全 文 ：植物科学学报　 ２０１６ꎬ ３４(２): ２５５~２６２
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ.ｃｎ
ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５￣０８３７􀆰 ２０１６􀆰 ２０２５５
欧阳沫ꎬ 唐潇ꎬ 黄惜ꎬ 袁红梅. 巴西橡胶树 ＨｂＩＣＥ１基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选[ Ｊ] . 植物科学学报ꎬ ２０１６ꎬ ３４(２):
２５５－２６２
Ｏｕｙａｎｇ Ｍꎬ Ｔａｎｇ Ｘꎬ Ｈｕａｎｇ Ｘꎬ ＹＵＡＮ ＨＭ. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ
ＨｂＩＣＥ１ ｉｎ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２０１６ꎬ ３４(２): ２５５－２６２
巴西橡胶树 ＨｂＩＣＥ１基因酵母双杂交诱饵
载体的构建及互作蛋白的筛选
欧阳沫ꎬ 唐 潇ꎬ 黄 惜ꎬ 袁红梅∗
(海南大学农学院ꎬ 海口 ５７０２２８)
摘　 要: 寒害是我国植胶区的主要自然灾害之一ꎬ 不仅影响橡胶产量还威胁到橡胶树的生存ꎮ 拟南芥中ꎬ ＩＣＥ１
是低温胁迫信号通路中的重要转录激活因子ꎬ 但橡胶树冷胁迫信号途径中包括 ＨｂＩＣＥ１ 在内的大部分关键基因
尚未被克隆与鉴定ꎬ 与 ＨｂＩＣＥ１蛋白发生互作的蛋白也不清楚ꎬ 成为严重阻碍橡胶树抗寒分子机理研究的瓶颈ꎮ
为了筛选和鉴定与巴西橡胶树 ＨｂＩＣＥ１ 蛋白发生互作的蛋白ꎬ 阐明橡胶树抵御寒害胁迫的分子机理ꎬ 本文首先
通过 ＰＣＲ扩增出 ＨｂＩＣＥ１基因的编码序列(约 １４００ ｂｐ)ꎬ 然后将目标序列插入 ｐＧＢＫＴ￣７载体ꎬ 构建酵母双杂交
诱饵载体ꎻ 将该载体转入酵母 Ｙ２Ｈ菌株感受态细胞中ꎬ 并在缺陷型培养基上检测其自激活活性ꎬ 发现 ＨｂＩＣＥ１
基因的自转录激活在含有 ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ和更高浓度 ３￣ＡＴ(３￣氨基￣１ꎬ２ꎬ４￣三氮唑)的培养基上能得到有效抑制ꎻ 进
一步通过与橡胶树 ｃＤＮＡ文库进行酵母双杂交ꎬ 筛选出一些可能与 ＨｂＩＣＥ１发生互作的蛋白ꎬ 包括 ＤＮＡ结合蛋
白、 核糖体蛋白和功能未知蛋白ꎮ 本研究结果为橡胶树抗寒机理研究提供了重要理论依据ꎮ
关键词: 巴西橡胶树ꎻ ＨｂＩＣＥ１ꎻ 酵母双杂ꎻ 蛋白互作ꎻ 冷耐受
中图分类号: Ｑ９４３　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１６)０２￣０２５５￣０８
　 　 　 收稿日期: ２０１５￣１２￣２４ꎬ 退修日期: ２０１６￣０１￣２０ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金项目(３１５６０１９７)ꎻ 海南省自然科学基金项目(２０１５３０９２)ꎻ 海南省教育厅项目(Ｈｎｋｙ２０１５￣４)ꎻ 海南大
学科研启动基金资助(ｋｙｑｄ１４３７)ꎮ
Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｇｒａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (３１５６０１９７)ꎬ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｈａｉｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ (２０１５３０９２)ꎬ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈａｉｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ (Ｈｎｋｙ２０１５￣４)ꎬ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅ￣
ｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (ｋｙｑｄ１４３７) .
　 作者简介: 欧阳沫(１９９１－)ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为植物抗逆分子生物学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ６１７８５６０２３＠ｑｑ􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｕａｎｈｏｎｇｍｅｉ＠ｈａｉｎｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ Ｂａｉｔ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＨｂＩＣＥ１ ｉｎ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ
ＯＵＹＡＮＧ Ｍｏꎬ ＴＡＮＧ Ｘｉａｏꎬ ＨＵＡＮＧ Ｘｉꎬ ＹＵＡＮ Ｈｏｎｇ￣Ｍｅｉ∗
(Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｉｋｏｕ ５７０２２８ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｏｌｄ ｓｔｒｅｓｓ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｉｓｓｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｕｂｂｅｒ ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｒｅａｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ. Ｉｔ ｎｏｔ ｏｎｌｙ
ａｆｆｅｃｔｓ ｒｕｂｂｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎꎬ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｔｈｒｅａｔｅｎｓ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ. ＩＣＥ１ ｉｓ ａ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ.. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ
ｍｏｓｔ ｋｅｙ ｇｅｎｅｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＨｂＩＣＥ１ꎬ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ
(Ｗｉｌｌｄ. ｅｘ Ａ. Ｊｕｓｓ.) Ｍｕｅｌｌ. ｈａｖｅ ｎｏｔ ｙｅｔ ｂｅｅｎ ｃｌｏｎｅｄꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ
ＨｂＩＣＥ１ ａｒｅ ｕｎｃｌｅａｒꎬ ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ｈａｍｐｅｒｅｄ ｔｈｅ ａｄｖａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ
ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｈ. ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ. Ｗｅ ｃｌｏｎｅｄ ＨｂＩＣＥ１ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｔｓ ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒꎬ ａｎｄ ｔｈｅｎ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ ｉｎｔｏ ｙｅａｓｔ Ｙ２Ｈ ｓｔｒａｉｎ. Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｐｌａｔｅｄ
ｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｂａｉｔ ａｕｔｏ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ. Ｔｈｅ ａｕｔｏ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＨｂＩＣＥ１ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ
ｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ (ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅ) ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣ＡＴ (３￣ａｍｉｎｏ￣１ꎬ
２ꎬ４￣ｔｒｉａｚｏｌｅ) ａｎｄ ｈｉｇｈｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ. Ｔｈｅｒｅａｆｔｅｒꎬ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＨｂＩＣＥ１
ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ＤＮＡ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ
ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ’ｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｏｌｄ ｓｔｒｅｓｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓꎻ ＨｂＩＣＥ１ꎻ Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄꎻ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎꎻ Ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｔｏｌｅ￣
ｒａｎｃｅ
　 　 巴西橡胶树(Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ (Ｗｉｌｌｄ. ｅｘ Ａ.
