NA G +C 摩尔百分
含t 作为分类鉴定的重要指标 ,可见其在鉴定中的
重要性 70 年代以前 ,人们应用纸层析法 热解链
温度法 浮力密度法测定核酸组成比例 这些方法 ,
有的测定时间长 ,准确性和重复性较差 ;有的是间
接侧定 ,影响因素多 ;有的所用试剂昂贵 K 等lz]
采用高效离子交换色谱法测定核酸碱基组成及其
比例 ,但其中色谱峰不能很好的分开 而采用 H pLC
测定 D N A 碱基组成 ,可以给出精确的 G +C 摩尔百
分含量 ,操作时间短 ,结果可靠 ,重复性高
1.1 放线菌 D N A 的提取和纯化
放线菌比细菌相对难以提取其 D NA , 所以尽
管测定时需要的 DN A 量很低, 但为了操作的方便,
宜从 5 9 左右湿菌中提取和纯化 D N A R NA 中含
有 DN A 的三种碱基 ,要求 D NA 样品中不能有 R N A
污染 ,否则影响 DN A G +C 摩尔百分含量的准确性
同时蛋白和盐对色谱柱有害, 建议 D N A 样品去除
蛋白 根据 D NA 的最大吸收峰在 260 lun ,杂质和
蛋白质的吸收峰分别在 230 nm 和 280 nm , 可用分
光光度计测定吸光度检查放线菌 D N A 的纯度13
1.2 D N A 的水解
通常采用核酸酶水解和酸水解两种方式 ,在用
酸水解时需注意标准碱基混合液和样品水解液的
pH 值 , pH 值较低时 ,腺嗦吟色谱峰明显展宽 ,当标准碱基混合液或 D N A 样品水解液的 pH 为 6 左右
时 ,各碱基色谱峰均得到良好分离
1.3 D N A G +C 摩尔百分含童浏定
采用戴安 肠80 高效液相色谱仪 ,依利特 O D S-
Bp 色谱柱 (4.6m x250m m , 中5卜m ) , 流动相为 20
m m ol / L K H ZPO 4缓冲液(pHS .6) )与甲醉 ,二者体积
比 o :10 ,流速 l 血/ 而n ,柱温 40 , 检测波长 260
nm 若在缓冲液和甲醉比例为 so :20 时 , 4 种碱基
无法完全分开 , 且峰形不好 ; 比例改为 85 :15 后 ,
各碱基保留时间均有所增加 ,但是仍有两个碱基不
能达到较好分离 ; 当比例变为 o :10 后 , 4 种碱基
均能明显分离 , 峰形良好 ; 如果将二者比例调为
95 :5 ,各碱基的保留时间明显增长 ,分离度虽然高 ,
但色谱峰略有展宽 ,同时分析周期加长 ,所以采取
90 :10 的比例最佳 在磷酸盐的浓度为 5 ~ l几
时 ,各色谱峰峰形欠佳 ;以后随着磷酸盐浓度的加
大 , 对保留时间的影响不太明显 , 在浓度大于 20
~ ol /L 后 , 峰形均良好 为了不让磷酸盐浓度太
高 ,故选用磷酸盐浓度 20 ~ ol lL 为宜 缓冲液不
同 pH 值对保留时间及分离情况也有影响 , 虽然 C
和 G 的保留时间随 pH 的增加无显著增加 ,但 T 和
A 的保留时间受 pH 变化的影响较大 ,尤其 pH >4.5
时 A 的保留时间有显著增加 ,当 pH 在 4. 5一6 时 , 4
种碱基能得到很好的分离 , 且总的分析时间在 15
m in 之内 ,最终选用 pH S.6 的磷酸盐缓冲液作流动
相的组分 测定了标准株 E邵五州c五抽 coli D H 5a 的
G +C 摩尔百分含量 ,三次结果平均值为 52 .1% 据
报道 , 同一属的细菌的 G +C 摩尔百分含量值范围
不应相差 12 % 以上 , 同一种细菌的 G +C 摩尔百分
含量值的范围不应相差 5% 以上l] 应用本文 H PLC
色谱条件测 出的这株菌该菌的 D NA G +C 摩尔百
分含量值与文献报道值相符 ,相差在种允许的范围
之内 ,同时测定了 8 株待测放线菌的 D N A G +C 摩
尔百分含量 , 结果均符合该属其含量所在的范围 ,
证明在这种条件下测得的 G +C 摩尔百分含量可
靠
综上所述 , H PLC 测定菌株的 D NA G +C 摩尔
