全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
一种从酵母细胞中提取组蛋白的方法
赵玥 赵宏宇 蔡禄
(内蒙古科技大学数理与生物工程学院，包头 014010;内蒙古科技大学生物工程与技术研究所，包头 014010)
摘 要: 为了制备体外酵母 DNA序列组装核小体所需的组蛋白，利用酸抽提方法从未经饥饿处理和经过不同时间饥
饿处理的酿酒酵母细胞中分离组蛋白，经 SDS-PAGE 电泳分析和 Bradford 法测定蛋白浓度，发现抽提物中含有组蛋白 H1、
H2A、H2B、H3 和 H4，电泳条带位置正确、纯度较高，正常细胞的抽提物中蛋白总量达到 158 μg /mL。试验结果表明该方法可
以提取出较高质量的酿酒酵母组蛋白。
关键词: 酿酒酵母 组蛋白提取 饥饿细胞 核小体定位 体外组装
A Method for Extraction of Histones from Saccharomyces cerevisiae
Zhao Yue Zhao Hongyu Cai Lu
(School of Mathematics Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010;
Institute of Bioengineering ＆ Technology，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010)
Abstract: The work has provided a procedure to obtain the nuclear proteins that are required for assembly of chromatin template
in vitro． Histones were extracted from untreated and starving yeast cells by acid extraction method． The qualities of histones were ana-
lyzed by SDS-PAGE electrophoresis and Bradford method． Histones with satisfactory stability were isolated properly and the protein con-
centrations were 158 μg /mL． The results indicated that this method had the ability to extract histones with high purity and concentra-
tion from Saccharomyces cerevisiae． The work was the basic of studying chromatin assembly in vitro．
Key words: Saccharomyces cerevisiaet Extraction of histones Starvation cell Nucleosome positioning Chromatin assembly
收稿日期:2011-04-12
基金项目:国家自然科学基金资助项目(61072129) ，内蒙古科技大学创新基金项目(2010NC056)
作者简介:赵玥，女，硕士研究生，研究方向:表观遗传学;E-mail:zhaoyue_0512@ 163． com
通讯作者:蔡禄，男，教授，博士生导师，研究方向:生物信息学、表观遗传学;E-mail:nmcailu@ 163． com
核小体是构成真核生物染色质的基本结构单
位，获取基因组中遗传信息的能力依赖于核小体在
DNA上的位置，核小体定位是在表观遗传学水平调
控基因表达的重要层次［1］。研究表明，序列特征在
核小体定位过程中起着重要的作用［2］，在体外研究
依赖于 DNA序列的核小体定位时，需进行 DNA 序
列与组蛋白重组核小体结构的试验，因此获取高质
量的组蛋白成为最基础的工作。已有文献报道，从
小牛胸腺［3］、HeLa细胞［4］和鸡血细胞［5，6］中提取组
蛋白，但是在用于酵母系统核小体重组研究时，其同
源性的差异可能会对试验产生一定的影响。本研究
拟提出一种直接从酵母细胞中提取组蛋白的方法，
并检测其纯度，旨在为基于酵母体系的核小体定位
研究提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
酵母 YPH499 (MATa ura3-52 lys2-801amber
ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1)由美国
新泽西州医学院微生物学与分子遗传学部 Carol S．
