全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
膨化对转基因豆粕CP4-EPSPS蛋白的影响
田芳1，2 王秀敏2，3 滕达2，3 杨雅麟2，3 敖长金1 王建华2，3
(1内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018;2农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京 100081;
3中国农业科学院饲料研究所基因工程研究室，北京 100081)
摘 要: 旨在研究转基因豆粕经挤压膨化后外源蛋白的变化规律。以 CP4-EPSPS多克隆抗体和转基因含量为 2%的大
豆标准品作为材料，建立 ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆 CP4-EPSPS蛋白的方法。结果表明，膨化豆粕中外源蛋白含
量随着温度和含水率的升高逐渐降低，ELISA法检测低限达到 0． 25%，可以定量检测经过加工的转基因豆粕。
关键词: 酶联免疫吸附法 挤压膨化 转基因豆粕 CP4-EPSPS蛋白
The Effects of Extrusion onCP4-EPSPS Protein in
Genetically Modified Soybean Meal
Tian Fang1，2 Wang Xiumin2，3 Teng Da2，3 Yang Yalin2，3 Ao Changjin1 Wang Jianhua2，3
(1College of Animal Science，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018;
2Key Laboratory of Feed Biotechnology，Ministry of Agriculture，Beijing 100081;
3Gene Engineering Laboratory，Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081)
Abstract: Variation tendency of CP4-EPSPS protein in genetically modified (GM)soybean via extrusion was tested in this
study． The indirect ELISA assay was used to determine the CP4-EPSPS protein content with polyclonal antibody． An ELISA stand-
ard curve was created，and the LOD of ELISA was 0． 25 % ． The results indicated that the content of CP4-EPSPS protein decreased
gradually with the increasing of temperature and moisture． Therefore，this method could be applied to detect the processed GM soy-
bean．
Key words: Enzyme-linked immunosorbent assay Extrusion Genetically modified soybean meal CP4-EPSPS protein
收稿日期:2011-03-16
基金项目:国家转基因生物新品种培育科技重大专项，转基因生物饲料检测与监测技术(2009ZX08012-012B)
作者简介:田芳，女，博士研究生，研究方向:转基因作物产品检测技术;E-mail:tian． f． 1234@ 163． com
通讯作者:王建华，研究员，博士生导师，E-mail:jhwangfribio@ yahoo． com． cn
豆粕富含优质蛋白质，已成为牲畜和家禽饲料
的主要原料。豆粕经过挤压膨化后，其中的抗营养
因子得到钝化，蛋白质消化率得到提高，口感和风味
得到改善，但是在加工过程中由于受到高温、高湿和
各种剪切力作用，发生交联、裂解、改变原有构象、裂
解片段的再交联和热降解反应等各种物理化学变
化［1］。膨化后谷物内部有机物分子结构发生改变，
大分子淀粉和蛋白质被切成小分子物质并形成与原
有物质不同的新物质［2］;蛋白质变性，部分降解，并
且随着物料含水率的增加，蛋白质分子的聚合程度
大大降低［3］。目前我国大量进口并广泛应用的大
豆均为抗草甘膦转基因大豆(roundup ready soy-
bean，RRS) ，由于 CP4-EPSPS 基因在加工过程中会
降解，其表达产物 CP4-EPSPS 蛋白发生热变性，从
而含量发生变化［4 － 6］。
酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immu-
nosorbent assay，ELISA)是以免疫学反应为基础，将
抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作
用相结合起来的一种敏感性较高的试验技术。因其
可以定量，并具有高通量和高灵敏度的特点，在对转
基因表达蛋白的检测中广泛使用。本试验建立了检
测转基因豆粕中 CP4-EPSPS 蛋白的间接 ELISA 方
