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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
日本结缕草总 RNA提取和 mRNA分离方法的优化
代小梅 1  程晓霞 1  曾会明 1  韩烈保1, 2
( 1北京林业大学草坪研究所,北京 100083; 2长江大学园艺园林学院,荆州 434025 )
  摘  要:  介绍了分别以日本结缕草根部、叶部、匍匐茎等为材料的总 RNA提取的改良步骤,质量和浓度检测及其注意事
项, 并采用 P rom ega公司的 PolyA T ract Systems ( Z5300) 试剂盒进行 mRNA分离,尽管这一方法成熟可行,但仍存在洗脱体
积较大, 常需先沉淀浓缩后才能进行后续试验 (如 cDNA合成 ), 在制备少量 mRNA时回收率较低等问题。据此,对 mRNA分
离方法作了改良, 介绍了 mRNA分离的优化步骤,通过增加体系形成了一种更适合于日本结缕草 mRNA分离的方法, 从而为
日本结缕草的分子生物学研究提供基础资料。结果证明所提取的总 RNA和 mRNA完整, 质量较高,并应用到日本结缕草 cD

NA文库的构建。
关键词:  日本结缕草  总 RNA mRNA分离
TheOptim ization of Total RNA Extraction andmRNA
Isolation from Zoysiagrass(Zoysia japonica)
DaiX iaom ei
1  Cheng X iaoxia1  Zeng Humi ing1  H an L iebao1, 2
(
1
Institute of T urfgrass Science of Beijing Forestry University, B eijing 100083;
2
College of Gardening and H orticulture of Yangtze University, Jingzhou 434025)
  Abstrac:t  By using the roo ts, leaves, or sto lons o fZoy sia japonica fo r the ma teria l, this paper described the improvem en t steps of
the tota lRNA extrac tion, the detec tion o f the quality and concentra tion o f the to tal RNA , and the precautions during operations. Then
the mRNA w as separated by using the k it of Prom ega s Po lyA T rac t System s ( Z5300) . A lthough th is approach is m a ture and feas i

b le, there a re still som e prob lem s such as larger e lu tion w hich needs to be first prec ipita ted and concentrated be fore fo llow
up exper i

m ents ( such as cDNA syn thesis), low recove ry rates in the prepa ration o f a sm a ll amoun t of mRNA . According ly, th is study m ade an
im proved m ethod fo r the iso lation of mRNA, and introduced the optim ization steps fo r the separa tion of mRNA. By increasing the sys

tem, am ore su itab le me thod of themRNA separa tion from Zoy sia japonica was developed so that it prov ided the basis inform ation for the
m olecular biology studies ofZoy sia japon ica. The resu lts show tha t the to talRNA and mRNA are of high quality and integ rity and can be
used for a cDNA library construction o fZoys ia japonica.
Key words:  Zoy sia japon ica Tota l RNA mRNA iso lation
收稿日期: 2010
04
26
基金项目:国家 ! 863∀计划 ( 2006AA10Z132 ) , !十一五 ∀国家科技支撑项目 ( 2006BAD01A19, 2006BAC18B 04
1) ,北京市重点实验室和北京市重
点学科专项
作者简介:代小梅,女,在读硕士,研究方向:草坪草生物技术育种; E
m ai:l aileenxiaom e@i 126. com
通讯作者:韩烈保,男,教授,博士生导师,研究方向:草坪科学与管理; E
m ai:l han lb@ tom. com
提取高质量的总 RNA和分离 mRNA是进行
N orthern分析、RT
PCR、cDNA文库构建、mRNA末
端快速扩增 ( RACE )、差异表达 ( DDRTPCR )、引物
延伸反应 ( pr imer ex tension)、RNA标志 ( RNA labe