Newlon教授赠送。
Yeast extract、Tryptone、Tris Base 及 SDS 购自
OXOID 公司，DTT、PMSF、HEPES、MES、PIPES、Sor-
bitol及牛血清蛋白购自 AMRESCO 公司，TritonX-
100、APS购自 Sigma公司，Sodium butyrate购自WA-
KO公司，NP-40 购自 FLUKA公司，蛋白质分子量标
准(宽)购自 TaKaRa，Zymolyase 购自 ZYMO RE-
SEARCH公司，其他试剂均为国产分析纯。
酵母菌完全培养基 YEPD:1%Yeast Extract，2%
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
Tryptone，2%Glucose，121℃灭菌 20 min。
Buffer A:50 mmol /L Tris-Cl pH7. 5，30 mmol /L
DTT。Buffer S:20 mmol /L HEPES pH7. 4，1. 2 mol /L
Sorbitol。Buffer B:20 mmol /L PIPES pH6. 8，1. 2
mol /L Sorbitol，1 mmol /L MgCl2。Buffer NIB:0. 25
mol /L Sucrose，60 mmol /L KCl，15 mmol /L NaCl，5
mmol /L MgCl2，1 mmol /L CaCl2，15 mmol /L MES
pH6. 6，0. 8% TritonX-100，1 mmol /L PMSF(fresh) ，1
mmol /L NaF(fresh)。Wash Buffer A:10 mmol /L Tris
pH8. 0，0. 5% NP-40，75 mmol /L NaCl，30 mmol /L
Sodium butyrate，1 mmol /L PMSF(fresh) ，1 mmol /L
NaF(fresh)。Wash Buffer B:10 mmol /L Tris pH8. 0，
0. 4 mol /L NaCl，30 mmol /L Sodium butyrate，1
mmol /L PMSF(fresh) ，1 mmol /L NaF (fresh)。
1. 2 方法
1. 2. 1 酵母细胞组蛋白的提取 将酵母菌
YPH499 接种到 150 mL YEPD液体培养基中，30℃，
200 r /min培养过夜;收集酵母细胞，用 30 mL 无菌
水洗涤，6 500 r /min 离心 10 min;重悬到 5 mL Buff-
er A 中，30℃，100 r /min，振荡 15 min;6 500 r /min
离心 10 min，重悬到 10 mL Buffer S 中;6 500 r /min
离心 10 min，重悬到 5 mL Buffer S 中，加 Zymolyase
(10 U /mL)30℃，100 r /min 振荡 60 min;加入冰浴
的 Buffer B 10 mL，6 500 r /min 离心 10 min;连续 3
遍操作:重悬到 5 mL冰浴的 Buffer NIB，放在冰水浴
中 20 min，6 500 r /min 离心 10 min;连续 3 遍操作:
重悬到 5 mL Wash Buffer A，放在冰水浴中 15 min，
离心 10 min;连续 2 遍操作:重悬到 5 mL Wash Buff-
er B，放在冰水浴中 5 min，6 500 r /min 离心 10 min;
重悬到 1 mL 0. 2 mol /L H2 SO4中抽取组蛋白，放在
冰水浴中 1 h，间断的旋涡混合，10 000 r /min 离心
10 min，将悬浮物转移到一个 2 mL 离心管中，加入
三氯乙酸溶液(100% W/V in water) ，终浓度控制到
20%，立即得到组蛋白的沉淀;放在冰水浴上 12 －
14 h，12 000 r /min离心 30 min，再次沉淀悬浮物;用
0. 5 mL冰浴的酸化丙酮(丙酮加入 0. 1% HCl)洗涤
两次，4℃，12 000 r /min，离心 5 min，移除丙酮，放在
冰上空气中干燥，－ 20℃保存，检测时用 50 μL 无菌
水溶解。
1. 2. 2 二次抽提提取组蛋白 取初次酸抽提离心
后的沉淀物，加入 1 mL 0. 2 mol /L H2 SO4中抽取组
蛋白，放在冰水浴中 1 h 间断的旋涡混合，10 000
r /min 离心 10 min，后续步骤同上。
1. 2. 3 饥饿处理酵母细胞提取组蛋白 将酵母菌
YPH499 接种到 300 mL YEPD液体培养基中，30℃，
200 r /min 培养过夜，第二天早晨收集细胞(150
