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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
巴西橡胶树线粒体 50S核糖体蛋白
L21 cDNA的克隆与分析
邹智 杨礼富
(中国热带农业科学院橡胶研究所 农业部橡胶树生物学重点开放实验室，儋州 571737)
摘 要: 在橡胶生产中，“死皮”生理综合症严重制约了橡胶树(Hevea brasiliensis)单产的提高。在早期构建的差减文库
中，筛选到一条在死皮植株中下调表达的基因片段，该片段编码的蛋白与线粒体 50S 核糖体蛋白 L21 (mRPL21)同源。通过
ESTs序列拼接和 RT-PCR，获得一条 853 bp的 cDNA序列(命名为 HbmRPL21，GenBank登录号为 HM800425) ，该序列包含一
个完整的开放读码框，编码 271 个氨基酸，理论分子量为 30． 52 kD，等电点为 8． 40。同源比对表明，植物和动物界间 mRPL21
序列差异很大，而植物界内则相对比较保守。生物信息学分析表明，HbmRPL21 是一个包含 Ribosomal_L21p 保守结构域的线
粒体定位蛋白。
关键词: 巴西橡胶树 死皮 线粒体 50S核糖体蛋白 L21
Cloning and Analysis of a cDNA Encoding Mitochondrial
50S Ribosomal Protein L21 from Hevea brasiliensis Muell． Arg．
Zou Zhi Yang Lifu
(Key Laboratory of Rubber Biology，Ministry of Agriculture，Rubber Research Institute，
Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Danzhou 571737)
Abstract: Tapping panel dryness (TPD)syndrome，a phenomenon with tapping incision blocked partly or entirely during latex
exploiting，has become an important factor limiting rubber production for its causing great losses． In preliminary studies，a sequence en-
coding a deduced protein with high similarity to mitochondrial 50S ribosomal protein L21 (mRPL21) ，which is upregulated in the latex
of TPD-affected rubber trees，was isolated by suppression subtractive hybridization (SSH)． Combining ESTs assembling and RT-PCR，a
cDNA called HbmRPL21 with GenBank accession number of HM800425 was cloned． The sequence contains 853 bp in length with an
open reading frame (ORF) ，which encodes a deduced polypeptide of 271 amino acids with a theoretical molecular weight (Mw)of
30. 52 kD and isolectric point (pI)of 8． 40． Similarity search reveals high amino acid sequence identity of mRPL21 from plants，but di-
versity of that between plant and animal kingdom． Bioinformatics analysis suggests HbmRPL21 is a mitochondrion-targeted protein with
a conserved domain of ribosomal_L21p involving translation．
