全 文 ：第 wu卷 第 y期
u s s y年 y 月
林 业 科 学
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∂²¯1wu o‘²1y
∏±qou s s y
用抑制消减杂交法分离巴西橡胶树
胶乳特异表达基因 3
邓柳红t 罗明武u 曾会才t 杨卫帆t 张春发t
kt q中国热带农业科学院热带生物技术国家重点实验室 海口 xzttst ~ u q华南热带农业大学 儋州 xztzvzl
摘 要 } 采用巴西橡胶树常割树胶乳的 °²¯¼k„ n l• ‘„为 × ¶¨·¨µo叶片 °²¯¼k„ n l• ‘„为 ⁄µ¬√ µ¨o通过抑制消减杂交
法k¶∏³³µ¨¶¶¬√¨¶∏¥·µ¤¦·¬√¨«¼¥µ¬§¬½¤·¬²±o≥≥‹l构建了一个胶乳特异表达基因差减文库 o通过菌落 °≤• 及反式 ‘²µ·«¨µ±
⁄²·p…¯²·筛选鉴定阳性差异片段 o获得 z|个胶乳特异表达阳性克隆 o部分阳性克隆还通过 ‘²µ·«¨µ± …¯²·杂交及 • ×p
°≤• 进一步验证 ∀随机挑选部分阳性克隆序列比较分析 o结果表明有部分克隆与巴西橡胶树中已知的基因相同 o
而多数克隆在巴西橡胶树中是新发现 o它们与橡胶生物合成 !物质代谢运输 !信号传导和形态建成等相关 ∀
关键词 } 巴西橡胶树 ~抑制消减杂交法 ~胶乳 ~反式 ‘²µ·«¨µ± ⁄²·p…¯²·
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylsy p ssvu p sx
收稿日期 }ussw p ts p u| ∀
基金项目 }中国热带农业科学院科技基金项目k•¼®­swusl ∀
3 张春发为通讯作者 ∀
Ισολατιον οφ ∆ιφφερεντιαλλψ Εξπρεσσεδ Γενεσιν Λατεξ οφ Ηεϖεα βρασιλιενσισ
βψ Συππρεσσιϖε Συβτραχτιϖε Ηψβριδιζατιον
⁄¨ ±ª¬∏«²±ªt ∏² ¬±ªº∏u  ±¨ª ‹∏¬¦¤¬t ≠¤±ª • ¬¨©¤±t «¤±ª≤«∏±©¤t
kt qΣτατε Κεψ Λαβορατορψοφ Τροπιχαλ Χροπ Βιοτεχηνολογψo Χηινεσε Αχαδεµψοφ ΤροπιχαλΑγριχυλτυρε Σχιενχεσ Ηαικου xzttst ~
u qΣουτη Χηινα Υνιϖερσιτψοφ ΤροπιχαλΑγριχυλτυρε ∆ανζηου xztzvzl
Αβστραχτ } „ ¶∏¥·µ¤¦·¨§¦⁄‘„ ¬¯¥µ¤µ¼ º¤¶¦²±¶·µ∏¦·¨§√¬¤¶∏³³µ¨¶¶¬√¨ ¶∏¥·µ¤¦·¬√¨ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²±k≥≥‹l o¬± º«¬¦«·«¨ ¤¯·¨¬°²¯¼
k„ n l• ‘„ ¬¶²¯¤·¨§©µ²° µ¨ª∏¯¤µ¯¼·¤³³¨§ Ηεϖεα βρασιλιενσι󷵨 ¶¨º¤¶∏·¬¯¬½¨ §¤¶·¨¶·¨µº«¬¯¨ §µ¬√¨ µ¬¶°²¯¼k„ n l• ‘„ §¨µ¬√¨ §