Ｊｕｓｓ.) Ｍｕｅｌｌ.)原产于亚马逊森林ꎬ 为多年生落叶
乔木ꎬ 是典型的热带雨林树种ꎬ 在高温、 高湿、 静
风和土壤肥沃的环境下生长良好ꎬ 但对低温非常敏
感ꎬ 不耐寒[１]ꎮ 目前ꎬ 世界上主要产胶国家均位
于适宜橡胶树种植的气候带内ꎬ 如马来西亚、 泰
国、 印度尼西亚等ꎻ 而中国植胶区属于热带季风气
候ꎬ 主要分布在海南、 广东、 广西、 福建、 云南ꎬ
并经常遭受低温和台风等自然灾害的侵袭ꎮ 寒害是
我国植胶区的主要自然灾害之一ꎬ 不仅影响橡胶产
量ꎬ 而且直接威胁着橡胶树的生存[２]ꎬ 如 ２００８ 年
初的寒潮使树木大面积枯死ꎬ 给我国橡胶产业带来
了重大经济损失ꎮ 虽然橡胶树已被成功引入我国ꎬ
但寒害仍是限制植胶业发展的瓶颈ꎬ 因此解析橡胶
树抵御寒害胁迫的分子机理是天然橡胶生产中急需
解决的重大理论问题之一ꎮ
植物在低温防御中ꎬ 一系列转录因子以及冷
调控基因 ＣＯＲ(Ｃｏｌｄ￣Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ)被诱导表达以提
高植物适应低温胁迫的能力ꎮ 在模式植物拟南芥
中ꎬ 植物抵御低温胁迫的 ＩＣＥ￣ＣＢＦ转录级联反应
的信号转导途径[３]及该通路中的关键调控基因已
研究得较为清晰ꎮ ＩＣＥ￣ＣＢＦ信号转导作用模式为:
ＩＣＥ１ ( Ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ＣＢＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ) 是 ＣＢＦ ( Ｃ￣
ｒｅｐｅａｔ￣Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ)基因的转录激活因子ꎬ 它
编码一个类似 ＭＹＣ 型的 ｂＨＬＨ(ｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ￣ｌｏｏｐ￣
ｈｅｌｉｘ)转录因子ꎻ 在低温环境下ꎬ ＩＣＥ１可以特异性
结合到 ＣＢＦ３ 启动子中 ＭＹＣ 识别核心序列
(ＣＡＮＮＴＧ)的顺式作用元件上ꎬ 进而调控 ＣＢＦ３
的表达[４]ꎮ ＣＢＦ 是一类能够特异性结合到以
ＣＣＧＡＣ为核心序列的 ＣＲＴ / ＤＲＥ(Ｃ￣Ｒｅｐｅａｔ / Ｄｅ￣
ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ)核心元件的转录因
子ꎻ 在低温诱导下ꎬ ＣＢＦ 的表达量会迅速提高ꎬ
并通过结合到下游功能基因 ＣＯＲ 启动子的 ＣＲＴ /
ＤＲＥ元件上而激活 ＣＯＲ等冷诱导基因的表达ꎬ 从
而促进植物的抗寒性[５ꎬ６]ꎮ 拟南芥的 ＣＢＦ 家族共
有 ＣＢＦ１、 ＣＢＦ２、 ＣＢＦ３、 ＣＢＦ４ 四个成员ꎬ 其中
ＣＢＦ１、 ＣＢＦ３过量表达植株的抗寒能力均明显优
于野生型拟南芥[７ꎬ８]ꎮ 目前ꎬ 拟南芥 ＩＣＥ 家族只有
ＩＣＥ１和 ＩＣＥ２两个同源基因ꎬ 其中 ＩＣＥ１ 过量表达
植株的耐寒性明显强于野生型拟南芥ꎻ ＩＣＥ２ 过量
表达植株的抗寒性也很强ꎬ 且能在－２０℃的极端低
温环境下存活并正常生长ꎬ 同时该过量表达植株中
ＣＢＦ１的表达水平也明显增强[９]ꎮ 此外ꎬ 拟南芥突
变体 ｉｃｅ１对冷胁迫表现为超敏感ꎬ 对其转录组数
据的分析结果表明ꎬ ４０％冷胁迫调控基因、 ４６％冷
胁迫调控的转录因子的表达量都处于下调趋势ꎻ 参
与钙信号、 受体蛋白激酶以及脂质信号的冷诱导基
因表达也受到了影响[１０]ꎮ 进一步对突变体 ｉｃｅ１ 以
及 ＩＣＥＩ转基因拟南芥冷应答的转录组芯片数据进
行生物信息学分析发现ꎬ ＩＣＥ１ 在低温胁迫的信号
途径中是一个至关重要的转录激活因子ꎬ 并在
ＩＣＥ￣ＣＢＦ转录级联反应的转录水平调控网络中发
挥着重要作用[１１]ꎻ Ｒ２Ｒ３ 型转录因子 ＭＹＢ１５ 能与
ＩＣＥ１相互结合ꎬ 并共同结合到 ＣＢＦ启动子区 Ｍｙｂ
识别位点ꎬ 负调控 ＣＢＦ 的表达[１２]ꎻ ＳＩＺ１ (Ｓｍａｌｌ
Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｅ３ ｌｉｇａｓｅ)和 ＨＯＳ１(泛
素 Ｅ３连接酶)可以从翻译后水平修饰 ＩＣＥ１ꎬ 进而
调控 ＩＣＥ￣ＣＢＦ 信号通路[１３ꎬ１４]ꎮ Ｄｉｎｇ 等[１５]研究发
现ꎬ 磷酸激酶ＯＳＴ１(Ｏｐｅｎ Ｓｔｏｍａｔａ １)能够磷酸化
ＩＣＥ１并且稳定 ＩＣＥ１ 蛋白ꎬ 从而增强植物抗冷性ꎬ
揭示 ＩＣＥ１ 是低温胁迫信号传递通路中重要的转录
激活因子ꎬ 是连接冷信号和下游应答基因的关键因
子ꎮ Ｈｕａｎｇ 等[１６] 从枳 ( Ｐｏｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ ( Ｌ.)
