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综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
生物酶催化聚合的研究进展
马艳芬 1 吕生华 1 刘岗 1 董凌霄 1 李芳1 王飞2 郑新建 1
( 1陕西科技大学资源与环境学院,西安 710021; 2陕西科技大学材料科学与工程学院,西安 710021)
  摘  要:  酶催化聚合反应是近年来的研究热点之一, 氧化还原酶是应用广泛的一类催化聚合酶。概括总结了近年来酶
促聚合反应的研究进展, 重点叙述了辣根过氧化物酶 ( HRP )、大豆过氧化物酶 ( SBP )和漆酶 ( laccase)的结构、催化机理以及它
们在酶催化聚合中的应用概况。
关键词:  酶催化 辣根过氧化物酶 大豆过氧化物酶 漆酶
Research Progress of the Enzymatic Polymerization
M aYanfen
1
Lv Shenghua
1
L iu Gang
1
Dong L ingxiao
1
L iF ang
1
W ang Fei
2
Zheng X injian
1
(
1
College of Resource and Environm ent, Shaanx i University of Science& T echnology, X i an 710021; 2College of M aterials
Science and Engineering, Shaanx i University of Science& T echnology, X i an 710021)
  Abstrac:t  Enzym e
ca talyzed po lym er ization is one of the research focus in recent years, and ox idoreductases have show ed that
w ide applica tions in ca talytic synthesis o f po lyme r. Th is paper descr ibed the research progress of enzym e
cata ly zed po lym erization in re

cent years, and m ainly d iscussed tha t the structure, ca talyticm echan ism of horse radish perox idase, soybean perox idase and laccase, as
w e ll as the ir app lication situation in enzym e
cata lyzed po lym eriza tion.
Key words:  Enzym e cata lysis H orserad ish perox idase Soybean perox idase Laccase
收稿日期: 2010
01
04
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 20876091) ,陕西省自然科学基金资助项目 ( SJ08B06 )
作者简介:马艳芬,女,硕士研究生,研究方向:轻化工助剂及功能高分子材料; E
m ai:l m yf_829@ 163. com
通讯作者:吕生华,男,教授,博士生导师, E
m ai:l lsh630603@ yahoo. com. cn
酶是由生物体细胞产生的一种生物催化剂,其
本质是具有三维空间构象的一类蛋白质。酶催化具
有高效、专一、活性可控、反应条件温和等特点 [ 1 ]。
酶催化反应一般在水介质中进行, 认为有机溶剂会
使酶失活。 1985年, K libanov等 [ 2]首次证明某些酶
可以在有机溶剂中保持其催化活性, 使得酶催化的
应用领域得到了极大拓展, 酶催化被广泛应用于医