mL) ，将细胞悬浮到无菌水中，30℃，200 r /min 处理
1 h;将其余 150 mL 培养基 30℃，200 r /min 继续培
养 30 min后做同样处理，使其饥饿处理 0. 5 h;按照
上面的方法提取组蛋白。
1. 2. 4 蛋白检测 取 20 μL 提取的组蛋白溶液与
等量的加样缓冲液混合，在沸水浴中煮沸 5 min 后
冷却，用 15%的 SDS-PAGE 电泳、考马斯亮蓝染色
分析。
1. 2. 5 蛋白含量测定 利用 Bradford 法测提取的
组蛋白浓度，选用牛血清蛋白为标准蛋白液，以起始
浓度 20 μg /mL、10 μg /mL为浓度梯度，在紫外 －可
见分光光度计 595 nm 处测定吸光值，各测 3 组，取
平均值。以 A595吸光值为纵坐标，牛血清蛋白的浓
度为横坐标绘制标准曲线，建立回归方程。将提取
的组蛋白配制浓度约 10 － 100 μg /mL 的待测蛋白
质溶液。在紫外 －可见分光光度计 595 nm 处测定
吸光值，各测 3 组，取平均值。若样品值太大或太
小，需要调整稀释倍数。用测得的吸光值代入回归
方程计算出待测蛋白质的含量。
2 结果
2. 1 SDS-PAGE检测组蛋白
对酵母细胞饥饿处理后提取组蛋白，经电泳后
结果见图 1。从图 1 可看出，未经饥饿处理的酵母
细胞组蛋白条带与其他文献中［6］报道的条带完全
相符，条带清晰，位置正确。经过饥饿处理细胞提取
的组蛋白中杂蛋白相比较含量略有减少，这可能是
由于饥饿处理使酵母细胞消耗了一些其他蛋白来维
持生活状态。试验对未做饥饿处理的细胞进行了两
次抽提蛋白，结果见图 2。从图 2 可看出，再次抽提
的组蛋白含量降低，但是分子量较大的杂蛋白明显
减少。
2. 2 组蛋白浓度
以牛血清蛋白为标准蛋白制作的标准曲线结果
见图 3。蛋白浓度 X(μg /mL )与吸光值(A)之间的
622
2011 年第 11 期 赵玥等:一种从酵母细胞中提取组蛋白的方法
回归方程为 Y = 0. 00504X － 0. 00782 ，其相关系数
R2 = 0. 99338 ，经方差检验，P ＜ 0. 0001 。
1．未经饥饿处理的酵母细胞组蛋白;2． 饥饿处理 0． 5 h
的酵母细胞组蛋白;3．蛋白质分子量标准;4．饥饿处理 1
h的酵母细胞组蛋白
图 1 酵母细胞中提取组蛋白电泳结果
1．经过一次抽提的组蛋白;2．经过二次抽提的组白;
3．蛋白质分子量标准
图 2 两次抽提组蛋白的电泳结果
图 3 Bradford法测量蛋白质标准曲线
提取的组蛋白经 Bradford 法测定浓度的结果，
见图 4。从图 4 可看出，同样条件下，未做饥饿处理
的酵母细胞提取的组蛋白浓度较高，饥饿时间越长，
提取的组蛋白浓度越小，与 SDS-PAGE 电泳检测结
果相符。
1．未做饥饿处理的酵母组蛋白样品;2． 饥饿 0. 5 h 的酵母
组蛋白样品;3．饥饿 1 h的酵母组蛋白样品
图 4 提取组蛋白样品的浓度
3 讨论
组蛋白是所有真核生物的细胞核中与 DNA 结
合存在的一类碱性蛋白质，进化上高度保守，主要包
括 H1、H2A、H2B、H3 和 H4 等类型，后 4 种各两个
拷贝聚合形成组蛋白八聚体，构成核小体的核心。
核小体核心颗粒在组蛋白 H1 的作用下形成稳定结
构，进一步组装成高级结构。组蛋白与 DNA组成的
核小体是染色质的基本结构单元，核小体在基因组
上的组装方式及其定位机制的研究，对于理解转录
因子结合和转录调控机制等多种生物学过程具有十
分重要的作用。因此，在染色质尺度上对核小体定
位的研究将有助于加深人们对染色质结构和功能的
理解，但是体内研究核小体定位目前在技术手段上
还存在很大的障碍，体外重组核小体的方法成为了
一种有效的手段［8］。
作为最早被认识、研究得最深入的真核模式生
物之一，酿酒酵母既具有类似原核生物的生长特性，
又具有一般真核生物的分子生物学和细胞生物学特
性，目前被广泛用于表观遗传研究，通过对其基因组
的深入研究将有助于人们了解高等真核生物基因组
的结构和功能［9］。通常来说生物体内的组蛋白和
核小体都不是静态结构，组蛋白会受到一些外在的
修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及糖
722
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
基化等［10］。不同生物体内组蛋白的修饰状态不同，
例如，乙酰化可以降低组蛋白上的正电荷，这样可以
降低与带负电荷 DNA的结合能力，体外试验已经证
明乙酰化可以影响核小体结构的稳定性［11］。Mulvi-
hill等［12］利用不同修饰状态的组蛋白进行核小体体
外组装试验时，发现高乙酰化的组蛋白和低乙酰化
的组蛋白对相同的 DNA 亲和力相差较大。组蛋白
H3、H4 是已知最保守的蛋白质，它们在所有真核生