百分含量是一个快速 准确可靠的方法 ,但是在应
用这个方法时应注意下列几点: 1 放线菌 DN A 应
高度纯化 ,按常规方法提取与纯化的放线菌 DN A ,
不宜直接用 H PLC 测定 G +C 摩尔百分含量 样品
中残留的 R N A 等明显影响 G +C 含量测定的准确
性 ,必须用核糖核酸酶进一步处理 否则 ,较多的杂
质峰将影响喊基峰的形成而使 G +C 摩尔百分含量
测定出现较大误差 ;2 样品水解液和流动相应控制
其 pH 值 ,即使选取其他流动相组成测定 G +C 摩尔
百分含量 ,也要采取合适的 pH 值和比例 ,尽可能
无杂峰 峰型良好和分析时间适中
2 放线菌的甲墓萦限分析
在微生物中酿主要有两种类型 :甲基蔡限 (简
写为 M K , 即 2一甲基一3一多异戊烯基一l , 4一蔡酸)和
泛酿(简写为 Q ,即 2 , 3一二甲氧基一5一甲基一6 多异
戊烯基一1 , 4一苯酿 ) , 革兰氏阳性细菌包括放线菌
主要合成甲基蔡酿 甲基蔡酿是放线菌细胞质膜和
线粒体膜的组分 ,在电子传递链和氧化磷酸化中起
2 X玲 年 增 刊 曲直等:高效液相色谱和气相色谱在放线菌分类鉴定中的应用
重要作用 ,除了具有这些重要的生理功能 , 甲基蔡
酿作为放线菌分类的重要化学指标常用于放线菌
的分类鉴定 ,因为甲基蔡酿分子中的多烯侧链长度
为 6一14 个异戊烯酿单位不等 , 除了多烯侧链长度
的不同之外 ,多烯链的氢饱和度也不同 ,因此 ,甲基
蔡酿作为分类学的指标就在于这种侧链长度和氢
饱和度的变化 , 测定放线菌所含戊烯酪的种类 ,就
能够对放线菌的分类鉴定提供一个可靠的科学依
据 并且随各种条件的变化 ,菌体中甲基蔡酿的成
分变化甚微 ,所以将它作为放线菌分类鉴定的指标
之一是比较客观的
Colins , M in ikin , Coodfe llow 等人建立酿在不同
菌分类鉴定中的分析方法 5一8] 并划分其类型 ,现结
合 M innikin , G 阳山飞low 建立的甲基蔡醒鉴定方法191
简述如下 :
2.1 甲基茶砚的提取与纯化
甲基蔡酿对光氧化作用和碱性处理条件颇为
敏感 ,在选用提取和纯化方法时务须考虑合适的条
件和相应的措施 例如 ,为防止强烈光照作用 ,应采
用避光措施 ,如将容器包上锡纸或黑纸 ;为防止氧
化作用 ,应采用氮气保护等等
将 10 m g 冻干菌置于带盖的 12 耐 的 1 号样
品瓶 (Agi lent, 5183一4534 )中,加 3 耐 的 0.3 % N a-
Cl :甲醇 (10: 10 ,v/ v) ,再加 3 词 石油醚 ,在避光
的环境中涡旋 l h 并低速离心 5 而n , 将上层液体
转移至 2 号样品瓶中 1 号样品瓶再加人 3 而 石
油醚涡旋 30 m in 并离心 , 上层也转移到 2 号样品
瓶中 , 将 2 号样品瓶 中的液体氮气吹干后加人
20 协l丙酮 , 用硅胶薄层板 (M ere k, 几 C Siliea 罗l
60 F2 54 )纯化提取甲基蔡酿 在 254 nm 紫外下刮
取 RF二0. 7 的条带 , 放人 1.5 耐 离心管加人 1 血
乙醚 ,涡旋并高速离心 ,上层转移至 1.5 而 的样品
瓶中 ,氮气吹干 ,用 20 闪 异丙醇溶解 , 0.45 um 有
机过滤膜过滤 ,备用
这里值得提出的是 , 由于甲基蔡酿容易分解 ,
所以样品纯化后尽可能立即在同一天或稍后完成
分析 如果考虑要得到一个正确和精确的量值 ,这
一经验是需要的 纯化或贮藏过程中水的出现或曝
光会引起甲基蔡醒数量的减少 ,因此在甲基蔡酿样
品纯化和保存中防水 避光非常必要 长期保存 甲
基蔡酿样品最好是冻干或 N Z 封
2. 2 甲基茶砚的 H PLC 分析
以紫外检测的戴安 P6 80 高效液相色谱仪 ,依
利特 o ns一BP 色谱柱 (4.6 m m x250 m m , 中5林m ),
254 nm 260 nm 270 nm 检测波长和甲醇 :异丙醇