药、食品、农药、轻工、香料、环保、能源和精细有机合
成等领域。
根据酶催化反应的性质,可将酶分为 6大类:氧
化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶
类、合成酶类。不同种类的酶能催化不同类型的反
应,其中氧化还原酶在催化合成聚合物很有发展潜
力。概括总结了近年来国内外在这方面的研究进
展,重点介绍了有关辣根过氧化物酶 (HRP)、大豆
过氧化物酶 ( SBP)以及漆酶 ( Laccase)等的研究应
用情况。
1 辣根过氧化物酶
辣根过氧化物酶 ( ho rseradish perox idase, HRP)
是商品化较早、应用最广泛的一种酶制剂,该酶是从
辣根植物根块中提取制造的。HRP具有很强的催
化活性,可以在芳香族质子接受体的链伸展过程中
催化分解 H2O2, 催化以 H2O2作为氧化剂的酚类和
芳香胺以及它们的衍生物的偶合反应,生成一些具
有特殊结构的聚合产物。
1. 1 HRP的结构
HRP是一类同工酶的总称,其中以辣根过氧化
物酶同工酶 C (HRP C )含量最为丰富, 也是其主要
的活性成分。关于 HRP C的结构, 已经有很多化学
家进行了研究,其部分结构如图 1,它是一条由 308
个氨基酸组成的肽链,辅基为血红素,相对分子质量
约为 4. 4 ! 104,等电点范围较宽 3. 0 - 9. 0, 其氨基
2010年第 4期      马艳芬等: 生物酶催化聚合的研究进展
酸的序列已经测定, N
末端连接着一个固定的吡咯
烷酮羧基, 而 C
末端连接着的丝氨酸却经常丢失,
这条肽链中有 4个由两分子半胱氨酸组成的二
硫键 [ 3]。
图 1 辣根过氧化物酶的辅基 (血红素 )结构
1. 2 HRP的催化机理
1. 2. 1 水相介质 普遍认为, 水相中 HRP的催化
机理是一个过氧化循环过程,如图 2。
图 2 HRP的催化机理
式中, AH2是氢供体底物, H2O2是氢受体底物。
HRP
∀和 HRP
#分别代表 HRP的两个具有不同
光谱和动力学特性的中间体化合物。反应的起始过
程是由 HRP控制的, HRP在 H 2O2存在下催化酚类
或芳胺类物质的氧化形成自由基,之后,自由基的聚
合以及自由基的传递过程就都由自由基本身的特性
及溶剂的性质来决定 [ 4]。
HRP催化循环的第一步是 H2O2和静态酶中的
Fe( ∃ )反应生成 HRP
∀。HRP
∀是一个高氧化态
的催化中间体,包含一个含氧 Fe( % )中心和一个带
正电荷的卟啉。第二步是由于一分子还原性底物的
加入,生成另一个含有含氧 Fe( % )中心的催化中间
体 HRP
# 。HRP
∀和 HRP
#都是强氧化剂, 氧
化还原电势接近 + 1 V。第三步也是有一分子还原
性底物参加,使 HRP
#还原成静态酶 [ 3]。
1. 2. 2 非水介质 酶在有机相中表现出了许多特
殊的性质,如较高的热力学稳定性、新异的化学选择
性和区域选择性等。研究表明,酶在有机介质中的
催化反应机理与在水相中的相同 [ 5]。在有机相中,
酶分子表面必须吸附水分子才能保持其催化活性,
这些水称为 &必需水∋。所谓非水介质并不是指完
全无水的体系, 而是有机溶剂 /水的混合体系, 在
HRP的催化反应中常用的有机溶剂有甲醇、乙腈和
1, 4
二氧六环。当体系含水量较高时, 产物的相对
分子质量比较低,随体系中有机相浓度的增高,产物
的相对分子质量显著增大, 并出现一个最大值。此
后, 当有机相浓度再增加时, 产物相对分子质量急剧
下降。另外,混合体系中的有机溶剂的极性越强,产
物的相对分子质量也越低, 这是由于强极性的溶剂
争夺酶表面 &必需水 ∋的作用较大,对酶活性的影响
也较大。
1. 3 HRP的研究进展
1. 3. 1 HRP催化酚类化合物聚合反应 HRP催化
合成的优点十分明显,能催化形成常规方法很难得
到的产物结构,如 HRP可以使酚羟基邻位和对位的
活泼氢离去从而形成自由基来进行苯环直接连接的
聚合反应。 Simona等 [ 6]在 1
丁基
3
