全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-10-06
基金项目：国家自然科学基金项目（30660144），教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NCET-05-0755），科技部国际合作重点项目
（2005DFA30610）
作者简介：徐先栋（1982-），男，在读硕士研究生，研究方向：水生生物病害防治；E-mail：xuxiandon2004@yahoo.com.cn
通讯作者：周永灿（1968-），男，教授，博士，主要从事水生生物病害及其防治研究；E-mail：zychnu@hotmail.com
脂多糖 （Lipopolysaccharides，LPS）是革兰氏阴
性菌细胞壁中的主要成分，又称作内毒素，其结构
包括核心寡聚糖、 特异性 O-抗原多糖侧链和类脂
A 共 3 部分 [1]。 LPS 不仅对机体的体液免疫应答具
有良好的作用，而且对机体的非特异性免疫功能也
有促进作用，近几年成为研究热点 [2~5]。
银染方法及其不断的改进多见于蛋白质检测，
而有关 LPS 银染检测方法报道较少。 Tsai 和 Frasch[6]
在 1982 年首次报道了 LPS 的银染检测方法， 该方
法被认为是 LPS 检测的经典方法 [7]，此后 ，虽然也
报道了少量以 Tsai 和 Frasch 方法为基础的 LPS 银
染检测改良方法 [8，9]，但所有这些方法都具有耗时
长或操作繁琐等缺点。根据 LPS 银染的原理及其已
有的检测方法， 发展了一种新的 LPS 银染方法，该
方法具有耗时短、操作简单和染色效果好等优点。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
大肠杆菌 （Escherichia coli 0111：B4）LPS 购于
Sigma 公司 ； 丙烯酰胺 （Acr）、 甲叉双丙烯酰胺
（Bis）、十二烷基硫酸钠（SDS）、N，N，N，N-二甲基乙
二胺（TEMED）、高碘酸 、硝酸银、碳酸钠、甲醛等均
为国产分析纯。 迷你双垂直电泳槽 DYCZ-24D （北
京六一，中国）；Powerpac Universal 通用型电源（Bio-
rad，美国）。
1.2 SDS-聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）的配制
SDS-PAGE 的配制参照 《分子克隆实验指南 》
（第 3 版 ） [10]以及 Tsai 和 Frasch[6]方法 ，并作了相应
的改良，具体如下：
脂多糖快速银染检测方法的改良
徐先栋 谢珍玉 王世锋 周永灿
（海南省热带水生生物技术重点实验室 海南大学海洋学院，海口 570228）
摘 要： 为了建立一种快速、高效的脂多糖（LPS）银染检测方法，利用大肠杆菌（Escherichia coli 0111：B4）制备的
LPS为研究对象，在传统 LPS银染检测方法的基础上，通过调整凝胶的固定氧化试剂和银染试剂等措施，对 LPS经 SDS-
PAGE电泳后的结果进行银染检测。结果表明，改良的 LPS快速银染检测方法在保持传统方法灵敏度的基础上，操作过程
更为简单，安全性、经济性和染色效果等方面也比传统的方法均有明显提高，是一种快速高效的 LPS银染检测方法。
关键词： 脂多糖 快速检测 银染 改良方法
A Modified Silver-staining Method for Lipopolysaccharides
Detection
Xu Xiandong Xie Zhenyu Wang Shifeng Zhou Yongcan