Key words: Hevea brasiliensis Tapping panel dryness syndrome Mitochondrial 50S ribosomal protein L21
收稿日期:2010-10-18
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(YWFZX2010-9) ，公益性行业科技专项经费(nyhyzx07-033-1)
作者简介:邹智，男，硕士，研究方向:植物基因工程和橡胶树抗逆生物学;E-mail:zouzhi2008@ 126． com
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell． Arg．)是天
然橡胶的主要来源。由于宜胶地有限，增加单位面
积产量几乎成为提高天然橡胶产量的唯一途径。然
而，在橡胶生产中，“死皮”(tapping panel dryness
syndrome)生理综合症严重制约了橡胶树单产的提
高。“死皮”的主要特征是橡胶树产排胶过程中割
线局部或全部不排胶［1］，每年给橡胶生产造成的干
胶损失超过 15%［2］。由于“死皮”成因复杂，人们
至今对“死皮”的发生发展规律知之甚少。为揭示
“死皮”发生的分子机理，早前本课题组以橡胶树无
性系 RRIM 600 的胶乳为材料，利用抑制性消减杂
交技术构建了“死皮”植株与健康植株的差减文库，
2011 年第 3 期 邹智等:巴西橡胶树线粒体 50S核糖体蛋白 L21 cDNA的克隆与分析
从中筛选到一条编码蛋白与线粒体 50S核糖体蛋白
L21 (mRPL21)同源的基因片段，该片段在“死皮”
植株中呈下调表达。文章首次报道了 mRPL21 的
cDNA 序列，通过对其进行了深入的生物信息学分
析，以期为进一步揭示 mRPL21 在橡胶树“死皮”中
的生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1. 1. 1 基因克隆所用植物材料巴西橡胶树无性系
RRIM 600 种植于海南省八一农场 303 队，1970 年
定植，割胶后收集胶乳作为试验材料。
1. 1. 2 菌株和质粒 大肠杆菌(Escherichia coli)菌
株 JM109 由本实验室保存，克隆载体 pMD18-T 购自
TaKaRa公司。
1. 1. 3 酶、试剂盒及生化试剂 mRNA分离纯化试
剂盒(Promega公司) ，RevertAidTM cDNA第一链合成
试剂盒(Fermentas公司) ，胶回收试剂盒(Axygen 公
司) ，PCR 产物纯化试剂盒、小型质粒提取试剂盒、
TaKaRa LA Taq、T4 DNA连接酶、限制性内切酶及其
他工具酶均购自大连宝生物工程有限公司和基因公
司，其他生化试剂为进口或国产分析纯，PCR 引物
的合成和基因的序列测定委托北京三博远志生物有
限责任公司完成。
1． 2 方法
1． 2． 1 胶乳的采集与总 RNA的提取 参照文献［3］。
1． 2． 2 RNA纯度和完整性鉴定 RNA的纯度测定
采用紫外分光光度法，检测 OD230、OD260和 OD280值;
完整性采用 1． 2%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测。
1． 2． 3 mRNA 的分离与纯化 参照 polyA Ttract
Systems Ш试剂盒说明书。
1． 2． 4 cDNA 第一链的合成 参照 RevertAidTM试
剂盒说明书。
1． 2． 5 目标基因的 RT-PCR 克隆与序列测定 将
消减杂交所分离到 EST 序列对 NCBI 中橡胶树的
ESTs库进行 Blastn，下载相似性高的序列，进行人工
拼接后，将获得的序列进行第二轮 Blastn，如此循
环，直到序列不能再延长为止。然后根据序列信息，
采用 Primer 3 设计如下两条引物，HbmRPL21 F:5-
TGCATCACCAGCAGCCATGG-3;HbmRPL21 R:5-
TCGGTCAGAGGAAAATCCCTCC-3。
以合成的 cDNA为模板进行 PCR 反应，反应体
系:1 μL 模板 cDNA，5 μL 10 × PCR buffer，4． 5 μL
25 mmol /L MgSO4，4． 5 μL 2 mmol /L dNTP，0． 2 μL
25 μmol /L HbmRPL21 F，0． 2 μL 25 μmol /L HbmR-
PL21 R，1． 0 μL 1 U /μL TaKaRa LA Taq，加 ddH2O
至 50 μL。用 PE9700 PCR 仪进行 PCR 反应，反应
