全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
无芒雀麦愈伤组织在氩离子 ( Ar+ )
注入过程中冻害耐受性研究
黄洪云 1, 2 　那日 1 　刘美玲 1 　邢万金 3
(1 内蒙古大学物理科学与技术学院 , 呼和浩特 010021; 2 唐山学院 ,唐山 063000; 3 内蒙古大学生命科学学院 ,呼和浩特 010021)
　　摘 　要 : 　以无芒雀麦愈伤组织为研究对象 ,探讨了甘油处理对愈伤组织在氩离子注入过程中冻害的防护。结果表明 :
经甘油处理后 ,当离子注入剂量小于 216 ×1015 A r+ ·cm22时 ,愈伤组织存活率在 85%以上 ,失水率在 12% ,比未经甘油保护的
有大幅度提高 ,甘油预处理的愈伤组织生长比较正常。注入剂量增加到一定程度 ,愈伤组织不能继续生长。
关键词 : 　无芒雀麦 　愈伤组织 　A r+离子束 　冻害
Study on Protection from B rom us inerm is Callus
Hazard in Ar+ Ion Injection Process
Huang Hongyun1, 2 　Na R i1 　L iu Meiling1 　Xing W anjin3
(1 School of Physical Science and Technology, InnerM ongolia University, Hohhot 010021; 2 Tangshan College, Tangshan 063000;
3 College of L ife Sciences, InnerM ongolia U niversity , Hohhot 010021 )
　　Abs trac t: 　The p rotection effect of glycerin from B rom us inerm is callus hazard was studied in the p rocess of A r+ ion imp lantation1
The results showed that after the p rotection of glycerin, the survival rate of B rom us inerm is calluswas about 85% and the rate of losting
water was 12% when the A r+ ion was 216 ×1015 A r+ ·cm - 2 1 The p rotection of glycerin had the obvious effects, and the callus can
grow1W hen the imp lantation dose arrived a certain level, the callus could not grow1
Key wo rds: 　B rom us inerm is　Callus　A r+ ion　Hazard
收稿日期 : 2008211220
基金项目 :内蒙古自治区自然科学基金重大项目 (200711020101 ) ,内蒙古教育厅基金项目 (NJ05025)
作者简介 :黄洪云 (19792) ,女 ,硕士 ,讲师 ,主要从事生物物理研究
通讯作者 :那日 ,教授 , E2mail: nari6363@ tom1com　　低能离子束诱变生物体和介导基因转移的研究已得到了广泛的应用 [ 1, 2 ]。低能离子束通常是在真空的条件下 ,以干种子或水分含量少的器官或组织为实验材料注入生物体。而水分含量大的样品 ,如愈伤组织或幼苗离子注入后的存活率往往极低 [ 3 ] ,其原因是暴露于真空靶室中的样品表面水分蒸发会带走大量的汽化热 ,自身温度迅速下降。由于热传导的关系 ,经过一段时间后整个细胞中的水分即会结冰 [ 4, 5 ] ,因此限制了这一技术在含水量高和代谢旺盛的植物活体组织中的应用。为了减轻离子注入的冰冻伤害 ,扩大植物材料的应用范围 ,更好地发挥低能离子束的独特生物学效应 ,已有的报道大多采用玻璃化防护法解决离子注入过程中活体材料因真 空造成的冻害而不能存活的问题 [ 6 ]。甘油作为一种防冻剂 ,因其处理细胞组织的程序简单和冻存效果好的特点 ,现已有人用于微生物细胞的保护 [ 7 ]。以无芒雀麦为实验材料 ,建立了无芒雀麦愈伤组织真空耐受培养条件和筛选程序 ,并用甘油作为防冻剂 ,防护在离子注入过程中愈伤组织冻害的产生 ,以期能为防治其它活体组织在离子注入过程中产生冻害提供参考。1　材料与方法111　材料11111 　试验材料 　无芒雀麦 ( B rom us inerm isLeyss1)种子购自北京绿之杰种子有限公司。112　方法