（Key Laboratory of Tropical Aquatic Biotechnology of Hainan Province，College of Marine Science，Hainan University，
Haikou 570228）
Abstract： A modified silver-staining method was developed to detect lipopolysaccharides（LPS）. the LPS extracted
from Escherichia coli 0111：B4 was used as the test material. The new method was set up by modifying reagents for
fixation，oxidation and silver-staining. The results for detection of LPS showed that，compared to tranditional method，the
modified method was simple，time-saving and high efficient for LPS detection.
Key words： Lipopolysaccharides（LPS） Rapid detection Silver staining Modified method
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
12%分离胶 （含 4 mol/L 脲素 ，1.0 mm 厚 ，80
mm×60 mm）的配制：ddH2O 1.6 ml、30%丙烯酰氨贮
备液 （丙烯酰氨 ：甲叉双丙烯酰胺为 29 ∶1）2 ml、脲
素 1.2 g、1.5 mol/L 的 Tris-Cl（pH8.8）1.3 ml、100 g/L
的 SDS 50 μl、100 g/L 过硫酸铵 50 μl、TEMED 2 μl，
混匀 ，灌胶 ，并留出足够的浓缩胶空间 （梳齿长加
1 cm），以 ddH2O 作覆盖层封胶。 室温下静置，待分
离胶聚合完成后（约 30 min），倒掉覆盖层，用 ddH2O
清洗凝胶顶部数次以去除残留的未聚合的丙烯酰
胺，尽可能排去凝胶上的液体 ，再用纸巾小心吸尽
残留的水。
5%浓缩胶的配制：ddH2O 2.1 ml、30%丙烯酰氨
贮备液 （丙烯酰氨∶甲叉双丙烯酰胺为 29∶1）0.5 ml、
1.0 mol/L 的 Tris-Cl（pH6.8）0.38 ml，100 g/L 的 SDS
30 μl，100 g/L 过硫酸铵 30 μl，TEMED 3 μl， 混匀
后，快速将浓缩胶沿玻璃板边沿直接灌至聚合好的
分离胶上。 将凝胶板于室温下垂直放置。
1.3 LPS 电泳样品的制备及电泳
LPS 电泳样品的制备及电泳参考 Tsai 和 Frasch[6]
和 Fomsgaard 等 [8]的方法，具体如下：LPS 水样 10 μl
与等体积的 0.1 mol/L 的 Tris-HCl（pH 6.8，含 20 g/
L SDS、200 g/L 蔗糖、1% 2-巯基乙醇和 100 mg/L 溴
酚蓝） 混合，100℃水浴 5 min； 冷却后用移液器将
20 μl 样品加于 3 mm 宽的上样孔。 先以 12 mA 进
行浓缩胶电泳， 再加大至 25 mA 进行分离胶电泳，
待溴酚蓝泳动到分离胶底部，切断电源。
1.4 银染
按常规方法取下胶板并剥胶，分别采用 Tsai 和
Frasch 方法 [9]、Fomsgaard 等 [8]方法以及本研究的改
良方法进行银染比较，3 种 LPS 银染检测方法的具

