全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
莱芜猪心脏 cDNA文库的构建与鉴定
李付美 闫顺 曲志才 徐来祥
(曲阜师范大学生命科学学院,曲阜 273165 )
摘 要 : 以莱芜猪心脏为供试材料, 采用改进的异硫氰酸胍法提取心脏总 RNA。通过 SMART技术反转录合成全长 cD
NA, 经 LDPCR扩增后与 pMD18T载体连接并转化细菌 DH 5, 测定滴度和重组率,构建成莱芜猪心脏全长 cDNA文库。经初
步检测, 原始文库的滴度为 1 8 105 CFU /mL,重组率约为 944%。从原始文库随机挑取 13个单菌落过夜培养, 提取质粒,经
H ind !和 E coR ∀双酶切,凝胶电泳显示插入片段大小在 03- 20 kb之间。
关键词: 莱芜猪 心脏 cDNA文库 SMART技术
Construction and Identification of cDNA Library of
theH eart tissue in Laiwu Pig
L i Fum ei Yan Shun Qu Zh icai Xu La ixiang
(College of L ife Science, Qufu N ormal University, Q ufu 273165)
Abstrac:t Abstract: The to ta l RNA from heart tissue o f La iw u p ig w as extracted by iso th iocyana te m ethodFulllength cDNAs
w ere syn thesized by SMART techn ique and a poo l of doub lestranded cDNA w as am plified by LDPCR assayThe recovered cDNA frag
m ents we re lig ated into pMD18T vector and transfo rm ed Eco li DH 5 to construct a fu llleng th cDNA libraryThe libraryw as tittered,
and the rate o f recom bination ( blue /w hite ) w as de term inedThe results show ed tha t the pr im ary titer of the construc ted cDNA library
w as 1 8 105CUF /mL, the recom bina tion ra tew as about 94 4% and the leng th o fm ost cDNA inserted in the library was about 0 3-
2 0 kb by agaro se gel e lectropho resis
Key words: La iw u p ig H eart tissue cDNA library SMART technique
收稿日期: 20091123
基金项目:国家科技基础条件平台建设项目 ( 2005DKA2110107)
作者简介:李付美,女,在读硕士研究生, 研究方向: 哺乳动物 RNA; Em ai:l lifum ei2008@ 163 com
通讯作者:曲志才,男,教授,主要研究方向: 基因克隆及功能; Em ai:l zcqu@ m ail qfnu edu cn
莱芜猪是山东省著名的地方猪种, 是我国地
方种猪的宝贵的基因库, 1982年收录 #中国猪品种
志 ∃。而且莱芜猪是历史上经长期自然选择与人
工选择,又经过多年选育形成的一个优良地方猪
种, 是我国华北型优良地方猪种, 具有适应性强、
繁殖力高、肉质优良、配合力好等特性 [ 1, 2]。因此,
对于这样一个优良品种, 建立一个全长 cDNA文库
是完全有必要的。目前, 我国已经成功地构建了
上百种动物的 cDNA文库,关于莱芜猪 cDNA文库
的构建尚未见报道。本试验以莱芜猪心脏组织为
材料,利用 SMART技术, 构建莱芜猪心脏全长 cD
NA文库。
1 材料与方法
11 材料
111供试材料 来自于山东省莱芜猪原种猪场的
纯种莱芜猪,屠宰后立即取心脏组织迅速投入液氮
罐, 带回实验室后转入70% 超低温冰箱保存备用。
112 药品和试剂 cDNA第一链合成引物: CD
SIII/3& PCR 引物 ( 12 M ): 5&ATTCTAGAGGC
CGAGCGGCCGACATGd( T ) 30N 1N3&( N = A, G,
C, or T; N1 = A, G, or C ) ; SMART IVTM寡核苷酸引
物 ( 12 M ): 5&AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTG
GCCATT ACGGCCGGG3&; cDNA第二链合成引物:
5&PCR引物 ( 12 M ): 5&AAGCAGTGGTATCAA CG
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
CAGAGT3&。SMARTTM cDNA文库构建试剂盒、50