法，旨在研究豆粕经过膨化后外源蛋白含量的变化
规律。
2011 年第 10 期 田芳等:膨化对转基因豆粕 CP4-EPSPS蛋白的影响
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 材料与仪器 未膨化的转基因豆粕购于
国内市场;0%和 2%抗草甘膦转基因大豆标准粉
(IRMM，Belgium) ，CP4-EPSPS 纯化蛋白粉由本实
验室制备;CP4-EPSPS 多克隆抗体购自北京康为
世纪生物科技有限公司。DSE-25 型同向啮合双
螺杆挤压机;DYY-6C 型电泳仪;HZQ-F100 全温振
荡培养箱;DNM-9602 酶标分析仪;包被抗体的微
孔板(Thermo)。
1. 1. 2 溶液与试剂 蛋白提取液(PBS) ，包被液，
封闭液(PBS + 2% BSA) ，PBST 缓冲液，稀释液
(PBS + 1% BSA) ，终止液(2 mol /L H2SO4) ，山羊抗
兔 IgG (H + L) ，HRP(CWBIO) ，可溶性单组分 TMB
底物溶液(TIANGEN)。
1. 2 方法
1. 2. 1 挤压膨化试验设计 比较相同物料含水率
(39%)不同温度和相同温度(150℃)不同物料含水
率对膨化豆粕 CP4-EPSPS蛋白含量的影响(因素水
平，表 1)。
表 1 因素水平表
因素
水平
1 2 3 4 5 6
挤压温度(℃) 90 105 120 135 150 165
物料含水率(%) 32 35 37 39 41 43
1. 2. 2 蛋白的提取 称取 0. 5 g 经粉碎的样品，加
入 5 mL PBS 缓冲液，置于研钵中研磨 2 － 3 min 后
移至离心管内，冰上放置 1 h，13 375 r /min 4℃ 离心
20 min，取出上清液。
测定样品蛋白质浓度(步骤参见 Brandford 蛋白
质定量试剂盒说明书，TIANGEN)。
1. 2. 3 间接 ELISA方法检测 CP4-EPSPS 蛋白 将
待测样品(100 μL /孔)加入酶标板孔中，每个样品
重复 3 次，封口膜封板，4℃ 包被 18 － 22 h，37℃ 孵
育 1 h，倾去液体;将酶标板倒置在在吸水纸上轻轻
敲击，控出孔内液体，2 倍体积 PBST 洗板，静置
3 min，重复 5 次，每次均在吸水纸上控出液体;加入
封闭液 37℃ 封闭 1 h，洗板同上;加入稀释液以
1∶ 10 000稀释的多克隆抗体(100 μL /孔) ，封口，
37℃ 孵育 1 h ，洗板同上;加入稀释液以 1 ∶ 12 000
稀释的酶标二抗(100 μL /孔) ，封口，37℃ 孵育 1 h ，
洗板同上;加入 TMB 底物溶液(100 μL /孔) ，室温放
置 30 min;加入 2 mol /L H2 SO4(100 μL /孔)终止反
应;酶标仪测定样品 OD450值。
1. 2. 4 间接 ELISA标准曲线的绘制 将总蛋白含
量相同的 2% 与 0% CP4-EPSPS蛋白标准品溶液按
比例混合为 1%、0. 5%、0. 25%和 0. 125%的标准溶
液，用 ELISA 方法进行测定，每个浓度平行测定 3
次，设立空白对照(ELISA 包被液)、阳性对照(CP4-
EPSPS纯化蛋白粉)、阴性对照(不含 CP4-EPSPS 蛋
白的血清)绘制标准曲线。
1. 2. 5 膨化豆粕中 CP4-EPSPS 蛋白质含量的测
定 用间接 ELISA 方法对膨化豆粕中的 CP4-EP-
SPS蛋白进行检测，每个样品平行测定 3 次，并设
立空白对照(ELISA 包被液)、阳性对照(CP4-EP-
SPS纯化蛋白粉)、阴性对照(不含 CP4-EPSPS 蛋
白的血清)。
2 结果
2. 1 间接 ELISA重复性验证
用间接 ELISA 法对总蛋白含量为 100 μg /mL
的 2%转基因大豆标准品进行 3 次平行测定，每次
测定 3 个重复。结果(表 2)显示，2% 转基因大豆
标准品的 OD450平均值为 0. 111，标准差为 0. 006，说
明该 ELISA法重复性较好。
表 2 ELISA法重复性测定
1
1 2 3
2
1 2 3
3
1 2 3
OD450平均值 SD
0. 114 0. 1 0. 1 0. 115 0. 116 0. 112 0. 111 0. 113 0. 115 0. 111 0. 006
322
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
2. 2 间接 ELISA标准曲线的绘制
总蛋白浓度相同的 2%、1%、0. 5%、0. 25%、
0. 125%和 0%的标准溶液的 ELISA 测定结果见表 3。
当浓度为 2%、1%和 0. 5%时，肉眼可见微孔板中溶液
显蓝色或浅蓝色，加终止液后显黄色;当浓度为 0. 25%
时，孔中溶液显色已难看出，加终止液后变化不明显;
浓度为 0. 125%时基本看不出颜色。根据 S /N 值(表
3)可以看出，ELISA法的检测低限为 0. 25%。
表 3 标准蛋白溶液的 ELISA测定结果
含量(% ) OD450均值 标准偏差 OD450校正均值 OD450样本 －空白 S / N
C N C N C N C N
2 0. 126 0. 097 0. 006 0. 014 0. 123 0. 0905 0. 028 0. 008 3. 5
1 0. 113 0. 094 0. 005 0. 005 0. 116 0. 091 0. 021 0. 0085 2. 47