©µ²° ±¨ ª¤·¬√¨ ¤¯·¨¬p³µ²§∏¦¬±ª¯¨ ¤©·¬¶¶∏¨¶qײ·¤¯ z| ³²¶¬·¬√¨ ¦¯²±¨ ¶º¨ µ¨ ¬§¨±·¬©¬¨§©µ²°¶¦µ¨ ±¨¬±ª²©·«¨ ¶∏¥·µ¤¦·¨§ ¬¯¥µ¤µ¼¥¼ °≤•
¤±§• √¨¨ µ¶¨ ‘²µ·«¨µ± ⁄²·p…¯²·o³¤µ·²©·«¨ ° º¨ µ¨ ©∏µ·«¨µ√¨ µ¬©¬¨§¥¼ • ×p°≤• ¤±§‘²µ·«¨µ± …¯²·qt{ ²∏·²©·«¨¶¨ z| ¦²±©¬µ°¨ §
¦¯²±¨ ¶º¨ µ¨ µ¤±§²°¯¼ ¶¨¯¨ ¦·¨§©²µ¶¨ ∏´¨±¦¬±ª¤±¤¯¼¶¨¶o²©º«¬¦«·«¨ µ¨¶∏¯·¶º¨ µ¨ ¤¯¬ª±¨ §º¬·«Š¨ ±…¤±®µ §¤·¤¥¤¶¨¶√¬¤…„≥ב
¤±§…„≥×÷ ³µ²ªµ¤°¶qŒ·¬¶¶«²º±·«¤·x ²©t{ ¦¤±§¬§¤·¨¶º¨ µ¨ ¬§¨±·¬·¼ º¬·«®±²º± ª¨ ±¨ ¶¬± Ηq βρασιλιενσισ º«¬¦« ¬¨¨µ·¨§¤
³²¶¬·¬√¨ µ²¯¨¬±µ∏¥¥¨µ¶¼±·«¨¶¬¶ou ¶«²º¨ §¶¬ª±¬©¬¦¤±·¶¬°¬¯¤µ¬·¼·²¦¬¶p³µ¨±¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ ²© Ηq βρασιλιενσισott º¨ µ¨ ±²√¨ ¯ ª¨ ±¨ ¶
¬± Ηq βρασιλιενσισq
Κεψ ωορδσ} Ηεϖεα βρασιλιενσισ~¶∏³³µ¨¶¶¬√¨ ¶∏¥·µ¤¦·¬√¨ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²±k≥≥‹l ~ ¤¯·¨¬~• √¨¨ µ¶¨ ‘²µ·«¨µ± ⁄²·p…¯²·
世界上有 u sss多种植物可以生产天然橡胶 o而大戟科k∞∏³«²µ¥¬¤¦¨¤¨ l的巴西橡胶树k Ηεϖεα βρασιλιενσισl
是唯一能生产高质 !高量天然橡胶 !具有商业价值的树种 o该植物因经济寿命长 !易栽培采割 o胶质好 !产胶多
而得以大量种植k何康等 ot|{zl ∀随着巴西橡胶树的大规模种植 o有关巴西橡胶树形态 !产胶生理及栽培学
等方面的研究已取得了较大的进展 ∀但是在分子生物学方面的研究仍很薄弱 o所报导克隆的 ¦⁄‘„大都用
异源同类基因从巴西橡胶树构建的 ¦⁄‘„文库获取 o从巴西橡胶树克隆的新基因不多 o难以从整体水平上解
释胶乳再生的分子机制 ∀特别是有关橡胶转移酶k橡胶生物合成关键酶l基因的克隆及其调控的研究都还有
待进一步深入 ∀
天然橡胶是在乳管的细胞质 ) ) ) 胶乳里合成的 o因此在胶乳里特异表达的基因可能与橡胶生物合成有
关 ∀Ž∏¶«等kt||sl研究表明几个与橡胶合成相关的基因在胶乳中特异表达 ∀为了进一步了解橡胶合成的
分子机制 o找出与橡胶生物合成相关的基因 o美国密歇根州立大学通过 ∞≥×和 ¦⁄‘„p„ƒ°获得了一些差异