Ｒａｆ.)中克隆了 ＰｔｒＩＣＥ１ 基因ꎬ 其在柠檬和烟草中
过量表达植株的抗寒能力明显强于野生型ꎻ 进一步
研究表明ꎬ ＰｔｒＩＣＥ１是通过与精氨酸脱羧酶相互作
用调控多胺的含量来增强植物的抗寒性[１６]ꎮ 目前
对橡胶树抗寒机理的研究主要集中在形态及生理特
６５２ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
性上[１７－１９]ꎬ 而对其抗寒分子机制涉及较少ꎬ 调控
机理还不清楚ꎬ 仅见 ＨｂＣＢＦ１ 基因被克隆与鉴
定[２０]ꎮ 该信号通路的大部分基因尚未被克隆与鉴
定ꎬ 已成为橡胶树抗寒机理研究的瓶颈ꎮ
为了筛选和鉴定与 ＨｂＩＣＥ１蛋白发生互作的蛋
白ꎬ 阐明橡胶树抵御寒害胁迫的分子机理ꎬ 本文在
前期实验克隆出橡胶树 ＨｂＩＣＥ１基因的基础上ꎬ 将
其 ｃＤＮＡ阅读框序列插入 ｐＧＢＫＴ￣７载体ꎬ 构建酵
母双杂交诱饵载体 ｐＧＢＫＴ７￣ＨｂＩＣＥ１ꎻ 再将该载体
转入酵母 Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ菌株感受态细胞中ꎬ 并在缺陷
型培养基上检测其自激活活性ꎻ 最后利用橡胶叶片
和胶乳的 ｃＤＮＡ 文库进行酵母双杂交ꎬ 筛选与
ＨｂＩＣＥ１发生相互作用的蛋白ꎮ 这些相互作用的蛋
白中包括转录因子、 组蛋白和功能未知蛋白ꎬ 将为
橡胶树抗寒机理研究提供重要理论依据ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料及试剂
酵母 Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ 菌株、 酵母双杂交载体 ｐＧ￣
ＢＫＴ￣７ 均购于 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 公司 ( ｗｗｗ. ｃｌｏｎｔｅｃｈ.
ｃｏｍ)ꎻ酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文库购于上海海科生物
技术有限公司ꎮ 限制性内切酶、 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶分
别购买于 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公司和 ＮＥＢ (北京)公司ꎻ
３￣ＡＴ(３￣氨基￣１ꎬ２ꎬ４￣三氮唑)购于 ｓｉｇｍａ 公司ꎮ 质
粒提取试剂盒、 ＤＮＡ 凝胶回收试剂盒均购于生工
生物工程上海(股份)有限公司ꎮ
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 酵母双杂交诱饵载体 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１的
构建
根据电子克隆得到的 ＨｂＩＣＥ１ ｃＤＮＡ 序列ꎬ 设
计分别带有 ＥｃｏＲⅠ、 ＰｓｔⅠ酶切位点的引物 Ｐ１(５′￣
ＣＧＧＡＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣＣＧＡＣＴＧＧＴＡ￣３′) 和
Ｐ２(５′￣ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＣＡＧ￣
３′)ꎬ 然后利用高保真酶 Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲＴＭ 从橡胶树
叶片 ｃＤＮＡ 中扩增出 ＨｂＩＣＥ１ 的编码序列ꎮ ＰＣＲ
反应程序: ９８℃变性 １０ ｓꎬ ５５℃退火 １５ ｓꎬ ７２℃
延伸 ９０ ｓꎬ ３０ 个循环ꎮ ＰＣＲ 扩增产物经 １􀆰５％琼
脂糖凝胶电泳检测ꎬ 并将符合预期片段大小的条带
回收ꎬ 然后用 ＥｃｏＲⅠ和 ＰｓｔⅠ对其及载体 ｐＧＢＫＴ￣
７分别进行双酶切ꎬ 电泳检测酶切完全后进行胶回
收ꎻ 回收胶经 １􀆰５％琼脂糖凝胶电泳检测为正确的目
的片段后ꎬ 再将回收到的酶切后的目的片段
ＨｂＩＣＥ１和表达载体 ｐＧＢＫＴ￣７用 Ｔ４￣ＤＮＡ连接酶进
行连接ꎻ 连接产物 １６℃过夜再转化大肠杆菌 ＤＨ５αꎻ
次日对菌落进行 ＰＣＲ检测并对获得的阳性克隆菌进
行质粒提取ꎻ 取少量构建好的 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１
载体质粒再次用 ＥｃｏＲⅠ和 ＰｓｔⅠ双酶切进行检测ꎬ
并将检测正确的阳性克隆进行测序ꎬ 若测序结果比
对成功即酵母双杂交诱饵载体构建完成ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 诱饵载体 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１自激活检测及
酵母双杂交筛选
参照 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ操作手册(Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ􀆰 ＰＴ４０８４￣
１)具体步骤ꎬ 将 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ 载体转化酵母
Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ 菌株ꎻ 对菌落进行 ＰＣＲ 检测并将阳性
单菌落摇菌培养ꎬ 分别接种到 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ、 ＳＤ / ￣
Ｔｒｐ / Ｘ￣α￣Ｇａｌ、 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / Ｘ￣α￣Ｇａｌ / ＡｂＡ、 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣
Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅ、 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅ / １０ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣ＡＴ、
ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅ / ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣ＡＴ、 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣
Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅ / ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣ＡＴ、 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅ /
５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣ＡＴ、 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅ / ７０ ｍｍｏｌ / Ｌ
３￣ＡＴ平板培养基上ꎻ ３０℃培养 ３ ~ ５ ｄ 后ꎬ 观察
酵母菌落在各个选择培养基上的生长情况ꎬ 并对细