甲基咪唑四氟
硼酸盐离子液体 ( [ BM IM ] [ BF4] )和水的混合介质
中, 研究了 HRP对水不溶性酚类的催化聚合反应。
当 pH大于 9. 0时, HRP在水相离子液体中能保持
高达 90%的催化活性, 在 75%的 [ BM IM ] [ BF4]碱
性水溶液中, HRP可以催化水不溶性酚类进行聚合
反应。同时, Simona等还利用此体系合成了一种新
型 4
苯基苯酚临位二聚物, 产率很高。 Sohe l、Mun

ishw ar
[ 7]利用固定化 HRP催化聚合对氯苯酚使其沉
淀, 转化率很高, 从而达到分离的目的。叶鹏、张剑
波等 [ 8]采用 HRP催化去除模拟废水中的五氯酚, 使
其形成沉淀而除去,五氯酚的除去率可以达到 70%
左右,这种方法可以用于除去工业废水中酚类污
染物。
1. 3. 2 HRP催化芳胺类化合物反应 聚苯胺 ( PA

N I)具有大
共轭体系,可作为有机导电聚合物、非
线性光学材料等。在合成聚苯胺的反应中, HRP非
水相催化具有明显的优势。当 HRP在水相中催化
只能形成相对分子质量较低的低聚物聚苯胺, 因为
一旦生成聚苯胺会立即沉淀而终止反应, 同时, 经
HRP水相催化得到的聚苯胺是邻位、对位聚合物的
混合物,这也使其应用受到限制。 Chul和 Young[ 9]
研究了非水相介质中 HRP催化聚合苯胺的反应, 发
51
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
现也会生成对位和邻位结构的聚苯胺,但是,通过改
变体系的 pH和有机溶剂的种类可以控制邻位和对
位聚苯胺的比例,达到了控制产物结构的目的。
1. 3. 3 HRP催化乙烯基单体聚合反应 HRP可以
催化乙烯基单体的聚合反应, 蔡智奇、孙建中等 [ 4]
研究了用 HRP、H2O2和乙酰丙酮 ( ACAC )组成的三
元酶促体系引发丙烯酰胺 (AAM )的聚合反应, 并考
察了反应温度和 HRP、ACAC、H2O2及 AAM 初始浓
度对酶促体系引发 AAM 聚合动力学行为的影响,
确定了适宜的反应条件, 用 FTIR和 GPC对聚合产
物进行表征,得到的数均相对分子质量 (M n)为 105
- 106、分布指数 ( D I)为 2- 3的聚丙烯酰胺。
2 大豆过氧化物酶
大豆过氧化物酶 ( soybean perox idase, SBP, EC
1. 11. 1. 7)是从大豆皮中提取的一类具有很高活性
的酸性同工酶。大豆皮是大豆炼油过程的副产物,
原料价廉易得, 同时 SBP底物作用范围广、耐热性
能高、酸碱稳定性好、pH 适用范围宽等优点是同类
过氧化物酶不可比拟的, 所以 SBP很有发展潜力和
应用前景。但是目前关于 SBP催化机理的研究尚
不十分透彻,大批量分离纯化技术还不成熟,这些方
面还有待进一步研究。
2. 1 SBP的结构
SBP是与 HRP同属于植物过氧化物酶超家族
的 ∃类酶,结构和功能也非常相像,都是以血红素为
辅基的酶,在生物中广泛存在, 具有多种不同的生物
功能, 主要催化 H 2O 2对乙烯基单体 [ 10]、酚类、芳胺
类以及它们的衍生物进行氧化,包括多种木素单体
模型物,如愈创木酚、2, 3
二甲氧基酚、阿魏酸、咖啡
酸等。在结构上,它是一种由单一肽链与卟啉 ( pro

toporphy rin IX )构成的血红素蛋白 [ 11]。 SBP由 306
个氨基酸残基组成, 相对分子质量约为 3. 9 ! 104 -
4. 1 ! 104,其中含有大约 18%的糖基。其等电点约
为 3. 9,属于酸性蛋白质。
2. 2 SBP的酶学特性
与 HRP相比, SBP具有更高的催化活性、更好
的热稳定性和酸碱稳定性。 2002年, K am al等 [ 12]报
道 SBP的解链温度 ( Tm )为 86( ( pH 7. 0) , 远高于
HRP C的 74( ( pH7. 0); SBP的构象稳定性也远高
于 HRP C, SBP的结合能为 43. 3 kJ/mo,l HRP C只