程序:94℃预变性 3 min;然后 94℃ 30 s，58℃ 30 s，
65℃ 40 s，25 个循环;再 68℃延伸 5 min。吸取 2． 5
μL PCR产物与 2． 5 μL溴酚蓝混匀后用 1． 0%琼脂
糖凝胶进行电泳后，经溴化乙锭(EB)染色，再紫外
成像检测。
PCR产物挖胶回收后连接到 pMD18-T上，用热
激法导入 JM109 感受态细胞后，进行蓝白斑筛选、
PCR验证及质粒酶切电泳后，取处于对数生长期的
阳性菌液 1 mL 用 400 μL 4℃预冷的 50%甘油保
存，委托北京三博远志生物有限责任公司用 M13 + /
M13 －进行双向测序。
1． 2． 6 基因序列的生物信息学分析 同源性分析
采用 Blast;基因编码区的预测采用 ORF Finder;多
序列比对和进化树的构建采用 ClustalW2;蛋白一级
结构分析采用 ProtParam;保守结构域和模块搜索采
用 CDD、InterPro Scan 和 MEME;翻译后修饰采用
MotifScan;亚细胞定位分析采用 WoLF PSORT、Pre-
dotar、TargetP和 MITOPROT;跨膜结构域的预测采
用 TMHMM。
2 结果与分析
2． 1 RNA纯度和完整性
紫外分光光度计测定表明，总RNA的OD260 /OD280
比值为 1． 98，OD260 /OD230比值为 2． 14;甲醛变性琼脂糖
凝胶电泳检测显示，总 RNA的 28S、18S rRNA两条带
清晰明亮、无拖尾，且 28S 带的亮度差不多是 18S 的 2
倍(未显示)，这表明试验所提取的总 RNA质量较高、
完整性好，可以满足下一步试验的要求。
2． 2 目标基因的电子克隆及 RT-PCR分离
经过多轮 Blastn分析，获得一条 1 036 bp 的重
叠群，该序列包含一条 816 bp 的完整 ORF，102 bp
的 5 UTR和 118 bp的 3 UTR(未显示)。根据该序
列，在靠近编码区启始密码子和终止密码子附近设
计 HbmRPL21 F 和 HbmRPL21 R 两条引物，通过
RT-PCR成功获得一 853 bp的 cDNA序列(GenBank
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
登录号:HM800425) ，与电子克隆到序列的相应区
域完全一致，将该序列的编码基因命名为 HbmR-
PL21。
2． 3 HbmRPL21 的生物信息学分析
2． 3． 1 HbmRPL21 基因及其编码蛋白的一级结构
分析 序列分析表明，HbmRPL21 长 853 bp，包含
16 bp 的 5 UTR 和 21 bp 的 3 UTR，其 ORF 编码
271 个 AA，理论分子量为 30． 52 kD，等电点为
8. 40，带电荷数为 + 4． 26，包含 42 个强碱性氨基酸
(K，R) ，39 个强酸性氨基酸(D、E) ，89 个疏水氨基
酸(A、I、L、F、W 和 V)和 65 个极性氨基酸(N、C、
Q、S、T和 Y) ，总平均亲水性(GRAVY)为 － 0． 538，
不稳定系数(II)为 43． 50，半衰期在 30 h 以上，这表
明该蛋白为不稳定的亲水性蛋白。
2． 3． 2 同源比对 同源分析表明，mRPL21 在高等
植物中非常保守，如 HbmRPL21 与蓖麻(Ricinus
communis，XP_002519068，RcmRPL21)、拟南芥(Ara-
bidopsis thaliana，NP _ 567861，AtmRPL21)和水稻
(Oryza sativa，NP_001056292，OsmRPL21)中相关蛋
白的相似性依次为 70%、55%和 54%，与藻类植物
中相关蛋白的相似性也在 20%以上。如与莱茵衣
藻(Chlamydomonas reinhardtii，XP_001694543，Crm-
RPL21)的相似性为 23%;HbmRPL21 与非光合细菌
和动物的相似性非常低，如与大肠杆菌(E． coli，NP_
289760，EcmRPL21)和人(Homo sapiens，EAW74727，
HsmRPL21)的相似性分别为 12． 9%和 13． 7%(图 1，图
2)。因此推测，动植物中 mRPL21 可能朝着不同的
方向进化。基因组搜索表明，mRPL21 基本上由单
基因编码，在拟南芥中找到 3 个包含 Ribosomal _
L21p结构域的蛋白，即 AtmRPL21 (NP_567861)、
CAA18200 和 AtcRPL21 (NP _174808) ;CAA18200
除含有一个 Ribosomal_L21p 结构域外，还包含两个