胞毒性及转录自激活活性进行鉴定ꎮ 酵母双杂交文
库在使用前已做过文库质粒鉴定及文库滴定实验ꎬ
且检测结果合格ꎬ 可利用其与构建的双杂交诱饵载
体直接进行酵母双杂交筛选ꎬ 具体步骤参考 Ｃｌｏｎ￣
ｔｅｃｈ操作手册 ＰＴ４０８４￣１进行ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 ＨｂＩＣＥ１基因的克隆及酵母双杂交诱饵载体
的构建
利用高保真酶 Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲＴＭ 和引物 Ｐ１、
Ｐ２ꎬ 从橡胶树叶片 ｃＤＮＡ 中 ＰＣＲ 扩增 ＨｂＩＣＥ１ 的
编码序列ꎮ ＰＣＲ扩增产物经 １􀆰０％琼脂糖凝胶电泳
检测显示ꎬ 条带大小约 １４００ ｂｐꎬ 与预期片段大小
一致 (图 １: Ａ)ꎮ 将目的条带割胶回收后ꎬ 用
ＥｃｏＲⅠ和 ＰｓｔⅠ对其及 ｐＧＢＫＴ￣７ 载体分别进行双
酶切ꎬ 电泳检测酶切完全后进行胶回收ꎻ 利用 Ｔ４￣
ＤＮＡ连接酶将酶切后的 ＨｂＩＣＥ１ 连接到线性化的
ｐＧＢＫＴ￣７载体上ꎬ 并转化大肠杆菌 ＤＨ５αꎬ 然后
利用引物 Ｐ１ 和 Ｐ２ 对菌落进行 ＰＣＲ 鉴定(图 １:
Ｂ)ꎮ 挑选阳性克隆菌提取质粒ꎬ 并利用 ＥｃｏＲⅠ和
ＰｓｔⅠ对质粒进行双酶切检测ꎬ 结果显示酶切条带
符合预期片段大小(图 １: Ｃ)ꎮ 最后将阳性克隆送
７５２　 第 ２期　 　 　 　 　 　 欧阳沫等: 巴西橡胶树 ＨｂＩＣＥ１基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选
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M M M1 1 12 23
A B C
bpbpbp
Ａ: ＨｂＩＣＥ１编码区扩增ꎻ Ｂ: 连接转化后对菌落进行 ＰＣＲ 扩增检测ꎻ Ｃ: ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ 载体酶切
前(泳道 １)、 后(泳道 ２)的电泳检测ꎮ
Ａ: ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨｂＩＣＥ１ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎻ Ｂ: ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ ｉｎ
Ｅ􀆰 ｃｏｉｌꎻ Ｃ: Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ( ｌａｎｅ ２) ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ( ｌａｎｅ １) ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１.
图 １　 酵母双杂交诱饵载体 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１的构建
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ ｆｏｒ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
往生工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎬ 以确
保构建的酵母双杂交诱饵载体序列以及 ＨｂＩＣＥ１基
因的阅读框序列是正确的ꎮ
２􀆰 ２　 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１载体自激活检验
将诱饵载体 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ 转化到 Ｙ２Ｈ
Ｇｏｌｄ酵母菌株中ꎬ 然后对菌落进行 ＰＣＲ 检测ꎮ 结
果显示(图２)ꎬ 以随机挑取、 转化ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１
2000
1000
750
500
200
100
M 1 2bp
１: ＨｂＩＣＥ１酵母转化菌落的 ＰＣＲ检测ꎻ ２: 阳性对照ꎮ
１: Ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＢＫＴ￣
７￣ＨｂＩＣＥ１ꎻ ２: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
图 ２　 ＨｂＩＣＥ１酵母转化菌落的 ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１
后的酵母菌落为扩增模板的 ＰＣＲ 产物ꎬ 与以 ｐＧ￣
ＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ 质粒 (阳性对照) 为扩增模板的
ＰＣＲ产物片段大小一致ꎬ 表明诱饵载体 ｐＧＢＫＴ￣７￣
ＨｂＩＣＥ１已成功转化到 Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ 酵母菌株中ꎮ 转
化菌株在缺陷型培养基 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ 上生长良好ꎬ 表
明 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ 能够在宿主 Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ 酵母
菌株中表达ꎬ 并且表达产物 ＨｂＩＣＥ１对宿主菌没有
明显毒性ꎮ 转化有诱饵载体 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ 的
酵母菌株在缺陷型培养基 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅ 上
仍然能够生长出菌落ꎬ 表明 ＨｂＩＣＥ１能够在酵母中
激活报告基因 Ｈｉｓ 的表达 (图 ３: Ａ )ꎬ 这与
ＨｂＩＣＥ１是一个转录因子并具有转录自激活活性的
特性相符ꎮ 但在含有 ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ 或更高浓度 ３￣ＡＴ
的缺陷型培养基 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅ上ꎬ 转化 ｐＧ￣
ＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１的酵母菌株几乎停止生长 (图 ３:
Ｂ)ꎬ 而正对照 ｐＧＢＫＴ￣７￣５３ ＋ ｐＧＡＤＴ￣７￣Ｔ Ｙ２Ｈ
Ｇｏｌｄ酵母菌株在含 ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣ＡＴ 的缺陷型培
养基 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅ 上依然能生长 (图 ３:
Ｃ)ꎬ 表明 ＨｂＩＣＥ１ 激活下游的 Ｈｉｓ 报告基因的表
达量较为微弱ꎬ 即 ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣ＡＴ 可抑制 Ｈｉｓ 本
底表达ꎮ 综上分析表明ꎬ ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ 在含