ling)等分子生物学研究的必要前提, 是研究基因表
达的重要环节。RNA分子的分离提取是分子生物
学研究中的基本内容,是进行基因表达分析的基础。
最近几年来,有关从植物中提取总 RNA方法的报道
很多 [ 1- 6]。不同植物体内的化学成份纷繁复杂, 会
影响植物总 RNA提取的质量。例如,植物体内富含
单宁、萜烯、色素、酚等次生代谢物及蛋白质、多糖等
大分子,不但影响提取效率, 而且干扰其后的逆转
录、酶切等试验操作 [ 7, 8] , 且不同植物的代谢物, 尤
其是多糖及多酚等化合物含量亦不相同,因而尽管
2010年第 12期     代小梅等:日本结缕草总 RNA提取和 mRNA分离方法的优化
有几种提取方法常被用于植物总 RNA的分离,但由
于植物化学组分的异质性,很难有一种方法适合于所
有植物总 RNA的提取。因此,必须针对不同植物组
织的特点,对 RNA的提取方法进行优化选择 [ 9 - 14]。
日本结缕草 ( Zoy sia japonica Steud. )是禾本科
结缕草属多年生暖季型草本植物, 是一种重要的草
坪草, 抗性强,在我国分布范围较广, 在城市绿化、运
动场草坪建设、水土保持中均占有重要地位。其叶
片富含多种次生代谢物,这些物质在细胞破碎后,将
以不同的方式干扰总 RNA的提取,严重影响所提取
RNA的质量和产量, 如酚类物质氧化后可使 RNA
活性丧失,多糖可形成难溶胶状物与 RNA一起沉淀
等。因此,有效抑制次生代谢物的干扰,简化操作步
骤是植物组织中总 RNA提取的主要目标。本研究
分别以日本结缕草根部、叶部及匍匐茎为材料进行
总 RNA提取的改良,为日本结缕草的分子生物学研
究提供基础资料。
真核细胞的 mRNA分子最显著的结构特征是
在 3#末端存在由 20- 30个腺苷酸组成的 Po ly( A )
尾,这种结构为真核细胞 mRNA的提取提供了一个
选择性标志。分离的总 RNA可利用 mRNA 3#末端
含有 Po ly( A )的特点, 最近用大分子聚合物包埋的
磁性珠替代了偶联 olig( dT)的纤维素, 葡萄糖及琼
脂糖等非磁性填料, 由于磁性磁珠在磁场中可很快
沉淀, 因此免除了离心、过柱以及与之有关的操作。
本研究采用 Prom ega公司的 Po lyA Tract Systems
( Z5300) 试剂盒进行 mRNA分离, 旨在对 mRNA分
离方法作了改良, 介绍了 mRNA分离的优化步骤,
通过增加体系形成了一种更适合于日本结缕草 mR

NA分离的方法。
1 材料和方法
1. 1 试验材料及主要试剂
日本结缕草 (Zoy sia japonica S teud. )优良品种
! Zen ith∀成熟种子 (由美国 TM I公司 ( Turf M er