与 DNA结合的 WRKY结构域，其功能还不清楚;At-
cRPL21是 AtmRPL21 的叶绿体同源蛋白，两者的相
似性为27． 3%。估计橡胶树中也可能存在 CAA18200
和 AtcRPL21类似的蛋白。
图 1 线粒体 50S核糖体蛋白 L21 的多序列比对
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2011 年第 3 期 邹智等:巴西橡胶树线粒体 50S核糖体蛋白 L21 cDNA的克隆与分析
图 2 线粒体 50S核糖体蛋白 L21 的进化树
2． 3． 3 保守结构域分析 结构域搜索显示，HbmR-
PL21 含有一个 mRPL21 或 RPL21p类蛋白所特有的
Ribosomal_L21p保守结构域(图 3) ，其共有序列为
A(X)6 Q(X)2 V(X)24 VL(X)10 GXP;MEME 显示，
HbmRPL21 包含 3 个模块(Motif) ，模块 1 为［DW］
［CL］［SV］F［KW］PY (即 60 － 66 位的 WCSFWPY
和132 － 138位的 DLVFKPY) ，模块 2 为［GR］［DR］
C［IL］［FH］T (即 4 － 9 位的 RRCLHT 和 157 － 162
位的 GDCIFT) ，模块 3 为［CQ］［IK］［GS］SH［QV］F
(即 47 － 53 位的 CKSSHVF 和 146 － 152 位的 QIG-
SHQF)。
图 3 线粒体 50S核糖体蛋白 L21 的保守结构域分析
2． 3． 4 翻译后修饰、亚细胞定位和跨膜结构域分析
MotifScan 显示，HbISU1 序列的 54 － 57、76 － 79、
80 － 83、89 － 92、94 － 97、109 － 112、155 － 158 和 194
－ 197 位为潜在的酪氨酸蛋白激酶 II (Casein kinase
II)磷酸化位点，40 － 42 和 162 － 164 为蛋白激酶 C
(Protein kinase C)磷酸化位点。
亚细胞定位分析表明，HbmRPL21 确实是一个
线粒体定位蛋白(TargetP 预测的概率为 0． 81%，
MITOPROT预测的概率为 0． 96%) ;MITOPROT 预
测 HbmRPL21 序列的 79 － 80 位为信号肽切割位
点，但 SignalP分析表明序列的 20 － 21 为最大可能
的切割位点，因此 HbmRPL21 的确切切割位点还
有待蛋白鉴定分析。TMHMM 分析没有发现跨膜
结构域。
3 讨论
研究表明，线粒体既是细胞的能量供应中心，同
时也是细胞的凋亡调控中心［4］。线粒体中含有大
量的凋亡因子，在凋亡发生过程中，线粒体膜透性增
大，凋亡因子释放进入胞质，进而诱导细胞的凋亡。
在橡胶树“死皮”发生过程中，凋亡抑制因子表达水
平降低，而凋亡诱导因子上调，为此有人认为橡胶树
“死皮”的本质是乳管细胞的程序化衰亡过程［5 － 8］。
虽然这种假说具有一定的可信性，但还需要更多的
证据(特别是相关的分子证据)。为揭示“死皮”发
生的分子机理，本课题组构建了“死皮”植株与健康
植株的差减文库，从中筛选到一条在“死皮”植株中
呈下调表达的基因片段。同源比对表明，该片段编
码的蛋白与线粒体 50S 核糖体蛋白 L21 (mRPL21)
的相似性非常高。本研究通过电子克隆和 RT-PCR，
从橡胶树胶乳中成功分离到该基因的 cDNA 序列
(HbmRPL21) ，序列分析表明 HbmRPL21 编码 271 个
氨基酸，理论分子量为 30． 52 kD，等电点为8． 40，属于
不稳定的亲水性蛋白;在植物和动物界，mRPL21 序
列差异很大，而植物界内则相对比较保守;HbmRPL21
无跨膜结构域，线粒体定位，包含一个 Ribosomal _
L21p保守结构域。目前关于 mRPL21 的相关报道较
少，在模式植物拟南芥中的研究表明，AtmRPL21 组成
型表达，参与细胞核的融合，其突变会导致雌配子发
育和受精过程受阻［9］。由于早期研究显示，死皮树中
核酸和蛋白含量显著低于健康植株［10］，HbmRPL21
基因在“死皮”橡胶树胶乳中转录水平的下调是否也
意味着死皮树的线粒体甚至是整个胶乳细胞代谢活
性降低，就目前而言这只能是一种推测，HbmRPL21
基因在“死皮”中确切功能以及“死皮”发生的分子机
理还有待进一步研究。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)
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