有 ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ或更高浓度 ３￣ＡＴ的选择培养基上可
进行酵母双杂交筛选ꎮ
２􀆰 ３　 酵母双杂交筛选 ＨｂＩＣＥ１的互作蛋白
将橡胶树 ｐＧＡＤＴ￣７￣Ｒｅｃ２ ｃＤＮＡ 文库转化到
含有 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨＩＣＥ１载体的酵母 Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ 菌株
感受态细胞中ꎬ 然后在三缺培养基 ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣
Ａｄｅ / ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣ＡＴ上进行酵母双杂筛选ꎬ 并把
生长健康的单菌落转板划线到四缺培养基 ＳＤ / ￣
Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ｌｅｕ / ￣Ａｄｅ / Ｘ￣α￣Ｇａｌ / ＡｂＡ / ３０ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣
ＡＴ上进行初次筛选ꎬ 培养 ３ ~ ５ ｄ 后将生长健康
并变蓝的阳性菌落再次划线筛选ꎬ 共转板 ４次ꎬ 最
终得到 ８９个 ＰＣＲ 检测为 ４００ ~ １５００ ｂｐ 的阳性
克隆(图 ４: Ａ)ꎻ 将筛选出的阳性克隆提取酵母质
粒ꎬ 并用 ＡＤ 通用引物进行质粒 ＰＣＲ 检测ꎬ 再将
检测出有条带的酵母质粒转化到大肠杆菌中(图 ４:
Ｂ)ꎻ 每皿挑取 ３ 个菌落进行 ＰＣＲ检测ꎬ 并从每 ３
８５２ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
AB
C
-Trp -Trp / X -Trp / X / A -Trp / - His / - Ade -Leu / Trp- -Leu / - Trp / X / A -Trp -Trp / - His
pGBKT - 7 - HbICE1 CK + pGBKT - 7
pGBKT - 7 - HbICE1
1 1
1
1
10-1 10-1
10-1
10-1
10-2 10-2
10-2
10-2
10-3 10-3
10-3
10-3
TDO
3AT 0 mmol L/
TDO
TDO
3AT 10 mmol L/
3AT 10 mmol L/
TDO
TDO
3AT 20 mmol L/
3AT 20 mmol L/
TDO
TDO
3AT 30 mmol L/
3AT 30 mmol L/
TDO
TDO
3AT 50 mmol L/
3AT 50 mmol L/
TDO
TDO
3AT 70 mmol L/
3AT 70 mmol L/
pGBKT - 7 - 53 + PGADT - 7-T
Ａ: ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１双杂交载体自激活验证ꎻ Ｂꎬ Ｃ: 抑制 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１载体自激活的 ３￣ＡＴ 浓度筛选ꎮ
Ａ: Ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ ｖｅｃｔｏｒꎻ Ｂꎬ Ｃ: Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ３￣ＡＴ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ｈｉｓ ｂａｓａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.
￣Ｔｒｐ / Ｘ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / Ｘ￣α￣Ｇａｌꎬ ￣Ｔｒｐ / Ｘ / Ａ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / Ｘ￣α￣Ｇａｌ / ￣Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａꎬ ￣Ｌｅｕ / ￣Ｔｒｐ / Ｘ / Ａ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ＳＤ / ￣Ｌｅｕ / ￣Ｔｒｐ /
Ｘ￣α￣Ｇａｌ / ￣Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａꎬ ＴＤＯ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ＳＤ / ￣Ｔｒｐ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ａｄｅꎬ ａｎｄ ＣＫ＋ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
图 ３　 ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１载体自激活检测及酵母双杂交筛选验证
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＧＢＫＴ￣７￣ＨｂＩＣＥ１ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
个大小一致的阳性克隆中随机挑选一个做穿刺送生
工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ 测序的阳
性克隆数量为 ４８ 个ꎬ 而能测出序列的有 ３３ 个ꎬ
再去除一些编码同一个基因的序列后ꎬ 共有 ２７ 条
序列在 ＮＣＢＩ 数据库中进行 ＢＬＡＳＴ 比对和分析ꎮ
结果显示ꎬ 筛选到的与 ＨｂＩＣＥ１发生互作的蛋白主
要有一些转录因子、 代谢过程中重要的酶、 组蛋白
和一些功能未知蛋白(表 １)ꎮ 其中ꎬ 筛选出的一些
转录因子很可能与 ＨｂＩＣＥ１互作并共同调控下游基
因的表达ꎬ 由于酵母双杂交存在一定的假阳性ꎬ 还
需要结合验证蛋白质相互作用的实验如双分子荧光
互补、 免疫共沉淀等进行深入研究ꎮ 此外ꎬ 这些筛
选出的与 ＨｂＩＣＥ１互作的蛋白如何与 ＨｂＩＣＥ１共同
调控下游基因也需要进一步验证ꎮ
３　 讨论
研究橡胶树抵御寒害胁迫的分子机理是天然橡
胶生产中急需解决的重要问题ꎮ 乳管是天然橡胶合
成和储存的组织ꎬ 也是决定其产量的重要结构ꎮ
Ｈａｏ和 Ｗｕ[２１]研究表明ꎬ 外源施加茉莉酸能直接诱
９５２　 第 ２期　 　 　 　 　 　 欧阳沫等: 巴西橡胶树 ＨｂＩＣＥ１基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选
AB
2000
2000
1000
1000
750
750
500
500
200
200
M 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
bp
bp
Ａ: 部分酵母双杂交的 ＰＣＲ初步验证结果ꎻ Ｂ: 部分酵母质粒的 ＰＣＲ检测ꎮ
Ａ: Ｙｅａｓｔ ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎻ Ｂ: ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ
ｐｌａｓｍｉｄ.