有 17 kJ /mol。乔国平等 [ 13]报道了 HRP在 65( 时
已经完全失活,而 SBP在 70( 时仍可保持较高的活
力, 85( 时加热 40m in仍有 50%的酶不失活。刘稳
等 [ 14]对 SBP耐热性也做了研究, 结果表明 SBP耐
热性较好, 75( 保温 60 m in,酶活力剩余 68%, SBP
的适宜反应温度为 60 - 80( [ 15]。通过分析, 认为
SBP与 HRP C构象稳定性的不同是由于两者的血
红素键联不同,特别是与血红素相连的氨基酸活性
位点不同 [ 16 ]。SBP在很宽的 pH范围内都显示较高
的活性。国外相关研究表明 SBP在 pH3. 0- 8. 0之
间活性较高,作用范围可达 pH2. 0- 11. 0[ 17]。
2. 3 SBP的研究进展
2. 3. 1 SBP催化酚类化合物聚合反应 SBP催化
酚类化合物的特性与 HRP相似, 但由于其价廉易
得, 在废水处理方面的应用较多。刘稳等 [ 18]研究了
SBP对木素的氧化作用, 结果表明 SBP在水相系统
中对工业木素和天然木素无降解作用,但在微水有
机相中对天然木素有部分解聚作用。刘稳等还利用
SBP在水相体系中催化酚聚合的反应来处理含酚废
水, 发现水相中 SBP稳定性好, 酚去除率高, 认为
SBP作为一种较理想的氧化还原酶用于含酚废水处
理值得深入研究。Chery l等 [ 19]研究了 SBP在 H2O 2
和 NaNO 2的存在下,可以催化多种酚类物质的硝化
反应,他们以 4)
羟基
3)甲基苯乙酮为模拟底物, 探
讨了反应的影响因素,如有机溶剂种类、体系 pH、酶
浓度及酶活力和稳定性。试验证明, 硝化反应发生
在苯环上羟基的邻位和对位, 同时伴随着酮取代基
的离去。
2. 3. 2 SBP催化芳胺类化合物反应 目前, 相比
HRP来说, 用 SBP催化聚合酚类化合物的研究比较
少。Rodolfo等 [ 20]对 SBP催化聚合导电苯胺进行了
研究。试验中采用水或者水 /有机溶剂混合体系并
控温 1( ,特点在于 SBP催化聚合没有诱导期也不
存在自动加速现象,其氧化还原反应的可逆性和产
物的化学结构均依赖于体系初始 pH和反应的介
质。Rodolfo提出了如图 3的反应机理, 并利用
UV、FTIR和 WAXD对产物结构进行了表征, 发现
当体系初始 pH高于 3. 0或者采用水 /有机溶剂混
合体系时,产物的产率降低, 苯胺的邻位聚合产物
增多。
52
2010年第 4期      马艳芬等: 生物酶催化聚合的研究进展
2. 3. 3 SBP催化乙烯基单体反应 目前国外的 A

non
[ 10]做了相关报道,称利用 SBP催化合成了甲基
丙烯酸酯、丙烯酸酯等单体的有规立构聚合物。
图 3 SBP催化聚合苯胺
3 漆酶
漆酶 ( Laccase, EC 1. 10. 3. 2)是一种含铜的多
酚氧化酶,首次发现于生漆中, 属于蓝色多铜氧化酶
( blue mult i
copper ox idase)家族。漆酶广泛分布于
真菌分泌物、高等植物、少量细菌和昆虫中。分泌漆
酶的真菌主要分布于担子菌、多孔菌、子囊菌、柄孢
壳菌和曲霉菌等属种, 其中最主要的是担子菌亚门
的白腐真菌。按其来源漆酶主要分为漆树漆酶、微
生物 (包括真菌和细菌 )漆酶和动物漆酶。漆酶的
底物广泛,据统计它能催化氧化 6大类 250余种底
物 [ 21] ,主要有酚及其衍生物; 芳胺及其衍生物; 羧酸
及其衍生物;甾体激素和生物色素;金属有机化合物
和其它非酚类底物。
3. 1 漆酶的结构
漆酶具有较强的氧化还原能力, 例如漆树漆酶
能够催化木质素的聚合, 而真菌漆酶则既能催化底
物的氧化聚合,也能催化木质素等高分子化合物的
降解、去除有毒化合物的毒性作用、促进真菌色素的
合成等。不同来源的漆酶其氧化还原能力相差较
大,这与漆酶的分子结构密切相关 [ 22]。
大部分漆酶一般是由约 500个氨基酸单一多肽
组成的,其中含甘氨酸 ( G ly )、丙氨酸 (A la)等 19种
天然氨基酸。漆酶分子结构中一般含有 4个铜原