片段 o并对它们进行了综合分析 o但是没有获得与 ¦¬¶p³µ¨±¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ 基因k橡胶合成关键酶基因l有同源性
的差异片段k‹¤± ετ αλqousss ~Ž² ετ αλqoussvl ∀为了找出与橡胶生物合成相关的基因 o本研究首次采用能有
效分离低丰度差异表达基因的抑制消减杂交k≥≥‹l技术构建了一个胶乳特异表达基因差减文库 o序列比较
结果表明所分离的基因不仅包括一些已报导的 o还有一些未报导的基因 o获得了一个与 ¦¬¶p³µ¨±¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨
基因有同源性的差异片段 ∀这些基因在橡胶生物合成中可能起着直接或间接的作用 o它们的功能还有待进
一步的探索与研究 ∀
t 材料与方法
111 材料
试验材料为巴西橡胶树优良品系/热研 zvv|z0 o胶乳及叶片采集后立即放入液氮中保存备用 ∀
112 方法
t1u1t 巴西橡胶树叶片及胶乳总 • ‘„的提取和 °• ‘„纯化 胶乳总 • ‘„的提取参照 Ž∏¶«等kt||sl的胶
乳提取方法 ∀叶片总 • ‘„的提取采用 ≥⁄≥p¬≤¯ 法 ∀检测总 • ‘„浓度 !纯度及完整性 ∀采用 °µ²°¨ ª¤公司的
°²¯¼„×·µ¤¦·µ °• ‘„ Œ¶²¯¤·¬²± ≥¼¶·¨°¶ ¶进行 °• ‘„纯化 ∀
t1u1u 抑制消减杂交及差减 ¦⁄‘„文库构建 抑制消减杂交具体操作参照 ≤¯ ²±·¨¦«公司的抑制消减杂交试
剂盒k≤¯ ²±·¨¦«°≤•p≥¨ ¯¨ ¦·× ¦⁄‘„ ≥∏¥·µ¤¦·¬²± Ž¬·l进行 o以巴西橡胶树常割树胶乳为试验方k× ¶¨·¨µl o叶片为驱
动方k⁄µ¬√¨ µl ∀将正向差减 °≤• 产物克隆至 ×∂ ¦¨·²µ³⁄t{ o保存于 Εσχηεριχηιαχολι ÷tp…¯ ∏¨ 菌株中 o建立正向
差减 ¦⁄‘„文库 ∀
t1u1v 菌落 °≤• 鉴定差减 ¦⁄‘„文库重组子 将保存的菌种对应接种到 |y孔细胞培养板中培养 o取 u ˏ
做模板用于菌落 °≤• ∀以差减片段接头即 ‘¨¶·¨§°≤• °µ¬°¨ µtkxχp×≤Š„Š≤ŠŠ≤≤Š≤≤≤ŠŠŠ≤„ŠŠ×pvχl o‘¨¶·¨§
°≤• °µ¬°¨ µu• kxχp„Š≤Š×ŠŠ×≤Š≤ŠŠ≤≤Š„ŠŠ×pvχl为引物 o检测文库插入片段大小 ∀
t1u1w • √¨¨ µ¶¨ ‘²µ·«¨µ± ⁄²·p…¯²·筛选鉴定阳性差异片段 采用 •²¦«¨ 的地高辛标记和检测试剂盒k⁄ŒŠ ‹¬ª«
°µ¬°¨ ⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª¤±§ ⁄¨·¨¦·¬²± ≥·¤µ·¨µŽ¬·ttl进行杂交检测 ∀挑取 °≤• 阳性克隆 o在每个阳性克隆 °≤• 产物
中加入 t °²¯#pt ‘¤’‹及 uss °°²¯#pt ∞⁄ׄ o使其终浓度为 s1w °²¯#pt ‘¤’‹Πts °°²¯#pt ∞⁄ׄ o在 tss ε
变性 ts °¬±o将各管离心 x ¶∀将样品点于带正电荷的尼龙膜上k准备 u套重复拷贝膜l ∀胶乳k× ¶¨·¨µl和叶片