图 ４　 酵母双杂交筛选验证
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ
表 １　 与 ＨｂＩＣＥ１蛋白发生互作的蛋白
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ＨｂＩＣＥ１
编号
Ｃｏｄｅｓ
互作蛋白名称
Ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｍｅｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＨｂＩＣＥ１
Ⅰ￣４ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ. ｓｔｒｅｓｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ５ꎬ ｐａｒｔｉａｌ
Ⅰ￣５ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ (Ｗｉｌｌｄ. ｅｘ Ａ. Ｊｕｓｓ.) Ｍｕｅｌｌ. ＲｅｃＮａｍｅ: Ｆｕｌｌ ＝ Ｒｕｂｂｅｒ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ Ｓｈｏｒｔ ＝ ＲＥＦ
Ⅰ￣１３ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ Ｌ. ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ (ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ)
Ⅰ￣１４ Ｈ. ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ６０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ３７ａＡ
Ⅰ￣２０ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ Ｌ. ｓｕｂｓｐ. ａｆｒｉｃａｎｕｍ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
Ⅰ￣２２ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ Ｊａｃｑ. ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ: ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２￣ｌｉｋｅ
Ⅰ￣２３ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ Ｌ. ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒꎬ ｐｕｔａｔｉｖｅ
Ⅰ￣２４ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ Ｌ. ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ: ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ＲＦ２９８
Ⅰ￣２７ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｊ. ｃｕｒｃａｓ ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ: ｐｅｐｔｉｄｙｌ￣ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ￣ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ２
Ⅰ￣２９ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｒ. ｃｏｍｍｕｎｉｓ ｆａｄ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅꎬ ｐｕｔａｔｉｖｅ
Ⅰ￣３２ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ Ｌ. ｄｒｏｕｇｈｔ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ
Ⅰ￣３４ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｒ. ｃｏｍｍｕｎｉｓ ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅꎬ ｐｕｔａｔｉｖｅ
Ⅰ￣３８ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｔ. ｃａｃａｏ ａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｓｏｆｏｒｍ ２ꎬ ｐａｒｔｉａｌ
Ⅰ￣３９ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｒ. ｃｏｍｍｕｎｉｓ ｓｕｌｆａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒꎬ ｐｕｔａｔｉｖｅ
Ⅰ￣４０ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｊ. ｃｕｒｃａｓ ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ: Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ＲＢＢＰ６￣ｌｉｋｅ
Ⅰ￣４５ Ｈ. ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ｂｅｔａ￣１ꎬ３￣ｇｌｕｃａｎａｓｅ
Ⅰ￣５０ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｊ. ｃｕｒｃａｓ ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ: ｐｒｏｔｅｉｎ ＦＡＲ１￣ＲＥＬＡＴＥＤ ＳＥＱＵＥＮＣＥ２ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ２
Ⅰ￣５４ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｔｏｒｒ. ＆ Ｇｒａｙ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＯＰＴＲ＿０００６ｓ２１９８０ｇ
Ⅰ￣５９ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｐ. ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＯＰＴＲ＿０００９ｓ１１１９０ｇ
Ⅰ￣６５ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｒ. ｃｏｍｍｕｎｉｓ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
Ⅰ￣６７ Ｈ. ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ａｃｔｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ４
Ⅰ￣７０ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｔａｒｅｎａｙａ ｈａｓｓｌｅｒｉａｎａ (Ｃｈｏｄａｔ) Ｉｌｔｉｓ ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ: １４￣３￣３￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧＦ１４ ｋａｐｐａ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ１
Ⅰ￣７６ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ Ｃｒａｎｔｚ ｇｒａｎｕｌｅ￣ｂｏｕｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ⅰ
Ⅰ￣７７ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｐ. ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ Ｏｌｉｖ. ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ: ａｕｘｉｎ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＢＰ２０
Ⅰ￣８４ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｊ. ｃｕｒｃａｓ ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ: ｍｙｂ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈ
Ⅰ￣８６ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ. ＧＴＰ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｎ￣３