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
11211　愈伤组织培养 　选取籽粒饱满 ,大小一致的
无芒雀麦种子 ,用 75%的乙醇浸泡 30 s,无菌水冲
洗一遍 ,再用 011%升汞处理 15 m in,无菌水冲洗 5
次 ,放在水中浸泡 12 h左右。然后放到无菌培养皿
中 ,用灭过菌的刀切下胚部 ,放到诱导培养基上 ,于
25～26 ℃下暗培养。每瓶培养基上放 5个种胚。
MS培养基含有近 30种营养成分 ,将培养基中
的各种成分 ,按原量的 10、100、200和 1 000倍分别
称重 ,配成浓缩液 ,即培养基母液。每次使用时 ,取
其总量的 1 /10 ( 100 m l)、1 /100 ( 10 m l)、1 /200 ( 5
m l)和 1 /1 000 (1 m l) ,加水稀释 ,配制成培养液。另
外分别称取 2, 42D和 62BA各 100 mg,分别用 1 m l
无水乙醇预溶 2, 42D, 1 m l (1 mol·L - 1 ) NaOH溶液
溶解 62BA,溶解过程中需于水浴中加热 ,最后两者
分别定容至 100 m l,即得到 1 mg·m l- 1的母液。
MS诱导培养基中的 2, 42D和 62BA 根据试验
需要配制 ,用量筒或移液管从各种母液中分别取出
后与各种母液一起放入烧杯中。分别称取 7 g琼
脂、30 g蔗糖 ,放入 1 000 m l的烧杯中 ,再加入 750
m l蒸馏水 ,放在电炉上加热 ,用玻璃棒搅拌 ,直到液
体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到
煮沸的琼脂中 ,最后加蒸馏水定容至 1 000 m l,搅拌
均匀。吸取 1 mol·L - 1 NaOH溶液 ,逐滴滴入溶化
的培养基中 ,边滴边搅拌 ,并随时用精密的 pH试纸
(514～710)测定培养基的 pH,直至达到所需的 pH
值为止。pH值有 5个梯度 ,即 510、514、518、612和
616,每个 pH值重复 5次 ,光照时间为 14 h,温度为
26℃。愈伤诱导率 =形成愈伤的种子数 /接种种子
数 ×100%。
诱导无芒雀麦愈伤组织时 ,每个浓度重复 5次 ,
每个浓度接种 50瓶 ,每瓶 5个种胚。62BA浓度定
为 115 mg·L - 1 , 2, 42D 浓度有 015、110、115、210、
215、310、315和 410 mg·L - 1。
11212　真空保护剂 　以甘油作为真空保护剂 ,设有
8个浓度 ,即 10%、20%、30%、40%、50%、60%、
70%和 80% , 121℃高压灭菌 20 m in,以无菌蒸馏水
浸泡愈伤组织为空白对照。
11213　真空处理的流程 　 (1)预处理 :将继代 3次
培养 8 d的愈伤组织放入灭菌的 8个 15 m l离心管
中 ,分别加入 5 m l不同浓度的甘油 ,室温静置 115
h,取出愈伤组织放到无菌滤纸上 ,吸去表面附着的
保护剂 ,置于超净工作台中以无菌风吹 10 m in,直至
表面干燥为止。 ( 2)真空处理 :将愈伤组织放入离
子注入机的小靶室 (中科院等离子体物理研究所研
制 )中 ,真空处理 5 m in,真空度为 3 ×10 - 2 ～5 ×
10 - 2 Pa ,每种浓度甘油均重复 3次 ,每组 20块愈伤
组织 ,每块约 100 mg。 (3)后处理 :将经过真空处理
的愈伤组织立即放入无菌水中 ,放在 25℃摇床上以
振幅为 80 r/m in缓慢震荡 10 m in,直至组织复水并
洗去表面的保护剂时为止。 ( 4)细胞存活性测定 :
愈伤组织活性测定采用 氯化三苯基四氮唑还原法 (
TTC法 ) [ 8 ]。
每个灭过菌的试管中加入经过处理的无芒雀麦
细胞 ,加入 215 m l, 015%的 TTC溶液和 215 m l pH
710的磷酸钠缓冲液 25 mmol·L - 1混匀 ,于 25 ℃下
避光处理 13～16 h,细胞呈红色 ,弃去上清液 ,加入
5 m l灭过菌的蒸馏水洗涤细胞 ,重复 3次。加入
5m l 95%乙醇 ,置于 60℃水浴中 45 m in,其间轻轻摇
动试管 1～2次 ,置于室温下至细胞完全无色。取上
清液 ,以分光光度计上测定波长 485 nm 处吸光值
(A) ,吸光值即代表细胞活性 ,吸光值越大 ,细胞的
活性越强 [ 9, 10 ]。细胞活力 ( H ) =真空处理后细胞
TTC值 ( Td) /未处理细胞 TTC值 ( Tc) ×100%。
11214　离子注入愈伤组织 　按照文献 [ 11 ]中以愈
伤组织正常增重作为愈伤组织的初步存活力大小。
离子注入采用强流脉冲离子注入机 (中国科学院等