k⁄µ¬√¨ µl的总 • ‘„用地高辛进行反转录标记后 o作为探针 o分别与点在尼龙膜上的差减 ¦⁄‘„文库阳性克隆
的菌落 °≤• 产物进行杂交 o然后洗膜及免疫检测 ∀
t1u1x ‘²µ·«¨µ±杂交和 • ×p°≤• 分析 取胶乳和叶片总 • ‘„各 tx Λªo甲醛变性凝胶电泳 o转膜 ∀从 • √¨¨ µ¶¨
‘²µ·«¨µ± ⁄²·p…¯²·筛选的阳性克隆中随机挑选 x个¦⁄‘„克隆 o用 ‘²µ·«¨µ± …¯²·杂交验证 o具体操作按 •²¦«¨ 的
地高辛标记和检测试剂盒k⁄ŒŠ ‹¬ª«°µ¬°¨ ⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª¤±§⁄¨ ·¨¦·¬²± ≥·¤µ·¨µŽ¬·ttl进行 ∀对在胶乳 × ¶¨·¨µ和叶
片 ⁄µ¬√¨ µ中均不能检出杂交信号的克隆 o用 • ×p°≤• 进一步验证 ∀分别以等量的叶片和胶乳总 • ‘„为模板 o
进行反转录 o合成单链 ¦⁄‘„ o• vu|的 • ×p°≤• 的正义引物为 xχp≤ŠŠ„„××≤„׊×≤„„„Š„Š×ׄ≤××≤„pvχ o反义
引物为 xχpŠ×≤Š„≤×ׄŠ„≤„„×≤≤×≤„≤ŠŠ„„pvχ ~• u|t的 • ×p°≤• 的正义引物为 xχpŠ„„„≤׊Š„„׊×׊„≤„„
ŠŠ≤„pvχ o反义引物为 xχpŠ„≤„××׊×××׊Š„≤≤≤×≤„Š×pvχ ∀以 t{≥ µ• ‘„ 的扩增作为内参来校正模板的用
量 ∀ • vu| • ×p°≤• 程序为 }|w ε 变性 x °¬±o然后 |w ε vs ¶oys ε vs ¶ozu ε xs ¶oux个循环 o再 zu ε ts °¬±~
• u|t • ×p°≤• 程序为 }|w ε 变性 x °¬±o然后 |w ε vs ¶oxx ε vs ¶ozu ε xs ¶ous个循环 o再 zu ε ts °¬±∀
t1u1y ¦⁄‘„片段测序及序列分析 随机挑选 t{个通过 • √¨¨ µ¶¨ ‘²µ·«¨µ± ⁄²·p…¯²·筛选鉴定的阳性差异片段
送上海生物工程技术有限公司测序 o所有测出的序列去除载体序列及引物序列后 o通过网络提交 ‘≤…Œ进行
…„≥ב和 …„≥×÷ 分析 o推测差异片段的功能 ∀
u 结果与分析
211 巴西橡胶树叶片和胶乳总 ΡΝΑ的提取结果
取 x Λª巴西橡胶树叶片和胶乳的总 • ‘„样品进行甲醛变性凝胶电泳 o电泳结果说明所提取的巴西橡胶
树叶片和胶乳总 • ‘„完整性好 o几乎无降解 ou{≥ µ• ‘„与 t{≥ µ• ‘„的比率大于 tΒt ∀紫外分光光度计检测
结果表明几乎没有蛋白质污染 !酚和多糖类物质等污染 ∀本研究提取的巴西橡胶树叶片和胶乳的总 • ‘„的
纯度和完整性均符合抑制消减杂交实验的要求 ∀
vv 第 y期 邓柳红等 }用抑制消减杂交法分离巴西橡胶树胶乳特异表达基因
212 巴西橡胶树胶乳和叶片表达差异 ΣΣΗ结果
u1u1t °≤• 扩增结果分析 以 u次消减杂交后获得的 ¦⁄‘„为模板再进行 u次 °≤• 扩增 o扩增后的 ¦⁄‘„