物中都具有相同功能。H2A、H2B 的类型可在真核
生物中辨认，但其序列在物种间存在差别。因此，从
不同物种体内提取的组蛋白由于同源性差异以及存
在不同的修饰状况，对 DNA 结合能力不同，进而影
响染色质的体外组装能力。目前利用体外组装核小
体试验研究核小体定位及染色质结构时，主要是利
用从含有组蛋白基因重组质粒的大肠杆菌中诱导表
达后纯化，但是由于细菌中缺少一些真核细胞内的
修饰酶，表达的组蛋白修饰状态与酵母细胞不同，所
以在研究酵母 DNA的核小体定位及染色质结构时，
从酵母细胞内提取组蛋白成为一种必要的方法。
4 结论
利用酸抽提的方法从酵母中提取了组蛋白，经
电泳检测条带清晰，位置正确。未做饥饿处理的酵
母细胞提取的组蛋白浓度高，但是含有部分杂蛋白;
从经过不同时间饥饿处理的酵母中提取的组蛋白其
浓度较低，但是杂蛋白含量明显减少;而且随着饥饿
时间的延长，组蛋白和杂蛋白含量都逐渐减少，对于
最佳饥饿时间、抽提组蛋白的活性以及在体外组装
试验还需进一步的探索。该试验方法的建立对于体
外酵母核小体重组试验及进一步在染色质水平研究
基因表达调控奠定了重要基础。
参 考 文 献
［1］Clapier CR，Cairns BR． The biology of chromatin remodeling com-
plexes． Annu Rev Biochem，2009，78:273-304．
［2］Lee W，Tillo D，Bray N，et al． A high-resolution atlas of nucleo-
some occupancy in yeast． Nat Genet，2007，39(10) :1235-1244．
［3］莫志成，张勇，李宏帆，等． 核心组蛋白及染色质组装相关因
子的分离、表达及纯化． 基础医学与临床，2005，25:948-952．
［4］Butt TR，Jump DB，Smulson ME． Nucleosome periodicity in HeLa
cell chromatin as probed by micrococcal nuclease． Proc Natl Acad
Sci，1979，76(4) :1628-1632．
［5］Kaplan N，Moore IK，Fondufe-Mittendorf Y，et al． The DNA-enco-
ded nucleosome organization of a eukaryotic genome． Nature，2009，
458(7236) :362-368．
［6］钟白玉，郝进，郝飞，等． 核小体的提取纯化及鉴定． 第三军医
大学学报，2004，26(24) :2245-2247．
［7］Ren C，Ghoshal K，Zhang L，et al． Peptide massmapping of acety-
lated isoforms of histone h4 from mouse lymphosarcoma cells treated-
with histone deacetylase(HDACs)Inhibitors． J Am Soc Mass Spec-
trom，2005，16(10) :1641-1653．
［8］Li G，Reinberg D． Chromatin higher-order structures and gene regu-
lation． Current Opinionin Genetics ＆ Development，2011，21:
1-12．
［9］刘擎，余龙． 酵母:一种模式生物． 生命的化学，2000，20(2) :
61-65．
［10］阚盛，翟晓巧． 组蛋白修饰与基因调控研究进展． 河南林业科
技，2009，29(1) :36-38．
［11］ Ito T，Ikehara T，Nakagawa T，et al． P300-mediated acetylation
facilitates the transfer of histone H2A-H2B dimmers from nucleo-
somes to a histone chaperone． Genes Dev，2000，14:1899-1907．
［12］Mulvihill DJ，Nichol Edamura K，Hagerman KA，et al． Effect of
CAT or AGG interruptions and CpG methylation on nucleosome as-
sembly upon trinucleotide repeats on spinocerebellar ataxia，type 1
and fragile X syndrome． J Biol Chem， 2005， 280 (6) :
4498-4503．
(责任编辑 李楠)
822