0. 5 0. 113 0. 093 0. 002 0. 005 0. 113 0. 0905 0. 018 0. 008 2. 25
0. 25 0. 108 0. 093 0. 004 0. 005 0. 111 0. 09 0. 016 0. 0075 2. 13
0. 125 0. 116 0. 096 0. 01 0. 01 0. 11 0. 09 0. 015 0. 0075 2. 0
C．校正值，S．样本，N．空白对照;S (C)/ N ＞ 2. 1 判读为阳性
根据表 3 数据，利用 Curve Expert 1. 3 绘制
ELISA标准曲线，如图 1。该标准曲线的回归方程
为:y = 145. 833x － 2. 083，r = 0. 999 4，其中 x 为 450
nm 处吸光值，y 为转基因大豆标准品中 CP4-EPSPS
蛋白的百分含量，r为线性相关系数。r值接近于 1，
表明该标准曲线的线性关系较好。
图 1 ELISA 标准曲线
2. 3 间接 ELISA法定量检测膨化豆粕
相同温度(150℃)不同含水率和相同含水率
(39%)不同温度下膨化豆粕的间接 ELISA 法测定
结果见表 4。可以看出在相同含水率下，当温度在
90 － 135℃ 时，CP4-EPSPS 蛋白的含量均高于
1. 71%，S /N值均大于 2. 48(表 4)。而且，膨化豆粕
CP4-EPSPS蛋白的含量随着温度的升高逐渐降低
(图 2-A) ;当温度达到 150℃时，外源蛋白的含量仅
为 0. 54%，S /N 值为 0. 82;温度至 165℃时，检测不
到该蛋白，说明在高温下外源蛋白已被破坏。
当豆粕在相同温度下(150℃)膨化时，含水率
为 35% 时，测定的 CP4-EPSPS 蛋白的含量为
2. 15%，S /N 值为 2. 52，低于未膨化豆粕中的外源
蛋白的含量(表 5)。当含水率为 37%时，其 S /N 值
为 1. 8，测定的蛋白含量为 1. 27%。此外，CP4-EP-
SPS蛋白的含量随着含水率的增加而逐渐降低(图
2-B) ;当含水率达到 41%时，检测不到外源蛋白，说
明高温膨化时，较高水分会破坏蛋白。作为阳性对
照的 CP4-EPSPS 蛋白纯化冻干粉所测定的蛋白含
量为 102%，其 S /N 值为 3. 82，表明该体系是可
靠的。
表 4 同水分(39%)膨化豆粕的 ELISA检测结果
温度(℃) OD450 含量(%) 阴性对照 OD450 S /N
90 0. 043 4. 19 0. 0093 4. 62
105 0. 036 3. 17 0. 0095 3. 79
120 0. 032 2. 58 0. 0090 3. 56
135 0. 026 1. 71 0. 0105 2. 48
150 0. 018 0. 54 0. 0220 0. 82
165 0. 012 ＜ 0 0. 0140 0. 86
未膨化 0. 047 4. 77 0. 0123 3. 82
CP4-EPSPS
纯化蛋白粉
0. 72 102. 92 0. 0120 60. 0
422
2011 年第 10 期 田芳等:膨化对转基因豆粕 CP4-EPSPS蛋白的影响
0．未膨化豆粕;A．同水分膨化豆粕中 CP4-EPSPSP 蛋白
含量;B．同温度膨化豆粕中 CP4-EPSPSP蛋白含量
图 2 膨化豆粕 CP4-EPSPS蛋白含量
表 5 同温度(150℃)膨化豆粕的 ELISA检测结果
含水率(%) OD450 含量(%) 阴性对照 OD450 S / N
32 0. 033 2. 73 0. 0125 2. 64
35 0. 029 2. 15 0. 0115 2. 52
37 0. 023 1. 27 0. 0128 1. 80
39 0. 018 0. 54 0. 0220 0. 82
41 0. 011 ＜ 0 0. 0172 0. 64
43 0. 008 ＜ 0 0. 0103 0. 78
未膨化 0. 047 4. 77 0. 0123 3. 82
CP4-EPSPS
纯化蛋白粉
0. 72 102. 92 0. 0120 60. 0
3 讨论
目前检测转基因产品的方法主要有基于核酸水
平的 PCR 技术［7，8］和蛋白质水平的免疫学方
法［9，10］。虽然 PCR技术灵敏度较高，但易产生假阳
性，而以检测蛋白质为基础的免疫学检测方法较稳
定，其中 ELISA方法以成本低、灵敏度高、可定量的
优势在转基因产品外源蛋白的检测中得到广泛应
用。ELISA 是应用一个抗体与特定蛋白相结合，第
二抗体将检测信号放大(可选择) ，然后抗体与特定
的酶偶联，该酶的产物会产生显色反应而使结果可
视化，并通过与目标蛋白的标准曲线对比进行结果
的量化。
目前采用 ELISA 方法对转基因大豆进行检测
已有报道［11 － 13］，但是针对深加工产品的外源蛋白检
测的研究较少。Rogan等［14］通过双抗体夹心 ELISA
方法，检测到 0. 25%的大豆原料和 1. 4%的加工豆
粉。在本研究中，膨化豆粕中 CP4-EPSPS 蛋白含量
随着温度和物料含水率的增加而降低，过高温度
(＞ 135℃)和过高湿度(35%)都会造成外源蛋白的
降解。温度达到 165℃时，检测不到 CP4-EPSPS 蛋
白。物料含水率达到 37%时，蛋白含量骤减，虽然
蛋白含量 ＞ 1%，但其 S /N 值小于 2. 1，可判定为阴
性;当膨化豆粕中 CP4-EPSPS蛋白含量 ＜ 1%时，S /N
