全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
羟基红花黄色素 A对脂多糖作用后血管内皮
细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响
王银光 1 　张琴 2 　涂利宽 1 　万敬员 3 　李炯 1 　罗文军 1
(1 重庆医科大学附属第二医院血管外科 ,重庆 400016; 2 重庆医科大学生物化学
与分子生物学教研室 ,重庆 400016; 3 重庆医科大学药理教研室 ,重庆 400016)
　　摘 　要 : 　旨在探讨羟基红花黄色素 A ( hydroxysafflor yellow A, HSYA)对脂多糖 ( lipopolysaccharide, LPS)作用后人脐静脉
内皮细胞株 HUVECs细胞株诱导型一氧化氮合酶 ( inducible nitric oxide synthase, iNOS)表达的影响。培养 HUVECs细胞株 ,用
1 mg/L LPS及不同浓度的 HYSA处理细胞 24 h,MTT法检测细胞增殖情况 ,硝基还原酶法检测培养液中一氧化氮 (NO )含量 ,
RT2PCR及 W estern blotting检测 iNOS表达。结果表明 0. 01、0. 1 mmol/L HYSA对 LPS引起的 iNOS升高无明显作用 ,但 1
mmol/L HYSA能明显抑制 LPS作用后高度表达的 iNOS量。因此 , HYSA能下调 LPS所致 iNOS的异常表达 ,这可能有助于临
床治疗血管炎症疾病。
关键词 : 　羟基红花黄色素 A　脂多糖 　诱导型一氧化氮合酶 　HUVECs细胞株
Effect of Hydroxysafflor Yellow A on Expression of Inducible Nitr ic Oxide
Synthase Elic ited by L ipopolysacchar ide in Vascular Endothelia l Cells
W ang Yinguang1 　Zhang Q in2 　Tu L ikuan1 　W an J ingyuan3 　L i J iong1 　Luo W enjun1
(1 Departm ent of Vascular Surgery, the Second Affilia ted Hospita l of Chongqing M edical University, Chongqing
400016; 2 Departm ent of B iochem istry and M olecular B iology, Chongqing M edical University, Chongqing
400016; 3 Departm ent of Pharm acology, Chongqing M edical University, Chongqing 400016)
　　Abs trac t: 　 It was to investigate the effect of hydroxysafflor yellow A ( HSYA) on the exp ression of lipopolysaccharide (LPS) 2elic2
ited inducible nitric oxide synthase ( iNOS) in vascular endothelia1 cell line HUVECs. Human umbilica1 vein endothelial cells HU2
VECs were induced by 1 mg/L LPS and HSYA with the concentration of 0. 01, 0. 1, 1 mmol/L respectively. Cell survival rate wasmeas2
ured by MTT assay. N itric oxide (NO) level was detected by nitrate reductase method. The iNOS exp ression was detected by RT2PCR
and W estern blotting. Results showed that there was no significant change of LPS2elicited iNOS exp ression with 0. 01, 0. 1mmol/L
HSYA, while 1 mmol/L HSYA could obviously inhibite the exp ression of iNOS induced by LPS. It can conclud that HSYA can inhibit
LPS2elicited iNOS exp ression and NO p roduction in HUVECs cells, which may be used in the treatment of vascular inflammation.