Advantage 2 PCR试剂盒、10 Advantage PCR缓
冲液购自 C lontech公司; DNA标准分子量、Prime
Script反转录酶、XGa l、IPTG、pMD18T、DN ase I、T4
DNA连接酶、各种限制酶、琼脂糖凝胶 DNA纯化试
剂盒、PCR反应成分及 Taq DNA聚合酶为 TaKaR a
公司产品; MOPS、异硫氰酸胍为进口分装产品; 引物
由上海生工合成; 其他常规药品为国产分析纯。宿
主菌 E coli DH5由遗传实验室保存。
113 仪器及设备 - 70% 超低温冷冻冰箱 (美
国 ) ; B iofuge Primo R台式高速冷冻离心机 ( Thermo
Sc ientif ic)、AB I2720型 PCR扩增仪、Tanon2500型
凝胶成像分析系统、TU 1901双光束紫外可见分光
光度计、电泳设备、恒温培养箱、HSS1型数字式超
级恒温浴槽等均系国产产品。
12 方法
121 总 RNA的提取 采用异硫氰酸胍法 [ 3]提
取莱芜猪心脏总 RNA, 经 1%琼脂糖甲醛变性凝胶
电泳 /EB染色检测总 RNA质量,并以紫外分光光度
计测定其浓度和纯度。
122 全长 cDNA合成 ( 1) cDNA第一链的合
成:吸取 3 L总 RNA、1 L SMART IV O ligo( dT )、
1 L CDS III /3&PCR引物, 充分混匀, 置 72% 孵育
2 m in,立即冰上冷却 2 m in, 稍微离心, 再依次加入
2 L 5 第一链缓冲液、1 L DTT、1 L dNTPs混合
液、1 L PrimeScript逆转录酶, 混匀, 置 42% 孵育
1 h, 然后终止反应, 即合成 cDNA第一链。 ( 2)双链
cDNA的合成: 取 4 L cDNA 第一链产物, 加入
78 L去离子水、10 L 10 Advantage 2 PCR缓冲
液、2 L 50 dNTPs混合液、2 L 5& PCR引物、
2 L CDS III/3&PCR引物、2 L 50 Advantage 2
聚合酶混合物, 反应总体积 100 L。以 LDPCR扩
增双链 cDNA,反应条件: 95% 预变性 1 m in, 95% 变
性 15 s, 65% 退火 30 s, 68% 延伸 6 m in, 34个循环,
循环结束后 72% 再延伸 10 m in。取 5 L PCR产
物,经 1%琼脂糖凝胶电泳检测双链 cDNA质量。
123 双链 cDNA蛋白酶 K消化 取 50 L双链
cDNA,加入 2 L蛋白酶 K, 轻微离心, 45% 温育 1 h
后,反应管置于 90% 水浴 10 m in,以灭活蛋白酶 K,
加去离子水至总体积 100 L。然后加入等体积水
饱和酚 ∋氯仿 ∋异戊醇 ( 25∋24∋1)混合液, 充分混匀
后 14 000 g离心 5 m in; 吸取上层水相, 再加 100
L氯仿∋异戊醇 ( 24∋1) , 混匀后 14 000 g离心 5
m in; 转移水相于新离心管, 加入 1 /10体积 3 mo l/L
醋酸钠,加 20 g /L糖原 13 L, 2倍体积的 95%
乙醇,立即以 14 000 g再离心 20 m in, 弃上清夜,
以 80%乙醇洗涤沉淀 2- 3次, 空气干燥 10 m in, 最
后以 10 L去离子水溶解沉淀。
124 双链 cDNA的回收 以 12%琼脂糖凝胶分
离经蛋白酶 K消化的双链 cDNA,参照凝胶 DNA纯
化试剂盒 ( Ver20)说明书的操作步骤, 以 04 -
075 kb, 075- 10 kb, 10- 20 kb 3个等级割胶,
分别回收双链 cDNA。
125 双链 cDNA与 pMD18T载体的连接与转化
取 2 L 双链 cDNA 和 25 L 连接缓冲液与
05 L pMD18T载体,于 16% 连接过夜。CaC l2法制
备大肠杆菌感受态细胞 [ 3]。吸取 5 L连接液与 50
L感受态细胞混合, 冰浴放置 30 m in, 42% 水浴热
激 90 s,立即冰浴 2 m in,然后加入 800 L LB液体
培养基于 37% 180 r /m in振荡培养 1 h,使细胞复苏
并表达抗性。
12 6 未扩增文库库容和重组克隆百分比的测
定 取复苏菌液稀释 10倍后, 涂布于含有适量
XG al、IPTG及 Amp的 LB平板上, 待菌液被培养
基完全吸收, 于 37% 培养 12 - 16 h, 计数单菌落
及蓝白菌落数目。文库库容及重组克隆百分率计算
公式:
文库滴度 ( CFU /mL) = (平均每个培养皿中单
菌落数 稀释倍数 1 000 L /mL) /涂布稀释的菌
体体积 (L)
文库重组率 (% ) = 白菌落数 / (白菌落数 + 蓝
菌落数 ) 100%
127 双酶切检测原始 cDNA文库插入片段长度
随机挑取 13个单菌落, 接种于 LB液体培养基 (含
Amp)中,于 37% 摇床 ( 165 r/m in)培养过夜。碱裂
解法提取质粒 [ 3] , 然后进行双酶切。反应体系为:
36 L去离子水, 5 L质粒, 1 L 10 M型缓冲
液, 限制酶H in d !和 E coR ∀各 02 L, 37% 酶切
3 h以上。取 5 L酶切产物于 12%琼脂糖凝胶电
泳检测 cDNA文库插入片段的长度。