 Tsai Frasch

 Fomsgaard

 

 / 

30%  10% 7 g/L
  10 min
40% 5% 7 g/L 22
 20 min
30% 10% 7 g/L 22
 20 min
 ddH

O 3 30 min ddH

O 3 5 min ddH O 3 5 min
 !"# $ 10 min !"# $ 10 min 30% 1 g/L AgNO $ 30 min
 ddH O 3 10 min ddH O 3 5 min ddH O 110 s
&$ 0.05 g/L’(0.02%)*"#&$
10 min+,-./0
0.05 g/L’(0.02%)*"#&$ 10 min
+,-./0
30 g/L Na CO (41234)0.02%)*&
$ 20 min+,-./0
56 ddH O56&$78 10%56&$78ddH

O 10%56&$78ddH

O
9:/;< 9:;<= 7% 9:;<= 7% 9:;<= 7%

表 1 3 种 LPS 银染检测方法的步骤比较
* 银氨溶液的配制方法见文献 [9]
体步骤见表 1。
2 结果
分别用 50 μg、5 μg 和 0.5 μg 3 个质量梯度的
E. coli 0111：B4 的 LPS 经 SDS-PAGE 电泳后， 再分
别用上述 3 种不同的银染方法染色（图 1）。
从图 1 可看出，本研究改良方法的检测 LPS 的
灵敏度与 Tsai 和 Frasch 方法相当，稍强于 Fomsgaa-
rd 等的方法。 此外，Tsai 和 Frasch 方法和 Fomsgaard
等的方法由于使用了银氨溶液，在操作中凝胶与染
色器皿很容易产生粘连，因此也容易出现银镜反应
后留下的瘢痕 （图 1-A，B 中箭头 ），但经改良的银
染方法可以有效避免该瘢痕。
3 结论
银染法是一种灵敏度极高的染色方法，不仅广
泛应用于蛋白质，核酸等的染色，也应用于多糖类
物质的染色。 改良银染法的基本原理：多糖类的连
二羟基被高碘酸氧化为醛基 （-CHO），可与银离子
A B C
A. Tsai 和 Frasch 的方法 ；B. Fomsgaard 等方法 ；C. 本研究改良
的方法；1~3. 50、5 和 0.5 μg 3 个质量梯度的 E.coli 0111:B4
的 LPS，箭头 .银镜反应留下的瘢痕
图 1 3 种 LPS 检测方法的银染结果
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2009年第 3期
（AgNO3 溶液提供 ）结合 [11]，在弱碱性条件 （Na2CO3
溶液产生）下，还原剂（甲醛）将银离子还原为金属
银，从而在凝胶上显现棕色或黑色的条带。其中，弱
碱性的 Na2CO3 溶液可以有效中和反应生成的甲
酸， 冰浴后的 Na2CO3 溶液还可有效降低银离子还
原的速度，致使整个染色过程易于控制。
本研究改良方法与传统方法最大的差别是，改
良方法用 1 g/L 的 AgNO3 溶液作染色液替代了 Tsai
和 Frasch 方法 [6]和 Fomsgaard 等方法 [8]中使用的银
氨溶液，具有以下优点：（1）由于配制银氨溶液的操
作步骤繁锁，以 AgNO3 溶液替代银氨溶液，有效简
化了 LPS 银染检测的操作；（2）以 AgNO3 溶液替代
银氨溶液有效提高了检测的安全性，降低了含氨的
银盐在操作中具有发生爆炸的危险 [10]；（3）改良方
法所需的 Ag+量少，节约检测成本。
为了加快检测速度， 缩短染色所需的时间，此
改良方法采用了 Fomsgaard 等的固定氧化方法 ，所
采用的乙醇和乙酸等固定剂的浓度与 Tsai 和 Frasch
方法 [9]相同，为 30%乙醇和 10%冰醋酸。 Fomsgaard
等 [8]认为，以 Tsai 和 Frasch 的方法固定不仅所需时
间长，还会洗去脂多糖中的脂肪酸带，检测不到到
低脂肪酸含量的脂多糖，因此通过采用了在固定液
中直接加终浓度为 7 g/L 高碘酸并于 22℃浸泡凝胶
20 min 的方法 ， 洗涤凝胶的时间也从每次 30 min
缩短为每次 5 min， 从而使整个染色过程在 2 h 内
完成，比 Tsai 和 Frasch 的方法缩短了 10~14 h 的检
测时间。
Kittelberger 和 Hilbink[9]认为 ，由于银镜反应的
原因，基于银氨溶液染色的方法很容易使胶与染色
器皿产生粘连，留下银镜反应的瘢痕。 本研究结果
（图 1）与 Kittelberger 和 Hilbink 的观点一致。 此外，
基于银氨溶液染色的方法还容易致使背景不均匀
和容易使胶破裂，影响银染效果。
为了获得良好的银染效果，应用改良方法需要
注意以下事项：（1）用 1 g/L 的 AgNO3 溶液染色后，
洗涤过程应尽量短，一般要求在 10 s 内完成，以提
高染色的灵敏度，当 LPS 的量很少时，为避免银染
过淡， 可重复染色一次；（2）30 g/L 的 Na2CO3 溶液
在使用之前应先在 4 ℃冰箱中或在冰块上预冷，以
延缓显影时间，使显影过程易于控制，并可降低背
景着色，提高显色效果 [12]。
参考文献
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