群体与克隆载体连接 o转化 o构建成差减 ¦⁄‘„文库 ∀在第 t次 °≤• 扩增中 o由于进行抑制 °≤• o只有差异表
达基因得到指数级扩增 o而随后进行的第 u轮巢式 °≤• 扩增 o可进一步降低背景 o富集差异表达基因 ∀差减
产物与未做减法的 ≤²±·µ²¯ 相比 o带型有差异 o而且经第 u轮巢式 °≤• 扩增后 o差异表达基因得到了富集
k图 tl ∀
图 u 菌落 °≤• 检测 ≥≥‹文库插入片段大小
ƒ¬ªqu „±¤¯¼¶¬¶²©·«¨ ¬±¶¨µ·¶¬½¨ ²©≥≥‹ ¬¯¥µ¤µ¼ ¥¼ °≤•
 }u sss ¥³ ¤¯§§¨µ°¤µ®¨µ~t ∗ tz }随机挑选的克隆
≤ ²¯±¨ ¶³¬¦®¨ §¤·µ¤±§²° q
图 t 第 t次 °≤• 扩增和第 u次 °≤• 扩增电泳结果
ƒ¬ªqt • ¶¨∏¯·¶²©·«¨ ³µ¬°¤µ¼ ¤±§¶¨¦²±§¤µ¼ °≤• ³µ²§∏¦·¶²©≥≥‹
 }u sss ¥³ ¤¯§§¨µ°¤µ®¨µ~
≤t }未扣除的对照第一次 °≤• °µ¬°¤µ¼ °≤• ²©¦²±·µ²¯ ~
≤u }未扣除的对照第二次 °≤• ≥ ¦¨²±§¤µ¼ °≤• ²©¦²±·µ²¯ ~
×t }扣除的 × ¶¨·¨µ第一次 °≤• °µ¬°¤µ¼ °≤• ²©≥≥‹ ~
×u }扣除的 × ¶¨·¨µ第二次 °≤• ≥¨ ¦²±§¤µ¼ °≤• ²©≥≥‹ q
u1u1u 差减 ¦⁄‘„ 文库重组子的筛选 构建好的差减
¦⁄‘„文库经蓝白斑筛选和菌落 °≤• 鉴定后 o获得 v|{
个含插入片段的阳性克隆 ∀菌落 °≤• 用 ‘¨¶·¨§°µ¬°¨ µt
和 ‘¨¶·¨§°µ¬°¨ µu• 为引物进行扩增 o所扩增的片断介于
uss ∗ yss ¥³之间k图 ul ∀由于用于构建 ¦⁄‘„差减文库
的¦⁄‘„序列须经 w个碱基的识别酶 Ρσα´k理论上每 ww
€ uxy个碱基中就有一个酶切位点l切割 o而本研究的插
入片断介于 uss ∗ yss ¥³间 o和理论预计的结果大致相
符 ∀
u1u1v • √¨¨ µ¶¨ ‘²µ·«¨µ± ⁄²·p…¯²·鉴定结果 将胶乳
k× ¶¨·¨µl和叶片k⁄µ¬√¨ µl的总 • ‘„用地高辛进行反转录标
记后 o作为探针 o分别与点在尼龙膜上的差减 ¦⁄‘„文库
阳性克隆的菌落 °≤• 产物进行 • √¨¨ µ¶¨ ‘²µ·«¨µ± ⁄²·p…¯²·o
经洗膜 !压片 !显影和定影后 o将胶乳k× ¶¨·¨µl÷ p光片上
的杂交信号与叶片k⁄µ¬√¨ µl÷ p光片上的杂交信号进行对
比分析后 o找出在胶乳k× ¶¨·¨µl中杂交信号强于叶片
k⁄µ¬√¨ µl的克隆 o及在胶乳k× ¶¨·¨µl有杂交信号而在叶片
k⁄µ¬√¨ µl中没有杂交信号的克隆共 z|个 o另有一些克隆
在胶乳k× ¶¨·¨µl和叶片k⁄µ¬√¨ µl中均无杂交信号 ∀
u1u1w ‘²µ·«¨µ± …¯²·分析和 • ×p°≤• 分析 从 • √¨¨ µ¶¨
‘²µ·«¨µ± ⁄²·p…¯²·筛选的阳性克隆中随机挑选 x个 ¦⁄‘„
克隆用 ‘²µ·«¨µ± …¯²·杂交进一步验证k图 vl o• vyv !• t{v !