离子体研究所研制 ) ,分成 6组 ,其中一组为对照 ,
其余置于注入机的微靶室中接受离子注入 ,分别用
以能量为 20 keV,剂量为 ( 216、512、718、1014、13)
×1015 A r+ ·cm - 2的 A r+注入未经甘油处理的无芒
雀麦愈伤组织中 ,每个剂量继代 3次和培养 8 d的
愈伤组织 20块 ,每块约 100 mg。处理重复 3次 ,试
验数据为多次重复实验的平均值。
用 50%的甘油溶液预处理愈伤组织 ,以能量为
20 keV,剂量为 ( 216、512、718、1014、13) ×1015 A r+
·cm - 2的 A r+注入后观察注入剂量对失水率的影
响。经甘油预处理与否的愈伤组织以无菌滤纸吸干
水分后准确称重 ,记为 W 1 ,离子注入或真空处理后
称重记为 W 2 ,失水率为 (W 1 - W 2 ) /W 1 ×100% [ 12 ]。
11215　愈伤组织生长测定 愈伤组织正常增重可以
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2009年第 6期 黄洪云等 :无芒雀麦愈伤组织在氩离子 (A r+ )注入过程中冻害耐受性研究
作为愈伤组织初步成活指标 ,观察注入不同剂量
A r+的愈伤组织增重。离体胚置于愈伤组织诱导培
养基上 1周后长出的愈伤组织称重 ,记为 M 1 , 2周
后再称重 ,记为 M 2 ,M 2 /M 1 为胚接种后第 2周长出
的愈伤组织增长倍数。
2　结果与分析
211　pH值对愈伤组织诱导的影响
如表 1所示 ,愈伤组织诱导率先随 pH值的升
高而增大 , pH为 518时最大 ,之后随着 pH值的升
高而减小 ;愈伤组织的生长随 pH值 ( 510～518)的
增高而加快 , pH值超过 612时生长明显减慢。pH
值偏高 (612～616)或偏低 (510～514)都不利于愈
伤组织生长 ,且组织块变褐。pH为 518最有利于愈
伤组织的形成。
表 1　pH值对愈伤组织诱导和发育的影响
pH值 接种胚数 (个 )
愈伤组
织数
愈伤组织
诱导率
鲜重
( g·瓶 - 1 )
干重
( g·瓶 - 1 )
510 186 84 45116% 0152 01050
514 200 123 61150% 0164 01062
518 195 148 75190% 0189 01083
612 162 97 59188% 0175 01073
616 193 101 52133% 0150 01048
212　生长调节物质对愈伤组织诱导的影响
图 1表明 ,不加 2, 42D的无愈伤组织形成 ;浓度
较低 2, 42D诱导不明显 ;较高浓度 2, 42D的诱导率
有提高。但浓度过高 ( > 310 mg·L - 1 )即有毒害作
用 ,大部分愈伤组织发生褐化 ,甚至死亡。适宜的
2, 42D浓度为 2～215 mg·L - 1。
图 1　激素浓度配比对愈伤组织的影响
213　甘油浓度对愈伤组织生长的影响
从结果可以看出 ,未经保护剂保护的愈伤组织
在经抽真空处理后 ,表面形成薄薄的一层冰层 ,而且
由于失水使其失去原有的脆性并变得绵软 ,存活率
仅为 41856% ,而加入保护剂后 ,这一情况得到不同
程度的改善 ,随着甘油浓度的不断增高 ,愈伤组织表
面不再形成冰层 ,脱水现象也明显减轻 ,甘油浓度
10% ～50% ,细胞活性 33% ～65% ,当甘油浓度超
过 60%后 ,细胞的活力开始下降 (表 2) ,说明高浓
度的甘油极大地改变了细胞的渗透势 ,严重影响了
细胞正常生理活动的进行 ,导致了细胞的损伤甚至
死亡。本试验确定的最佳保护剂为 50%的甘油。
尽管施用 50%甘油能够有效增强愈伤组织抵御真
空的能力 ,但高浓度甘油长时间地作用于细胞 ,势必
会影响到细胞自身的代谢调控 ,对细胞产生负作用。
因此真空处理后的及时清洗很重要。一方面可以洗
掉表面黏着的甘油 ,另一方面细胞复水可以缓解因
真空造成的脱水现象 ,此外还可以降低表层细胞内
部甘油的浓度 ,减弱渗透势过高造成的胁迫。
表 2　甘油浓度对真空中愈伤组织生长的影响
甘油浓度 ( % ) 细胞活性 ( % ) 失水率 ( % )
0 41856 80
10 351392 65
20 331816 60
30 351192 48
40 451552 42
50 651168 39
60 331200 25
70 171672 20
80 341408 12
214　A r+离子的注入剂量对甘油处理后愈伤组织
存活率、失水率和增长的影响
如表 3 所示 ,以能量为 20 keV ,剂量分别为
(216、512、718、1014、13) ×1015 A r+ ·cm - 2的 A r+注