Ⅰ￣８７ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｐ. ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ＥＣＥＲＩＦＥＲＵＭ １ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ
Ⅰ￣８９ Ｈ. ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ｂ１
０６２ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
导橡胶树乳管分化ꎬ 因而它是决定橡胶产量的一个
关键因素ꎮ 近来ꎬ Ｈｕ 等[２２]在 ＩＣＥ￣ＣＢＦ 信号途径
的研究上取得突破性进展ꎬ 发现外源施加茉莉酸能
够增强拟南芥的抗寒能力ꎬ 证明了茉莉酸在 ＩＣＥ￣
ＣＢＦ信号通路的上游ꎬ 并且正调控拟南芥的耐冷
性ꎮ 因此ꎬ 拟南芥中 ＩＣＥ１ 不但是低温胁迫信号传
递通路中重要的转录激活因子、 连接冷信号和下游
应答基因的关键因子ꎬ 而且也是连接低温胁迫信号
和茉莉酸信号的重要基因ꎮ 本研究利用酵母双杂交
筛选与 ＨｂＩＣＥ１蛋白发生互作的蛋白ꎬ 有助于阐明
橡胶树抗寒胁迫的信号通路ꎬ 为今后进一步研究与
ＨｂＩＣＥ１发生互作的蛋白是否参与茉莉酸信号传递
途径、 是否调控橡胶胶乳合成相关基因的表达奠定
基础ꎮ 此外ꎬ 本研究结果也有助于揭示橡胶树抗寒
和橡胶合成的关系ꎬ 以期提高橡胶树抗寒能力的同
时也使橡胶产量增加ꎮ
随着高通量测序技术的快速发展ꎬ 大大增强了
橡胶树遗传资源的筛选、 挖掘与利用能力ꎮ 但目前
对橡胶树的相关研究主要集中在转录组测序上[２３]ꎬ
很多非编码序列仍不清楚ꎬ 直至 Ｒａｈｍａｎ 等[２４]公
布了橡胶树的基因组序列草图ꎬ 才为其分子生物学
的深入研究提供了极大的便利ꎮ 但该文中组装的基
因组大小约为 １􀆰１ Ｇｂꎬ 远远低于预测的橡胶树单
倍体基因组ꎬ 并且很多基因的功能没有注释ꎬ 导致
本研究筛选出的与 ＨｂＩＣＥ１发生互作的蛋白中ꎬ 只
有部分蛋白可以通过 ＢＬＡＳＴ 分析能够在橡胶树中
匹配到同源性比较高的蛋白ꎮ 本研究筛选出的与
ＨｂＩＣＥ１发生互作的蛋白中(表 １)ꎬ 包括橡胶合成
途径关键蛋白橡胶延伸因子蛋白( ｒｕｂｂｅｒ ｅｌｏｎｇａ￣
ｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＲＥＦ)ꎬ 表明橡胶树抗寒信号转
导途径的关键基因可能通过与 ＲＥＦ 互作调控天然
橡胶的合成ꎻ 筛选出的部分互作蛋白是与胁迫(干
旱)应答或生长素应答相关的蛋白ꎬ 这可能有助于
研究冷信号与植物胁迫应答、 激素信号通路之间的
交叉调控ꎮ 酵母双杂交是在酵母体内基于转录因子
模块结构的研究蛋白质相互作用的方法ꎬ 虽然该方
法已被广泛应用于筛选与已知蛋白发生相互作用的
蛋白质ꎬ 但其也有一定的局限性ꎬ 如易出现假阳性
结果ꎮ 因此ꎬ 我们的后续工作还需要结合免疫共沉
淀或双分子荧光互补等其他研究蛋白质相互作用的
方法对筛选出的互作蛋白进行一一验证ꎮ 本文结果
虽为抗寒关键基因 ＨｂＩＣＥ１的功能初步鉴定打下基
础ꎬ 但其具体调控橡胶树抗寒的机理还有待深入研
究ꎬ 并且 ＨｂＩＣＥ１ 是否参与调控橡胶合成ꎬ 以及
ＨｂＩＣＥ１介导的抗寒信号转导通路是否与激素调
控、 其他胁迫应答存在交叉调控也需要作进一步
研究ꎮ
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ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｃ￣ｒｅｐｅａｔ / ＤＲＥꎬ ａ ｃｉｓ￣
ａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｄｅｆｉｃｉｔ [ Ｊ ] .
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ｍａｓｈｏｗ ＭＦ. Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＣＢＦ３
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｍｉｍｉｃｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｎ￣
ｇｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｌｄ ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ
２０００ꎬ １２４(４): １８５４－１８６５.
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ｇｅｒ Ｏꎬ Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ ＭＦ. Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＣＢＦ１ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎｄｕｃｅｓ ＣＯＲ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ] .
Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ １９９８ꎬ ２８０(５３６０): １０４－１０６.
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ＩＣＥ２ꎬ ａ ｇｅｎｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃｏｌｄ ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｄｅｔｅｒ￣
ｍｉｎｅｓ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ [ Ｊ ] .
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ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＣＥ１[ Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２００５ꎬ １７(１１): ３１５５－３１７５.
[１１] 　 Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｂꎬ Ｍａｔｔ Ｇꎬ Ｊｏｈａｎ Ｔꎬ Ｎｏｒｍａｎ Ｈꎬ Ｖａｕｇｈａｎ Ｈ.
１６２　 第 ２期　 　 　 　 　 　 欧阳沫等: 巴西橡胶树 ＨｂＩＣＥ１基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｂｙ ｄｅｍｏｃｒａｃｙ. Ｕｓｉｎｇ ｍｅｔａ￣ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｍｉ￣
ｃｒｏａｒｒａｙ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄａｔａ ｔｏ ｍｏｄｅｌ ｔｈｅ ｃｏｌｄ ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００６ꎬ
１４１(４): １２１９－１２３２.
[１２] 　 Ａｇａｒｗａｌ Ｍꎬ Ｈａｏ Ｙꎬ Ｋａｐｏｏｒ Ａꎬ Ｄｏｎｇ ＣＨꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ Ｒ２Ｒ３
ｔｙｐｅ ＭＹＢ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌｄ ｒｅｇｕｌａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ＣＢＦ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｉｎ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ] .
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍꎬ ２００６ꎬ ２８１(４９): ３７６３６－３７６４５.
[１３] 　 Ｄｏｎｇ ＣＨꎬ Ａｇａｒｗａｌ Ｍꎬ Ｚｈａｎｇ Ｙꎬ Ｘｉｅ Ｑꎬ Ｚｈｕ ＪＫ. Ｔｈｅ
ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｏｌｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓꎬ ＨＯＳ１ꎬ ｉｓ ａ
ＲＩＮＧ Ｅ３ ｌｉｇａｓｅ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａ￣
ｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＣＥ１[Ｊ] . ＰＮＡＳꎬ ２００６ꎬ １０３(２１): ８２８１－８２８６.
[１４] 　 Ｍｉｕｒａ Ｋꎬ Ｊｉｎ Ｊꎬ Ｌｅｅ Ｊꎬ Ｙｏｏ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. ＳＩＺ１￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｕ￣
ｍｏｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＣＥ１ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ＣＢＦ３ / ＤＲＥＢ１Ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ
ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２００７ꎬ １９
(４): １４０３－１４１４.