Key wo rds: 　Hydroxysafflor yellow A　L ipopolysaccharide　 Inducible nitric oxide synthase　HUVECs cell line
收稿日期 : 2008212222
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30500463)
作者简介 :王银光 (19792) ,男 ,白族 ,硕士研究生 ,研究方向 :周围血管疾病微创治疗 ; E2mail: 314629288@qq. com
通讯作者 :罗文军 , E2mail: luowenjun516@ yahoo. com. cn　　各种血管病变中 ,由诱导型一氧化氮合酶 ( iN2OS)介导释放的高浓度 NO ,是导致血管炎症和内皮功能障碍的重要因素 [ 1 ]。生理条件下 ,内皮细胞主要存在内皮型一氧化氮合酶 ( eNOS) , NO生成量较少 ,主要发挥调节血管张力、防止血小板黏附等生理功能 ;而当内毒素脂多糖 (LPS)及促炎细胞因子等 刺激血管内皮细胞时 ,可诱导血管内皮细胞诱导型一氧化氮合酶 ( iNOS)表达上调 , NO生成量明显增多。过量的 NO及其衍生物过氧亚硝基阴离子均具有细胞毒效应 ,可导致细胞损伤。羟基红花黄色素A ( hydroxysafflor yellow A , HSYA )是从传统的活血化瘀类中药红花中分离出来的、具有抗心脑缺血性
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
损伤和抗凝血 [ 2 ]、抗氧化 [ 3 ]作用的有效单体成分。
研究表明 HSYA可抑制大鼠局灶性脑缺血后脑组织
诱导型一氧化氮合酶的表达 [ 4 ] ,但目前还没有相关
研究报道 HSYA对血管内皮细胞 iNOS表达的影响。
本试验在细胞水平观察 HSYA对 LPS诱导人脐静脉
内皮细胞株 HUVECs细胞 iNOS变化的调节作用 ,
探讨 HSYA对血管疾病的治疗前景。
1　材料与方法
111　材料
人脐静脉内皮细胞株 HUVECs细胞购自重庆
医科大学组织胚胎教研室 ; HSYA购自南昌贝塔生
物科技有限公司 , LPS为 Sigma产品 ,细胞培养液
RPM I21640为 GIBCO产品 ; NO检测试剂盒为南京
建成生物公司产品 , RT2PCR试剂盒购自 Toyobo公
司 , PCR m ixture购自东盛公司 ,兔抗人 iNOS多克隆
抗体为美国 Santa Cruz公司生产 ,辣根过氧化物酶
(HRP)标记的山羊抗兔 IgG购自武汉博士德公司。
引物由上海生工合成。
112　细胞培养及预处理
细胞复苏后 ,用 RPM I21640 完全培养液 (含
10%的胎牛血清 , 100 kU /L青霉素及 100 mg/L链
霉素 ) ,在 37℃,体积分数为 5% CO2 饱和湿度培养
箱中常规培养。当细胞长至 70% ～80%时开始给
予刺激因素。细胞分为 5组 : (1)空白对照组 ; (2) 1
mg/L LPS组 ; (3) 1 mg/L LPS + 0. 01 mmol/L HSYA
组 ; (4) 1 mg/L LPS + 0. 1 mmol/L HSYA 组 ; ( 5 ) 1
mg/L LPS + 1 mmol/L HSYA组。先加 HSYA刺激 2
h后再加 LPS作用 24 h。
113　MTT检测
将细胞以 l ×104 /孔接种于 96孔板内 ,分别加
入不同浓度的 HSYA刺激 2 h后 ,加入 1 mg/L LPS
继续培养 24 h,每孔加入 20μl MTT, 37℃孵育 4 h,
弃上清 ,再加入 150μl DMSO ,振荡 10 m in,酶标仪
490 nm波长测定吸光度。细胞存活率 ( cell survival
rate) =试验组 A490 nm /对照组 A490 nm。每组设置 5个
复孔 ,取平均值。
114　NO含量检测
不同刺激因素刺激细胞 24 h后 ,收集细胞培养
基上清 ,严格按照试剂盒说明书检测不同组 NO
含量。
115　RT2PCR检测 iNOS转录水平
不同刺激因素处理细胞 24 h后 ,提取细胞总
RNA,紫外分光光度计测定总 RNA 浓度。按照
Toyobo说明书进行 cDNA第一链的合成 ,以反转录
得到的 cDNA为模板进行 PCR反应。 iNOS上下游
引物分别是 p1: 5′2GTGCCTCTATCTTAGCAGCC23′,
p2: 5′2AGTCCCCTCATCAAAGGTGG23′,反应产物长
度为 382 bp;内参照 GAPDH上下游引物分别是 p1:
5′2ACCTGACCTGCCGTCTAGAA23′, p2: 5′2TCCACCA
CCCTGTTGCTGCTGTA23′,扩增片段大小为 227 bp。