chants, Inc) 提供 )以次氯酸钠溶液, 加入 1 - 2滴
吐温 - 20, 在磁力搅拌器上消毒 1 h, 以无菌水冲
洗 3- 5次, 4∃ 下浸泡 3 d, 再以次氯酸钠溶液消毒
20 m in,无菌水冲洗 3次后 [ 15 ] , 用无菌滤纸吸干多
余水分, 接种于 1 /2 M S[ 16] + KT 0. 2 mg /L ( pH
58)再生培养基,置于组培室培养架上, 16 h /8 h
( Day /N ight)光照, 光强 4 000 lx,温度 28∃ 。 15 d
后用 100 mL三角瓶继代于 1 /2 M S ( pH 5. 8)培
养基。
生长 3个月的无菌苗开盖练苗 3 d,移苗至装有
等量基质 (草炭 %蛭石 = 1%1)的 11 cm直径花盆中,
置于 HPG
280B光照培养箱生长 2个月, 16 h /8 h
( D ay /N ight)光照, 光强 4 000 lx, 温度 32∃ /22∃
( D ay /N ight),湿度 66%。分别取其根部、叶部和匍
匐茎作为总 RNA提取试验材料。
次氯酸钠溶液为北京化工厂生产 (﹥ 5%活性
氯 ) ; 生化试剂氯仿、无水乙醇、异丙醇等均为国产
分析纯; TRN zo l ( DP405)为 T IANGEN公司产品;
Po ly A Tract System s ( Z5300 )为 Promega公司
产品。
1. 2 日本结缕草不同组织部位总 RNA提取
分别取日本结缕草叶片、根、匍匐茎 100 mg放
入研钵, 加液氮研磨充分, 提前将无 RN ase的 1. 5
mL离心管盖打开放入液氮中预冷, 待研磨充分的
草样在液氮中由深绿色逐渐变为浅绿色过程中, 将
草样转入预冷的离心管,扣紧管盖,迅速用镊子夹住
浸入液氮中片刻,以防离心管爆裂。
在超净工作台中将草样从液氮中取出,在草样
融化之前加入 4∃ 预冷的 1 mL的 TRN zo l溶液 (样
品体积 & 10% TRN zol体积 )进行匀浆处理, 轻微颠
倒离心管混匀以充分提取。
做好标记后,室温放置 5 - 10 m in 4∃ , 12 000
r/m in离心 10 m in,取上清 900
L入新的离心管,
加入 200
L的氯仿, 盖紧后涡旋 15 s, 室温放置
23 m in; 4∃ , 12 000 r/m in离心 10 m in, 样品 3分
层,黄色有机相, 中间层和上层无色水相, RNA主
要在水相中, 吸取上清 500
L, 加入 500
L的异
丙醇, 混匀后, - 20∃ 放置 10- 30 m in; 4∃ , 12 000
r/m in离心 10 m in, 弃上清, 沉淀用 1 mL 75%的乙
醇 ( DEPC水配制 )洗涤两次, 第二次乙醇不倒掉;
4∃ , 7 500 r /m in离心 5 m in, 弃上清, 注意不要倒
出沉淀, 剩余的少量乙醇在超净工作台里挥发; 待
沉淀吹干, 加入 RN ase free w ater 40 - 60
L, 充分
溶解 RNA。
取 2
L上样, 用 1. 2% 琼脂糖凝胶, 120 V,
电泳。
133
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
1. 3 总 RNA样品质量及浓度检测
采用紫外吸收法检测 RNA样品质量。在分光
光度计上分别测定样品在 230 nm, 260 nm, 280 nm
的吸光值 ( A ) , 计算 A260 /A280及 A260 /A 230的比值。
纯净的 RNA样品 A 260 /A 280的比值应在 1. 7- 2. 0之
间,若小于 1. 7则表明样品中有蛋白质或酚试剂污
染。A 260 /A 230的比值应大于 2. 0,如小于 2. 0则表明
RNA被异硫氰酸胍污染。
RNA的浓度测定方法如下: 纯净的 RNA样品
(无 DNA及核苷酸杂质 ) 260 nm的光吸收值等于
10时, RNA的含量为 37
g /mL, 根据此吸收值与
浓度的关系可求出任意 RNA样品的浓度。
RNA浓度 (
g /mL ) = A 260 ∋稀释倍数 ∋ 37

g /mL
取 10
L总 RNA 溶液, 加灭菌的 DEPC水至
3 mL,用紫外分光光度计测量样品在 230 nm、260
nm、280 nm 处的吸光值,计算浓度。
1. 4 日本结缕草 mRNA分离
采用 Promega公司的 Po lyA Tract System s
( Z5300)从总 RNA中分离 mRNA, 按照试剂盒说明
书操作并进行适当调整, 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定
其完整性、利用分光光度计进行浓度分析和纯度鉴
定,计算 mRNA分离产率。
141 探针退火  在一个 1. 5 mL RN ase free离心
管中, 加入未稀释的总 RNA溶液, 使终体积为 1. 5
mL;将离心管置于 65∃ 水浴 10m in;加入 15
L O li

go
dT探针和 39
L的 20 ∋ SSC于 RNA中, 颠倒数
次,混匀,室温静置至充分冷却,约 10 m in。
142 储液制备  准备 3个 1. 5 mL RNase free离
心管, 混合 30
L的 20 ∋ SSC和 1. 170 mL的 RNase
freeH2O,配制成 3管 0. 5 ∋ SSC溶液;准备 3个 1. 5
mL RNase free离心管, 混合 7
L的 20 ∋ SSC和
1393mL的 RN ase freeH 2O,配制成 3管 0. 1 ∋ SSC
溶液。
143 磁珠漂洗  取 3管磁珠,轻弹离心管底部使
SA
PMPs重悬并充分分散, 吸取悬液于 2 mL RNase
free离心管中合并为一管, 使汇总的 SA
PMPs充分
分散, 将离心管置磁架上俘获磁珠 30 s,直到磁珠吸
附于管壁上,小心吸上清液, 注意不可离心; 用 900