• vs共 v个克隆在胶乳 × ¶¨·¨µ中有杂交信号 o而在叶片
⁄µ¬√¨ µ中没有 ~而 • u|t !• vu|两个克隆在胶乳 × ¶¨·¨µ和叶片 ⁄µ¬√¨ µ中均不能检出任何杂交信号 ∀推测原因可
能是丰度太低以至无法由总 • ‘„进行的 ‘²µ·«¨µ±杂交检出 ∀对在胶乳 × ¶¨·¨µ和叶片 ⁄µ¬√¨ µ中均不能检出任
何杂交信号的 • u|t !• vu|两个差异片段进一步进行 • ×p°≤• 分析后发现 ou个差异片段均只在胶乳中表达
k图 wl ∀
图 v ‘²µ·«¨µ± ¥¯²·验证阳性克隆结果
ƒ¬ªqv ∂ µ¨¬©¬¦¤·¬²± ²©·«¨ ³²¶¬·¬√¨¦¯²±¨ ¶¥¼ ‘²µ·«¨µ± ¥¯²·
u1u1x ¦⁄‘„克隆测序与序列分析 从 • √¨¨ µ¶¨ ‘²µ·«¨µ± ⁄²·p…¯²·鉴定的 z|个阳性克隆中随机挑选 t{个克隆
送上海生物工程技术有限公司测序 o所有测出的序列去除载体序列及引物序列后 o在 Š¨ ±…¤±®中进行核酸和
wv 林 业 科 学 wu卷
图 w • ×p°≤• 验证阳性克隆
ƒ¬ªqw ∂ µ¨¬©¬¦¤·¬²± ²©·«¨ ³²¶¬·¬√¨¦¯²±¨ ¶¥¼ • ×p°≤•
k„l对照 ≤²±·µ²¯kt{≥ µ• ‘„l ~k…l• u|t }°• ‘„在叶片和
胶乳中不同表达 °• ‘„ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¬± ¯¨ ¤©¤±§ ¤¯·¨¬~
k≤l• vu| }°• ‘„在叶片和胶乳中不同表达
°• ‘„ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¬± ¯¨ ¤©¤±§ ¤¯·¨¬q
蛋白质同源比较 o结果表明 }有 x个克隆与巴西橡胶树中
已知的基因相同 o这些基因在橡胶生物合成中有积极的
作用k’« ετ αλqot||| ~¬ª«·ετ αλqot|{| ~„¶¤º¤·µ¨µ¤·¤±¤®∏¯ ετ
αλqoussvl ~u个克隆与 Š¨ ±…¤±®上公布的巴西橡胶树顺式
p异戊烯基转移酶同源性高 ~tt个克隆在巴西橡胶树中
是新发现的 o其中 y个克隆通过 • „≤∞技术获得了 x个全
长¦⁄‘„序列k另文发表l ox个在 Š¨ ±…¤±®中查询不到相
关的同源序列 o它们可能是功能未知的新基因 o或是靠近
vχ末端的基因片段 o同源区段太短 o难以通过同源比较推
测其功能k表 tl ∀
表 1 ΓενΒανκ中部分 χ∆ΝΑ序列同源比较分析结果(ΒΛΑΣΤΝ和 ΒΛΑΣΤΞ)
Ταβ .1 Τηε ρεσυλτσ οφ αλιγνµεντ ωιτη ΓενΒανκ δαταβασεσ ϖια ΒΛΑΣΤΝ ανδ ΒΛΑΣΤΞ προγραµσ
克隆编号
≥¤°³¯¨‘²
¦⁄‘„片段长度
¦⁄‘„ ¯¨ ±ª·«Π¥³
Š¨ ±…¤±®的登陆号
Š¨ ±…¤±®¤¦¦¨¶¶¬²±
‘²q
同源比较结果
• ¶¨∏¯·¶²©¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶¤¯¬ª±°¨ ±·º¬·« Š¨ ±…¤±®§¤·¤¥¤¶¨¶
• vs2u vyz ∞…ywzyzu 与拟南芥的糖基转移酶蛋白序列同源性为 xy h
xy h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«ª¯¼¦²¶¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ ³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Αραβιδοπσιστηαλιανα
• u{ 全长 ƒ∏¯ p¯¯ ±¨ª·«
t vyx
„≠wytwtv 与拟南芥雄性不育蛋白序列同源性为 wx h ~与浩浩巴的乙酰辅酶 „还原酶蛋白序列同源
性为 wu h