值均小于 1. 8，判定为阴性，这可能与蛋白的不完整性
有关。此外，发现外源蛋白 CP4-EPSPS 的含量变化
规律与本人所研究的 DNA降解规律是一致的。当温
度为 135℃时，内外源基因迅速降解，至 165℃时，降
解达到最大;物料含水率为 35%时，DNA 降解迅速，
增至 37%时，降解达最大(另有文章说明)。
4 结论
本研究首先建立了 ELISA 法标准曲线，检测
低限可达 0. 25%。另外，探讨了膨化豆粕中外源
蛋白含量的变化规律，发现外源蛋白 CP4-EPSPS
的含量随着温度和含水率的升高呈逐渐降低的
趋势。由于豆粕在加工过程中，内部结构受外力
作用变化复杂，因此蛋白质的降解变化有待于更
深入的研究。
参 考 文 献
［1］Nelson AI，Wijeratne WB，Yeh SW，et al． Dry extrusion as an aid to
mechanical expelling of oil from soybean． J Am Oil Chem Soc，1987，
64(9) :1341-1347．
［2］刘海凤，刘勇．饲料加工工艺对营养物质利用率及畜禽生产性能
的影响．饲料工业，2009，30 (13) :4-6．
522
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
［3］陈锋亮，魏益民，张波．物料含水率对大豆蛋白挤压产品组织化
质量的影响．中国农业科学，2010，43 (4) :805-811．
［4］Chen Y，Ge YQ，Wang Y． Effect of critical processing procedures on
transgenic components in quality and quantity level during soymilk
processing of Roundup Ready Soybean． Eur Food Res Technol，
2007，225 (1) :119-26．
［5］Vijayakumar KR，Martin A，Gowda LR，et al． Detection of genetically
modified soya and maize:Impact of heatprocessing． Food Chemistry，
2009，117 (3) :514-521．
［6］Bogani P，Minunni M，Spiriti MM，et al． Transgenes monitoring in an
industrial soybean processing chain by DNA-based conventional ap-
proaches and biosensors． Food Chemistry，2009，113 (2) :658-664．
［7］Lu IJ，Lin CH，Pan TM． Establishment of a system based on universal
multiplex-PCR for screening genetically modified crops． Anal Bioanal
Chem，2010，396:2055-2064．
［8］Moriuchi R，Monma K，Sagi N，et al． Applicability of quantitative
PCR to soy processed foods containing Roundup Ready Soy． Food
Control，2007，18:191-195．
［9］Bulcke MV，Schrijver AD，Bernardi DD，et al． Detection of genetical-
ly modified plant products by protein strip testing:an evaluation of
real-life samples． Eur Food Res Technol，2007，225:49-57．
［10］Xu WT，Huang KL，Deng AK，et al． Enzyme linked immunosorbent
assay for PAT protein detection in genetically modified rape． Chi-
nese Journal of Agricultural Biotechnology，2006，3:177-181．
［11］雷勃钧，单红，吕晓波，等． PCR-ELISA 法对大豆品种的转基因
定性检测研究．大豆科学，2004，23 (1) :55-58．
［12］刘光明，徐庆研，龙敏南，等．应用 PCR-ELISA 技术检测转基因
产品的研究．食品科学，2003，24 (1) :101-105．
［13］白卫滨，孙建霞，姜桂传，等． ELISA 方法定量检测转基因大豆
及其产品的研究．食品与发酵工业，2007，11 (239) :103-106．
［14］Rogan GJ，Dudin YA，Lee TC，et al． Immunodiagnostic methods for
detection of 5-enolpyruvylshikimate-3-hosphate synthase in Round-
up Ready soybeans． Food Control，1999，10:407-414．
(责任编辑 狄艳红)
622