L 0. 5 ∋ SSC溶液漂洗 SA
PMPs,重新俘获磁珠,小
心吸去上清液, 重复漂洗 3次; 重悬漂洗过的 SA

PMPs于 300
L 0. 5 ∋ SSC溶液中。
144 O ligo( dT)
mRNA杂合分子的捕获 ( 30 m in
内做完 )  将退火的反应混合物全部加入漂洗过的
SA
PMPs离心管中与磁珠混匀,室温温浴 10m in,每
12m in轻柔颠倒 1次;用磁柱俘获磁珠,小心吸出上
清并保留;用 900
L 0. 1 ∋ SSC溶液漂洗 SA
PMPs 4
- 5次, 其间轻弹管底部使其重悬, 俘获磁珠, 尽可
能吸去清液,最后一次漂洗后在不搅动 SA
PMPs前
提下, 8 000 r/m in离心 1 m in,尽可能吸去清液。
145 洗脱 mRNA  为洗脱 mRNA,将 SA
PMPs重
悬于 100
L RNase free H2O中, 轻弹, 65∃ 水浴 2
m in; 俘获磁珠, 8 000 r /m in离心 30 s, 将 mRNA洗
脱液转移到新离心管中; 磁珠勿弃, 重悬于 150
L
RNase freeH2O中, 65∃ 水浴 2m in,俘获磁珠, 8 000
r/m in离心 2m in,将洗脱液合并, 如果有颗粒, 4∃ ,
1 000 r/m in离心 5- 10 m in去除; 磁珠保存于 100

L RNase free H2O中, 直到确认已经充分洗脱到
mRNA。
146 mRNA浓缩  加入等体积 ( 250
L)异丙醇
和 0. 1倍体积 ( 25
L) 3 M 醋酸钠 ( pH 5. 2) , 混匀,
- 20∃ 过夜沉淀 mRNA, 4∃ , 12 000 r /m in离心 20
m in; 小心倒去上清,加入 1 mL 75%乙醇洗涤沉淀,
倒去液体, 干燥沉淀; 将 mRNA溶于 20
L RN ase
free w ater中,注意管壁上通常有大量 mRNA沉淀,
用枪头反复吸取水滴在管壁上滚动几次,以尽可能
回收 mRNA并于 - 70∃ 保存。
147 1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测  取 2
L上样,
用 1. 2%琼脂糖凝胶, 120V,电泳。
148 mRNA质量和浓度检测  采用紫外吸收法
进行质量和浓度检测。取 3
L总 RNA溶液, 加灭
菌的 DEPC水至 3 mL, 用紫外分光光度计测量样
品在 230 nm、260 nm、280 nm 处的吸光值, 计算
浓度。
2 结果与分析
2. 1 日本结缕草总 RNA的提取和纯化
总 RNA中大约有 98% - 99%是核糖体 RNA,
因而总 RNA的完整性可以通过检测 rRNA的完整
性来判断。通常, rRNA的完整性通过 28S rRNA
和 18S rRNA两个特征谱带加以判断。正常情况
134
2010年第 12期     代小梅等:日本结缕草总 RNA提取和 mRNA分离方法的优化
下, 经过 1. 2%的琼脂糖凝胶电泳检测, 应该可以
看到 28S和 18S两条带且其强度比应为 2%1, 宽度
比应为 2%1,如果宽度比相反, 则说明提取的 RNA
有降解。
电泳结果 (图 1)显示, 本方法能够从日本结缕
草的成熟叶片中提取出总 RNA, 28S rRNA与 18S
rRNA条带亮度接近于 2%1, 说明 RNA未被降解。
从图 1中看出提取的总 RNA中没有 DNA污染,经
紫外分光光度计测定 230 nm、260 nm、280 nm的吸
光度, OD260 /OD280介于 1. 8- 2. 0之间, OD260 /OD230
大于 2. 0, 表明所提总 RNA较纯,没有蛋白质、酚、异
硫氰酸胍污染。RNA的平均浓度约为 4. 469
g /
L
(表 1)。通过多次试验验证, 结果稳定。
1. M ark; 2.叶部; 3.匍匐茎; 4.根部;
5.嫩叶; 6.老叶; 7.叶片; 8.叶鞘
图 1 日本结缕草不同组织总 RNA的
1. 2%琼脂糖凝胶电泳图
表 1 紫外分光光度计测定结果
编号 OD230 OD 260 OD 280 OD260 /OD280 OD260 /OD230 浓度 (
g /
L )
1 0. 176 0. 411 0. 216 1. 901 2. 330 4. 562
2 0. 163 0. 393 0. 209 1. 884 2. 401 4. 362
3 0. 169 0. 404 0. 213 1. 896 2. 388 4. 484
平均值 0. 169 0. 403 0. 213 1. 893 2. 373 4. 469
2. 2 日本结缕草 mRNA的分离
通常情况下,植物的 mRNA大小主要介于 0. 5
- 3. 0 kb之间,电泳结果显示 (图 2) , 采用 Prom ega
公司的 Po lyA Tract Systems ( Z5300) 试剂盒从总
RNA中分离出来的结缕草 mRNA未被降解,完整性
较好。经紫外分光光度计测定 230 nm、260 nm、280
nm的吸光度, OD260 /OD280介于 1. 8 - 2. 0之间,
OD 260 /OD230大于 2. 0,表明所分离 mRNA较纯, 无蛋
白质大分子及无机盐小分子污染, 可以用于 North