子,根据磁学和光谱学性质不同可将漆酶分子中 4
个铜原子分为 3类: I型 Cu2 + ( T1Cu)和 #型 Cu2+
( T2Cu)各 1个, 是单电子受体, 呈顺磁性; ∀型
Cu2
4 +
T3Cu)两个, 是耦合离子对,双电子受体, 反磁
性。图 4是漆酶铜原子中心结构示意图, 三核中心
位于酶蛋白中央空穴,形成相对保守的结构 [ 23]。
3. 2 漆酶的催化机理
漆酶催化机制比较复杂,能催化苯酚类、芳香胺
图 4 推测的漆酶的铜中心和氧的结合
和其他富含单电子的底物氧化,使羟基和氨基的邻、
对位活泼氢离去形成自由基, 同时将氧分子还原
成水 [ 23]。
漆酶是单电子氧化还原酶,它催化不同类型底
物的氧化反应机理主要表现在底物自由基的生成和
漆酶分子中 4个铜离子的协同作用。在催化反应过
程中,底物结合于漆酶活性中心的 I型 Cu2+ 位点,
通过半胱氨酸 -组氨酸 ( Cys
H is)途径将电子传递
给三核位点,该位点进一步把电子传递给结合到活
性中心的第二底物氧分子, 使之还原成水。整个反
应过程需要连续的单电子氧化作用来满足漆酶的充
分还原,还原态的酶分子再通过 4电子转移传递给
分子氧,在此过程中, 氧还原很可能分两步进行, 两
个电子转移产生 H 2O2中间体,该中间体在另外两单
电子作用下被还原成水。漆酶催化底物氧化和对
O2的还原是通过 4个铜离子协同地传递电子和价态
变化实现的 [ 24] , 其过程如图 5所示。
图 5 漆酶的反应机理模式
3. 3 漆酶的研究进展
3. 3. 1 漆酶催化聚合反应 付时雨, 周攀登 [ 25, 26]
用白腐菌在液体培养条件下制备了漆酶,将其用于
对苯基苯酚的催化聚合,探讨了反应温度、缓冲溶液
53
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
pH以及反应体系中溶剂 1, 4
二氧六环的含量对漆
酶催化对苯基苯酚聚合的影响,得到了重均相对分
子质量 (Mw )为 80533的聚酚产物,产率为 75. 5%。
FT IR和 1H NMR法结果显示产物主要为酚羟基的
邻位相互连接形成的聚合物。蓝虹云、雷福厚等 [ 27]
进行了漆树漆酶催化单宁酸的氧化反应研究, 他们
利用分光光度法考察漆树漆酶催化单宁酸的氧化情
况,探讨了 pH值、反应温度、单宁酸浓度、有机酸和
金属离子等对催化反应的影响。
3. 3. 2 漆酶催化氧化降解反应 漆酶具有较强的
氧化还原能力,而真菌漆酶则既能催化底物的氧化
聚合, 又能催化木质素等高分子化合物的降解,但是
在催化降解高分子化合物时需要借助某些有机介
质,目前这方面的研究也取得了一定的成果。合成
染料具有较强的耐候性、防水、抗光、抗氧化性,用常
规的物理、化学方法很难达到脱色效果,而漆酶具有
其特有的底物选择性, 对纺织染料的脱色及降解效
果明显。G raca等 [ 28]发现漆酶单独作用于靛蓝, 没
有任何脱色效果,当加入小分子氧化介质时,靛蓝就
开始脱色。
在漆酶降解高聚物方面, H iro fum i等 [ 29]发现漆
酶 / l
羟基苯并三唑 (HBT )介质系统能够有效地降解
聚乙烯和尼龙
66。用此漆酶介质系统处理 3 d后,
聚乙烯的相对分子质量从 242 kD降为 28. 3 kD, 尼
龙
66的相对分子质量则从 79. 3 kD降为 14. 7 kD。
4 展望
近年来,在酶催化聚合方面取得了一定的进展,
利用酶催化反应的区域选择性等特点, 成功地合成
了手性中间体、光电材料等多种结构特殊、性能优良
的功能高分子材料, 可以预测酶催化聚合将会继续
在新型、结构特殊的聚合物合成方面发挥重要作用。
目前, 由于酶源有限、酶价较高,酶的生产、纯化技术
不成熟,酶催化聚合的机理方面仍有待深入研究,因
此酶催化聚合的广泛应用也受到了一定的影响。不
过有理由相信随着技术的提高、研究的深入,未来酶
催化聚合将以其不可比拟的优势越来越受到关注,
并得到突破性的发展。
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