反应条件 : 94℃预变性 2 m in, 94℃ 15 s, 60℃ 15 s,
72℃ 20 s, 35个循环 ;最后 72℃延伸 5 m in。1. 5%
琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,比较各组 mRNA 水平表达
差异。
116　W estern blotting检测 iNOS蛋白表达水平
收集 1 ×106 细胞 ,按照蛋白提取试剂盒说明书
提取蛋白。经 BCA法测定蛋白含量后 ,取 30μg处
理后的蛋白样品进行 SDS2PAGE电泳并电转移至
PVDF膜上 , 5%脱脂奶粉室温振荡封闭 1 h,兔抗人
iNOS抗体 (1∶500) 4℃孵育过夜 , HRP标记的羊抗
兔二抗 (1∶2 000)室温孵育 2 h,化学发光法检测目
的蛋白 ,选用β2actin为内参。
117　统计学处理
数据采用均数 ±标准差表示。应用 SPSS10. 5
统计软件 ,通用线性模型进行单因素方差分析 (one2
way ANOVA)及两两比较。
2　结果
211　MTT检测结果
MTT检测结果如图 1所示 , 1 mg/L LPS作用后
细胞存活率为 1. 11 ±0. 01,较对照组显著增高 ( P <
0. 05 ) ; 1 mg/L LPS + 0. 01 mmol/L HSYA 组及 1
mg/L LPS + 0. 1 mmol/L HSYA 组细胞存活率均为
1. 12 ±0. 03,较 1 mg/L LPS组无明显变化 ; 1 mg/L
LPS + 1 mmol/L HSYA组细胞存活率为 0. 94 ±0. 01,
较 1 mg/L LPS组显著降低 ( P < 0. 05)。
212　NO含量检测结果
如图 2所示 ,对照组 NO含量为 65. 38μmol/L,
1 mg/L LPS作用组 NO含量为 89. 42μmol/L ,较对
照组增高 36. 8% ; 1 mg/L LPS + 0. 01 mmol/L HSYA
组及 1 mg/L LPS + 0. 1 mmol/L HSYA组 NO含量分
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2009年第 7期　　王银光等 :羟基红花黄色素 A对脂多糖作用后血管内皮细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响
1. 对照组 ; 2. 1 mg/LLPS; 3. 1 mg/L LPS + 0. 01 mmol/L HSYA; 4. 1
mg/L LPS + 0. 1 mmol/L HSYA; 5. 1 mg/L LPS + 0. 1 mmol/L HSYA
( 3 P < 0. 05与对照组 ; #P < 0. 05与 1 mg/L LPS组 )
图 1　M TT检测细胞存活率
别为 86. 54μmol/L和 84. 62μmol/L,较 1 mg/L LPS
组无明显变化 ; 1 mg/L LPS + 1 mmol/L HSYA组 NO
含量为 60. 58μmol/L,较 1 mg/L LPS组降低 32. 3%。
1. 对照组 ; 2. 1 mg/L LPS; 3. 1 mg/L LPS + 0. 01 mmol/L HSYA; 4. 1
mg/L LPS + 0. 1 mmol/L HSYA; 5. 1 mg/L LPS + 0. 1 mmol/L HSYA
( 3 P < 0. 05与对照组 ; #P < 0. 05与 1 mg/L LPS组 )
图 2　NO含量测定
213　RT2PCR结果
如图 3所示 , 1 mg/L LPS作用后 iNOS mRNA
水平较对照组明显增高 ; 1 mg/L LPS + 0. 01 mmol/L
HSYA组及 1 mg/L LPS + 0. 1 mmol/L HSYA组较 1
mg/L LPS组无明显变化 ; 1 mg/L LPS + 1 mmol/L
HSYA组较 1 mg/L LPS组显著降低。
1. 空白对照组 ; 2. 1 mg/L LPS组 ; 3. 1 mg/L LPS + 0. 01 mmol/L
HSYA组 ; 4. 1 mg/L LPS + 0. 1 mmol/L HSYA组 ; 5. 1 mg/L LPS + 1
mmol/L HSYA组
图 3　RT2PCR结果
214　W estern blotting结果
如图 4所示 ,对照组 iNOS表达较低 , 1 mg/L
LPS作用后 iNOS蛋白表达水平较对照组明显增高 ,
1 mg/L LPS + 1 mmol/L HSYA组较 1 mg/L LPS组
显著降低。
1. 空白对照组 ; 2. 1 mg/L LPS组 ;
3. 1 mg/L LPS + 0. 01 mmol/L HSYA组