wx h ¬§¨±·¬·¼ º¬·« °¤¯¨¶·¨µ¬¯¬·¼ up¯¬®¨ ³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Αραβιδοπσισ τηαλιανα ~wu h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«
¤¦¼¯ ≤²„ µ¨§∏¦·¤¶¨ ³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Σιµ µονδσια χηινενσισ
• {v
• tus
• vyt
u{v
u{v
u{t
与巴西橡胶树小橡胶粒子蛋白的核酸蛋白序列同源性均为 tss h
tss h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«¶°¤¯¯µ∏¥¥¨µ³¤µ·¬¦¯¨³µ²·¨¬± ±∏¦¯ ¬¨¦¤±§³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Ηεϖεα βρασιλιενσισ
• u|t 全长 ƒ∏¯ p¯¯ ±¨ª·«
|xx
„≠x{|y|s 与拟南芥磷酸甘油酯转移蛋白序列同源性为 yy h
yy h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«³«²¶³«²ª¯¼¦¨µ¬§¨ ·µ¤±¶©¨µ³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Αραβιδοπσιστηαλιανα
• vu| 全长 ƒ∏¯ p¯¯ ±¨ª·«
z{{
„≠wytwtu 与鹰嘴豆的微管相关蛋白核酸同源性序列为 {y h o蛋白序列同源性序列为 |s h
{y h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«°¬¦µ²·∏¥∏¯¨¤¶¶²¦¬¤·¨§³µ²·¨¬± ±∏¦¯ ¬¨¦¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Χιχεραριετινυµ ¤±§|s h ¬§¨±·¬·¼
º¬·« °¬¦µ²·∏¥∏¯¨¤¶¶²¦¬¤·¨§³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨
• w|x 全长 ƒ∏¯ p¯¯ ±¨ª·«
t sys
„≠ysx|vs 烟草的 ‘׊°t蛋白序列同源性为 |t h
|t h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«‘׊°t ³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Νιχοτιανα ταβαχυµ
• t|v
• vw|
xvu
u{z
与巴西橡胶树橡胶延长因子核酸蛋白序列同源性均为 tss h
tss h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«µ∏¥¥¨µ¨¯²±ª¤·¬²±©¤¦·²µ±∏¦¯ ¬¨¦¤±§³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Ηεϖεα βρασιλιενσισ
• vyv
• v|t
全长 ƒ∏¯ p¯¯ ±¨ª·«
t txy
„≠wytwtw 与巴西橡胶树顺式 p异戊烯基转移酶核酸蛋白序列同源性均为 tss h
tss h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«¦¬¶p³µ¨±¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ ±∏¦¯ ¬¨¦¤±§³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Ηεϖεα βρασιλιενσισ
• v{v vz| ∞…ywzyzv 与罗勒咖啡酸 p ’ p甲基转移酶蛋白序列同源性为 zz h