[１５] 　 Ｄｉｎｇ ＹＬꎬ Ｌｉ Ｈꎬ Ｚｈａｎｇ ＸＹꎬ Ｘｉｅ Ｑꎬ Ｇｏｎｇ ＺＺꎬ Ｙａｎｇ ＳＨ.
ＯＳＴ１ ｋｉｎａｓｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ
ＩＣＥ１ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ] . Ｄｅｖ Ｃｅｌｌꎬ ２０１５ꎬ ３２(３):
２７８－２８９.
[１６] 　 Ｈｕａｎｇ ＸＳꎬ Ｚｈａｎｇ ＱＨꎬ Ｚｈｕ ＤＸꎬ Ｆｕ ＸＺꎬ Ｗａｎｇ Ｍꎬ Ｚｈａｎｇ
Ｑꎬ Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ Ｔꎬ Ｌｉｕ ＪＨ. ＩＣＥ１ ｏｆ Ｐｏｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ ｆｕｎｃ￣
ｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ
ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ[Ｊ] . Ｊ Ｅｘｐ
Ｂｏｔꎬ ２０１５ꎬ ６６(１１): ３２５９－３２７４.
[１７] 　 Ｋｏｓｉｔｓｕｐ Ｂꎬ Ｍｏｎｔｐｉｅｄ Ｐꎬ Ｋａｓｅｍｓａｐ Ｐꎬ Ｔｈａｌｅｒ Ｐꎬ Ａｍéｇｌｉｏ
Ｔꎬ Ｄｒｅｙｅｒ Ｅ. Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅ￣
ｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅｓ (Ｈｅｖｅａ ｂｒａ￣
ｓｉｌｉｅｎｓｉｓ Ｍüｌｌ. Ａｒｇ.) ａｃｃｌｉｍａｔｅ ｔｏ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍ￣
ｐｅｒａｔｕｒｅｓ[Ｊ] . Ｔｒｅｅｓꎬ ２００９ꎬ ２３(２): ３５７－３６５.
[１８] 　 Ｋｒａｔｓｃｈ Ｈꎬ Ｗｉｓｅ Ｒ. Ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ[Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎꎬ ２０００ꎬ ２３(４): ３３７－３５０.
[１９] 　 Ｍａｉ Ｊꎬ Ｈｅｒｂｅｔｔｅ Ｓꎬ Ｖａｎｄａｍｅ Ｍꎬ Ｃａｖａｌｏｃ Ｅꎬ Ｊｕｌｉｅｎ ＪＬꎬ
Ａｍｅｇｌｉｏ Ｔꎬ Ｒｏｅｃｋｅｌ￣Ｄｒｅｖｅｔ Ｐ. Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ
ｃｏｐｅ ｗｉｔｈ ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ａｍｏｎｇ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ａ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｔｒｅｅꎬ
Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ [ Ｊ ] . Ｔｒｅｅ ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０１０ꎬ ３０ ( １１ ):
１３９１－１４０２.
[２０] 　 Ｃｈｅｎｇ Ｈꎬ Ｃａｉ ＨＢꎬ Ｆｕ ＨＴꎬ Ａｎ ＺＷꎬ Ｆａｎｇ ＪＬꎬ Ｈｕ ＹＳꎬ Ｇｕｏ
ＤＪꎬ Ｈｕａｎｇ ＨＳ. Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｖｅａ ｂｒａ￣
ｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ＣＲＴ / ＤＲＥ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １ ｇｅｎｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｒｅｇｕｌａ￣
ｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｔｈｅ ＣＢＦ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｔｒｅｅ
[Ｊ] . ＰｌｏＳ Ｏｎｅꎬ ２０１５ꎬ １０(９): ｅ０１３７６３４.
[２１] 　 ＨＡＯ ＢＺ ꎬ Ｗｕ ＪＬ. Ｌａｔｉｃｉｆｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｖｅａ ｂｒａ￣
ｓｉｌｉｅｎｓｉｓ: ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｌｉｎｏｌｅ￣
ｎｉｃ ａｃｉｄ[Ｊ] . Ａｎｎ Ｂｏｔꎬ ２０００ꎬ ８５(１): ３７－４３.
[２２] 　 Ｈｕ Ｙꎬ Ｊｉａｎｇ Ｌꎬ Ｗａｎｇ Ｆꎬ Ｙｕ Ｄ. Ｊａｓｍｏｎａｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ
ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ＣＢＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ￣Ｃ￣ｒｅｐｅａｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ / ＤＲＥ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ１ ｃａｓｃａｄｅ ａｎｄ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ａｒａｂｉ￣
ｄｏｐｓｉｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２０１３ꎬ ２５(８): ２９０７－２９２４.
[２３] 　 Ｘｉａ Ｚꎬ Ｘｕ Ｈꎬ Ｚｈａｉ Ｊꎬ Ｌｉ Ｄꎬ Ｌｕｏ Ｈꎬ Ｈｅ Ｃꎬ Ｈｕａｎｇ Ｘ. ＲＮＡ￣
Ｓｅｑ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅ ｎｏｖｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ
Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ ２０１１ꎬ ７７(３): ２９９－
３０８.
[２４] 　 Ｒａｈｍａｎ ＡＹＡꎬ Ｕｓｈａｒｒａｊ ＡＯꎬ Ｍｉｓｒａ ＢＢꎬ Ｔｈｏｔｔａｔｈｉｌ ＧＰꎬ Ｊａ￣
ｙａｓｅｋａｒａｎ Ｋꎬ Ｆｅｎｇ Ｙꎬ Ｈｏｕ ＳＢꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｒａｆｔ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ[Ｊ] . ＢＭＣ Ｇｅ￣
ｎｏｍｉｃｓꎬ ２０１３ꎬ １４(７５): １４７１－２１６４.
(责任编辑: 刘艳玲)
２６２ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