入未经甘油处理的愈伤组织 ,所有的愈伤组织存活
率均为零 ;愈伤组织经甘油处理后再接受离子注入 ,
其存活率随剂量的变化如表 3。当剂量小于 216 ×
1015A r+ ·cm - 2时 ,愈伤组织存活率在 85%以上 ,剂
量升至 718 ×1015 A r+ ·cm - 2时 ,存活率己降至 55%
,剂量达到 13 ×1015 A r+ ·cm - 2时 ,愈伤组织基本不
能存活。以上结果表明经甘油处理后 ,接受离子注
入的愈伤组织的存活率较未经甘油处理的有大幅度
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提高。
经甘油保护后 ,真空处理和注入处理的失水率
较对照降低。表 3所示 ,随着离子注入剂量的增加 ,
经甘油保护的失水率急剧升高 ,基本达到未经甘油
保护的失水率水平 ,说明注入剂量较高时 ,甘油的保
护已基本失去作用。离子注入会在样品表面刻蚀形
成许多孔洞 ,这些孔洞会加剧水分的散失 ,因此甘油
对水分散失的保护作用只能在一定的剂量范围内发
挥作用。
表 3　Ar +离子剂量对愈伤组织存活率和失水率的影响
注入剂量
( ×216 ×1015 ) 存活率 ( % ) 失水率 ( % ) (经甘油保护后注入处理 ) 失水率 ( % ) (未经甘油保护注入处理 )
1 86 12 30
2 80 23 40
3 55 57 62
4 20 75 78
5 6 96 97
外植体置于愈伤组织诱导培养基上 1周后 ,愈伤
组织称重 ,记为 M 1 , 2周后愈伤组织称重 ,记为 M 2。
M 2 /M 1 为第 2周的愈伤组织增长倍数。正常情况下
从外植体放入培养基之日起第 7～14 d的愈伤组织
重量增长率为 2151 (CK) ,不经甘油预处理的愈伤组
织在很小的剂量注入后在培养基上呈水渍状 ,均不能
继续生长。216 ×1015 A r+ ·cm - 2的脉冲剂量注入经
甘油保护后的愈伤组织 ,一周后其重量增长倍数为
2110,基本达到正常。经 512 ×1015 A r+ ·cm - 2的脉冲
剂量注入后 ,愈伤组织重量增长缓慢 ,增长倍数仅为
1175。因此 ,在较低剂量下 ,经甘油预处理的愈伤组
织仍可正常生长 ,注入剂量超过一定的界限 ,愈伤组
织会因受到较大的损伤而停止生长。
3　讨论
在低温保存生物体的方法中 ,玻璃化比冰冻固
化方法引起的结构变化要小 ,而甘油不会引起结构
的变化 ,虽然甘油对水分散失的保护作用只能在一
定的剂量范围内发挥作用 ,但愈伤组织正常增重表
明愈伤组织能够成活 ,因此它是一种较理想的低温
保存生物材料的方法。甘油防护方法与离子束技术
相结合 ,在离子注入活体材料的方法学上是一种有
益的探索。
甘油处理有利于减轻水含量大的生物体在离子
注入过程中的冻害。在一定的剂量范围内 ,甘油处
理的愈伤组织在经离子注入处理后仍能存活 ,这为
直接以活体组织材料作为注入对象进行诱变或转化
找到了一条新途径。试验过程中要注意选择合适的
注入剂量。
参 考 文 献
1 　余增亮 ,霍裕平 1安徽农业大学学报 , 1994, 21 (3) : 221～2251
2 　余增亮 1中国科学院院刊 , 2005, 20 (6) : 520～5231
3 　尹若春 ,吴丽芳 ,郭金华 1激光生物学报 , 2002, 11 ( 3 ) : 207
～2111
4 　卞坡 ,吴健 ,戴桂馥 1郑州大学学报 (自然科学版 ) , 2000, 32
(3) : 28～311
5 　陈书安 ,王晓东 ,赵兵 1过程工程学报 , 2002, 2 (6) : 539～5431
6 　谷运红 ,余增亮 ,秦广雍 ,霍裕平 1植物生理学通讯 , 2003, 39
(5) : 425～4281
7 　杨天佑甘油深护剂对离子注入 E1coli存活的影响及离子束介导
DNA转化 E1coli [硕士学位论文 ] 1郑州 :郑州大学 , 2004, 14
～211
8 　刘华 ,梅兴国 1植物生理学通讯 , 2001, 37 (6) : 537～5391
9 　严庆丰 ,黄纯农 1细胞生物学杂志 , 1994, 16 (3) : 117～1221
10　 Iborra JL, Guardiola J,Montaner S1 B iotechnol Tech, 1992, 15: 1129
～11341
11　Huang H, HongMA1 PlantMol B iol Rep, 1992, 10 (4) : 372～3831
12　谷运红 ,程国旺 ,吴丽芳 ,等 1安徽农业科学 , 2002, 30 ( 5) : 637
～6431
801
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