zz h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«¦¤©©¨¬¦¤¦¬§’p°¨ ·«¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ ³µ²·¨¬± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Οχιµυµ βασιλιχυµ
• twz vtz ∞…ywzyzw 无显著相关同源序列 ‘²¶¬ª±¬©¬¦¤±·¶¬°¬¯¤µ¬·¼©²∏±§
• vyx uyx ∞…ywzyzx 无显著相关同源序列 ‘²¶¬ª±¬©¬¦¤±·¶¬°¬¯¤µ¬·¼©²∏±§
• vzy t{| ∞…ywzyzy 无显著相关同源序列 ‘²¶¬ª±¬©¬¦¤±·¶¬°¬¯¤µ¬·¼©²∏±§
• y x|| ∞…ywzyzz 无显著相关同源序列 ‘²¶¬ª±¬©¬¦¤±·¶¬°¬¯¤µ¬·¼©²∏±§
• vz| uvu ∞…ywzyz{ 无显著相关同源序列 ‘²¶¬ª±¬©¬¦¤±·¶¬°¬¯¤µ¬·¼©²∏±§
v 讨论
≥≥‹是由 ⁄¬¤·¨¦«¨ ±®²等 kt||yl建立的差异表达基因分离技术 o它具有假阳性率低 o能有效分离低丰度
差异表达基因的优点 ∀因此本研究在构建胶乳特异表达基因的差减¦⁄‘„文库时 o采用了该技术 o同时选取
了胶乳再生比较旺盛时期 ) ) ) 刚结束排胶的常割树胶乳作为样品 ∀初步结果表明所分离的基因不仅包括一
些已报导的 o还有一些未报导的基因 o它们在橡胶生物合成中起着直接或间接的作用 ~同时还获得了一个与
¦¬¶p³µ¨±¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ 基因高度同源的差异基因片段 o通过 • „≤∞扩增该片段的 x. 和 v. 末端 o获得了一个 ¦⁄‘„
全长序列k登录号 „≠wytwtwl o该结果另文介绍 ∀而美国密歇根州立大学通过 ∞≥×和 ¦⁄‘„p„ƒ° u种方法从
胶乳中得到的差异片段中并不含有与 ¦¬¶p³µ¨±¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ 基因k橡胶合成关键酶基因l有同源性的差异片段
k‹¤± ετ αλqousss ~Ž² ετ αλqoussvl ∀
xv 第 y期 邓柳红等 }用抑制消减杂交法分离巴西橡胶树胶乳特异表达基因
橡胶的生物合成由蔗糖开始 o经过糖酵解 o三羧酸循环生成乙酰辅酶 „ ∀然后以乙酰辅酶 „为原料通过
一系列相关的酶促反应合成橡胶 ∀因此橡胶的生物合成与巴西橡胶树的生理代谢是密切相关的k≤²µ±¬¶« ετ
αλqot||v ~Ž¨®º¬¦®ot|{|l ∀
本研究通过对部分差异片段进行序列分析及比较 o发现由 ≥≥‹ 法获得的差异片段与橡胶生物合成 !信
号传导和物质代谢运输等相关 ∀割胶是一种机械刺激 o它可诱导巴西橡胶树体内产生伤害乙烯 o而研究发现
乙烯可以提高乳管细胞膜的透性 o加速胶乳流速 o影响胶乳的代谢k„°¤¯²± ετ αλqot||ul ∀由此推测割胶可能
通过影响巴西橡胶树的生理代谢功能进而影响到胶乳的再生 ∀割胶后的排胶因引起乳管细胞质的流失 o需
要在乳管内建立一种新的代谢平衡 o来补充每次割胶后损失的细胞质k包括蛋白l o这时可能就会启动与胶乳
再生相关基因的表达 o作者推测橡胶生物合成是由细胞质再生需求所诱导的 o而割胶等伤害刺激则通过影响
巴西橡胶树的生理代谢来对橡胶生物合成起到间接的促进作用 ∀
参 考 文 献
何 康 o黄宗道 qt|{z q热带北缘巴西橡胶树栽培 q广州 }广东科技出版社 ov|{ p wsu owsz p wty
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k责任编辑 徐 红l
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