(3 :2 ,v/ v) 流动相及 l m l / m in 流速分析甲基蔡
酿 通过与可靠的标准菌的甲基蔡酿型比较鉴定各
待测菌甲基蔡酿的类型110]
当用 H PLc 分析甲基蔡酿用以鉴定放线菌时 ,
必须将测定菌与标准菌图谱对照 因为 H PLC 分析
甲基蔡酿鉴定放线菌是定性分析 ,分析条件的微小
变化都会影响某种甲基蔡酪保留时间的变化 ,使我
们无法进行正确判断 此外 ,仅靠一张 H PL C 图谱
就对放线菌作出鉴定难免有些草率 ,应结合其它鉴
定方法
综上所述 ,在从已知标准菌株中提取的甲基蔡
酿作为对照时 ,用 H PLC 测定待测放线菌中的甲基
蔡酿 ,具有操作简便 快速 ,灵敏度高 准确度高 重
复性好等特点 ,尤其为解决具有相似形态特征的放
线菌的分类问题 ,提供明确的化学指标 ,可作为较
理想的常规测定方法应用于放线菌的分类和鉴定
3 放线菌的脂肪酸分析
脂肪酸是放线菌细胞组分中一种稳定的成分 ,
不同放线菌含有不同脂肪酸 ,它和放线菌的遗传变
异 毒力 耐药性等有极为密切的关系,它的种类和
含量是细胞化分类法的重要依据之一1 气相色
谱分析技术能快速 灵敏 精确地检测出放线菌细
胞内的脂肪酸 l2. 3] 脂肪酸定性分析结果限于属和
属以上的分类
3 .1 脂肪 酸的提取
脂肪酸分析应在标准化的条件下进行 ,因为不
同组分的相对含量因菌龄和培养条件的不同而异
用作脂肪酸分析的菌体应在稳定期收获 ,收集菌体
时应用无菌水冲洗 2一3 次 提取分为四个步骤 4:
第一是皂化 ,该过程可使脂类在强碱的作用下产生
更多的竣基 ,有利于下一步的甲基化 ;第二是甲基
化 ,因为脂肪酸本身挥发性较小 ,所 以要将脂肪酸
甲基化转化成脂肪酸甲醋以增加脂肪酸的挥发性
该步骤需要注意精确控制 80土1 水浴 ro m in , 以
免经基酸和环式脂肪酸受到破坏 ,同时此步所需的
吐物该术通银助 姗为初枷盯 B 川肠血 2(X 拍 年 增 刊
溶液 pH 应低于 1.5 , 这样可以增强极性脂的挥发
性 第三是浸提 ,利用有机溶剂将脂肪酸甲醋提取
出来 第四是清洗 ,该步是减少进人气相色谱仪进
样口 色谱柱及检测器的污染物 总而言之 ,待测放
线菌在标准的培养条件下培养和收获 , 经过氢氧
化钠和甲醉试剂皂化和甲基化 , 通过正己烷和乙
醚的萃取 , 再经氢氧化钠洗涤后, 注人 GC 系统中
分析
3. 2 脂肪政的 G C 分析
采用岛津一20ro 气相色谱议 , 配备分流进样
口 ,氢火焰离子化检测器(n D) ; Su pe lc 公司 SP -
23 80 色谱柱 , (30 m ,咖 .25 ~ , 液膜 厚度 0. 2
卜m ); 柱温为程序升温 : 起始温度 50 , 维持 2
而n ; 4 lm in 升至 250 , 维持 15 m in ; 进样口温
度 25 0 ,检测器温度 260 ,载气为氮气 ,柱流量
为 1.5 耐/m in ,分流比 10 :1 ,进样量 1.5 闪;氢气流
速 30 耐/m in ,空气流速 4的 d /m in 通过与标准菌
的主要脂肪酸及脂肪酸标准品的对比分析 ,可以鉴
定待测放线菌的主要脂肪酸类型
用气相色谱分析脂肪酸有以下几个优点 :1 样
品用t 少 ,进人色谱仪只需 1.5 川 ;2 敏感 精确 ,
可检出徽克以下数里的脂肪酸 ;3 可快速得到结
果 ;4 对处理好的样品保存时间要求不高
综上所述 , 放线菌细胞脂肪酸的组成, 一般可
通过单次试验 比较准确地将放线菌鉴定到属 , 但
是脂肪酸是一种可随着培养条件变化而发生改变
的细胞组分 , 并且气相色谱是高精密度的分析仪
器, 因此 , 分析过程的条件选择和质量控制则显得
非常重要 , 必须对放线菌培养条件 菌龄 色谱条
件等实验条件进行标准化 , 否则会严重影响方法
的准确度和重复性
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