图 4　W estern blotting结果
3　讨论
本试验以人脐静脉内皮细胞株 HUVECs细胞
为靶细胞 ,首次在血管内皮细胞中观察了 HSYA对
LPS诱导 HUVECs细胞的 NO生成情况及 iNOS表
达的影响。结果显示 , 1 mg/L LPS作用 24 h后 ,内
皮细胞 NO生成量明显增多 , iNOS在 mRNA水平及
蛋白水平表达均明显升高。当用不同浓度 HSYA作
用细胞 2 h后再加入 1 mg/L LPS刺激 , 0. 01及 0. 1
mmol/L HSYA对 NO生成量及 iNOS表达量无明显
影响 ,而 1 mmol/L HSYA作用于血管内皮细胞后 ,
细胞 NO生成量显著增加 ,同时 iNOS表达量明显上
调。表明 1 mmol/L HSYA可以抑制 LPS诱导的 iN2
OS的表达上调 ,减少 NO生成。
血管内皮细胞 ( vascular endothelia cell, VEC)为
衬贴于心血管内腔面的单层扁平细胞 ,是血管壁与
血液之间的分界屏障细胞。目前 ,人们认为 VEC的
生物学功能除作为屏障外 ,还是高度活跃的代谢库 ,
具有一定的抗栓功能、能合成多种血管活性物质 ,在
血管舒缩、凝血与抗凝、血液的流动性等多方面有不
可替代的调节作用。VEC的损伤和功能异常与多
种疾病的发生相关或为始动环节。脂多糖 ( lipopo2
lysaccharide, LPS)是内毒素的主要毒性成分 ,它可
激活、损伤血管内皮细胞 ,导致血管内皮细胞生理功
能失调。首先 ,它可直接损伤血管内皮细胞 ;其次 ,
可刺激血管内皮细胞产生多种细胞生长因子及炎症
介质 ,如肿瘤坏死因子 ( TNF)、白介素 21β ( IL21β)、
白介素 26 ( IL26)、环氧合酶 2 (COX22) ;同时它还可
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
以诱导 iNOS生成 ,影响细胞的氧化应激。因此 ,本
试验采用 LPS刺激 HUVECs。
血管内皮细胞主要由 iNOS通过 L2精氨酸途径
合成 NO。多种炎症信号 ,如 LPS、TNF、IL21β、干扰
素α等均可诱导血管内皮细胞 iNOS表达上调 ,促
进 NO的合成 [ 5 ]。大量生成的 NO能与氧气或过氧
化物 (O2 2)结合分别形成具有强氧化功能的氧自由
基 ROS(OONO～)或 RNOS(NO2、N2O3 )而发挥细胞
毒作用。一方面这些自由基使巯基蛋白和脂质过氧
化 ;另一方面 ,这些氧自由基可通过脱氨基作用、
DNA环的断裂、耗竭谷胱甘肽的储备来诱导 DNA
的损害 ,从而促进炎症和细胞损伤 [ 6, 7 ]。
红花在临床上主要以水煎液人药 ,红花黄色素
为红花水溶性组分 ,它是红花抗血栓有效组分 ,红花
黄色素所含主要成分为 HSYA [ 8 ] ,具抗血小板激活
因子的作用 [ 8 ] ,因此 , HSYA作为抗凝药物在血管疾
病的治疗中具有很好的应用前景。同时 ,研究表明
HSYA具有抗炎 ,抗氧化作用 ,但其具体作用机理还
不明确。本试验研究了 HSYA 对 LPS作用后 HU2
VECs表达的 iNOS的影响 ,结果表明 HSYA可以抑
制 LPS诱导的 iNOS的表达上调 ,减少 NO生成。该
研究为治疗血管炎症疾病提供了新的思路。
参 考 文 献
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(上接第 136页 )
抗在 550 nm的激发下发出的荧光 ,二抗与一抗结合
而其中一抗又是与 flag片段相结合 ,因此 ,可以表明
AGO3复合物被定位于细胞质中。
3　讨论
A rgonaute蛋白具有 N端、中间区、P IW I区和 PAZ
四个区域 , PAZ去可识别单链 siRNA的 3′端 ,在 RNA i
基因沉默途径中起着至关重要的作用 ,在焦酚火球菌
研究中发现 N端、中间区和 P IW I区在 PAZ区域上形
成一个新月状 ,该结构产生了带正电的凹槽 ,可能是
核酸结合位点 [ 11 ]。在结构中还发现具有活性部位
(A sp2A sp2H is)。人体中有 8个 AGO 蛋白成员 ,对
AGO1、AGO2、AGO3、AGO4 活性进行检测 , 发现
AGO2、AGO3具有相同的 (A sp2A sp2H is)活性部位 ,
但是只有 AGO2蛋白具有降解功能 , AGO3蛋白情况
仍未清楚。因此本试验利用亲和标签 ( flag)对目标
蛋白进行检测和监测的方法 ,将 c2flag2ago3质粒转
入人 293细胞系 ,使 AGO3蛋白在细胞内稳定表达
并对其进行细胞定位 ,为进一步检测 AGO3蛋白复
合物的结构、功能奠定了基础。
参 考 文 献
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