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2010年第 3期 李付美等:莱芜猪心脏 cDNA文库的构建与鉴定
2 结果与分析
21 心脏总 RNA的质量检测
以异硫氰酸胍法提取莱芜猪心脏总 RNA, 经
1%琼脂糖甲醛变性凝胶电泳分析, 目测 28S rRNA
与 18S rRNA凝胶条带的荧光比值接近 2∋1,条带清
晰完整 (图 1) ,预示所提取总 RNA的完整性较好。
紫外分光光度计测定 A260 /A280的比值是 192, A260 /
A 230的比值是 233。以上指标表明所提取的总 RNA
纯度较高、无 DNA及蛋白质等杂质污染, 可以用于
cDNA文库的构建。
图 1 莱芜猪心脏心脏总 RNA电泳图谱
22 双链 cDNA的合成
采用 LDPCR的方法合成双链 cDNA。电泳检
测显示,双链 cDNA主要集中在 04- 20 kb范围
(图 2 ), 无特异带型, 这表明合成的 cDNA较为完
整,质量较好,符合 cDNA文库的构建要求。
1.扩增的双链 cDNA; M. DNA标准分子量 DL2000
图 2 莱芜猪心脏心脏双链 cDNA电泳图谱
23 原始文库滴度与重组率的计算
以文库库容公式计算,所构建的莱芜猪心脏组
织 cDNA原始文库滴度: 18 10 103 /mL = 18
10
5
CFU /mL, 重组率约为 17 / ( 1 + 17 ) 100%
= 944%。
24 重组克隆的双酶切鉴定
随机挑取 13个单菌落,以碱裂解法提取重组质
粒并进行双酶切。结果表明, 插入片段长度集中在
03- 20 kb之间, 大部分克隆在 15 kb以上 (图
3),说明构建文库的质量较高。
M. DNA标准分子量 DL2000; 1- 13.不同克隆的酶切产物
图 3 重组质粒的 H ind !和 EcoR ∀双酶切图谱
3 讨论
本研究以异硫氰酸胍法提取莱芜猪心脏总
RNA, 电泳和紫外检测结果表明,提取的总 RNA无
明显降解, 预示 RNA完整性较好, 基本符合 cDNA
建库要求。
文库的容量、重组率及插入片段的大小是鉴定
cDNA文库质量的重要指标 [ 46]。根据经验公式: N
= ln( 1- P ) / ln( 1- 1 /n ), N代表所需克隆数, P代
表要求的概率, 1 /n为一种稀有的 mRNA在总 RNA
中所占的相对比例 [ 7 ] ,要求克隆到某低丰度 mRNA
的概率为 99%时,文库的克隆数不应低于 17 105
CFU /mL
[ 811]。本研究所建文库的总克隆数为 18
105 CFU /mL,略高于所需标准。因此, 从理论上
来说,从该文库筛选出低丰度目的基因是可行的。
文库的重组率为 944% ,插入片段大小在 03- 20
kb之间,大部分克隆在 15 kb以上, 说明此文库是
较完整的、有效的, 且质量较高。
本研究所建 cDNA文库库容基本上满足筛选要
求,但仍未达到 1 106 CFU /mL,推测可能有以下原
因: ( 1)虽然总 RNA含量很高, 但是 mRNA的量未
达到构建全长 cDNA文库的要求, 以至滴度未达到
理想的状态; ( 2)回收过程中导致一些片段的丢失,
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
以至本来可能达到的文库滴度又会变小; ( 3)感受
态转化效率不高,即使有很多的连接片段也不能有
效地转入到大肠杆菌中,表现出来的滴度变小。
参 考 文 献
[ 1] 山东省畜禽品种志编写组.山东省畜禽品种志, 1999, 218.
[ 2] 中国猪品种志编写组.中国猪品种志, 1986, 424.
[ 3] 朱旭芬.基因工程实验指导. 北京: 高等教育出版社, 2006, 28
29, 8290, 107116.
[ 4] 杨全, 张卉,王文全,等. 甘草根 cDNA文库构建与分析. 中国中
药杂志, 2008, 33( 12) : 13861389.
[ 5] 晏慧君,黄兴奇,程在全. cDNA文库构建策略及其分析研究进
展.云南农大学报, 2002, 21( 1 ) : 16.
[ 6] Jin XB, W ang TT, Zhu JY. C ons truction and p relim inary ident ifica
t ion of the cDNA lib rary forM usca dom estica larvae. C h inese Journ al
of Zoonoses, 2005, 21( 1 ) : 5255.
[ 7] 侯占铭. C larke2Carbon公式的推导.遗传, 2000, 22( 2): 101102.
[ 8] 苟德明,郑新民,陈乃清,等. 成人肝 cDNA文库的构建.中国兽
医学报, 1997, 17( 5 ): 449452.
[ 9] 杨芳,贺智敏,詹显全,等.大鲵肝脏组织定向 cDNA文库的构建
及鉴定.动物学报, 2004, 50 ( 3) : 475478.
[ 10] 王来元,王金星,赵小凡,等.家蝇 cDNA文库的构建.动物学研
究, 2001, 22 ( 2) : 159162.
[ 11] 蔡宁波,黄湘文,庄伟建.花生种子全长 cDNA文库的构建和鉴
定.花生学报, 2007, 36 ( 2) : 15.
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