ern分析、RT
PCR、cDNA文库构建、DD
PCR分析及
体外翻译等分子生物学研究, 结缕草 mRNA的浓度
为 6882
g /
g(表 2)。
M. DL 2000 P lus DNA m ark er; 1. mRNA
图 2 日本结缕草植株 mRNA的
1. 2%琼脂糖凝胶电泳图
表 2 分离后的日本结缕草 mRNA质量测定
编号 OD230 OD 260 OD 280 OD260 /OD280 OD260 /OD230 浓度 (
g /
L )
1 0. 076 0. 186 0. 100 1. 852 2. 45 6. 882
3 讨论
3. 1 TRNzo l法提取总 RNA
为防止样品中含有较多蛋白, 多糖或植物结节
部分等,可在匀浆处理后离心去除,离心得到的沉淀
中包括细胞外膜,多糖, 高分子量 DNA, 上清中含有
RNA。若 RNA沉淀吹干, 加入 RNase free w ater 40
- 60
L 后不能充分溶解, 可以 55∃ 温浴 5 -
10m in,沉淀即会迅速溶解。
135
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
高质量的 RNA是进行基因克隆、基因表达研究
等的前提, 但由于 RNA很容易被 RNase降解, 并且
RNase广泛存在且很难变性失活, RNA提取的主要问
题是尽可能地防止 RN ase的污染。因此, RNA提取
中必须注意以下事项: ( 1) RNA操作区应保持清洁,
用于 RNA试验的玻璃器皿、塑料制品、试剂等应为专
用。 ( 2)操作过程中应戴口罩和一次性橡胶手套, 并
经常更换,以防止手、臂上的细菌和真菌以及 RN ase
带到离心管或污染用具。 ( 3)避免在操作中说话聊
天,防止 RNase污染。 ( 4)尽量使用一次性塑料制
品,避免共用器具,如 t ips, tubes等, 以防止产生交叉
污染,导致试验失败。 ( 5)配制溶液用的乙醇、异丙醇
等应采用未开封的新瓶。溶液需用 DEPC水配制 (加
0. 1% DEPC至重蒸水中, 过夜处理, 灭菌即为 DEPC
水 )。 ( 6)所有玻璃制品都必须 180∃ 烘 8 h以上; 塑
料制品都必须用 0. 1%的 DEPC水浸泡过夜, 然后灭
菌。 ( 7) RNase的抑制剂有 DEPC (焦碳酸二乙
酯 )、氧钒核糖核苷复合物等, 在分离 RNA的过程
中,可用抑制剂来抑制 RN ase的活性。
3. 2 结缕草 mRNA的分离
通常在使用试剂盒制备 mRNA时存在量少,回
收率较低等问题。据此, 本研究中尝试通过增加体
系和沉淀浓缩,解决了量少和回收率较低的问题,形
成了一种更适合于日本结缕草 mRNA分离的方法,
不仅对 mRNA分离方法作了改良, 也为日本结缕草
的分子生物学研究提供基础资料。试验结果证明:
所分离的 mRNA完整, 质量较高, 并应用到日本结
缕草 cDNA文库的构建。
参 考 文 献
[ 1]刘东,杨志华. CTAB法提取中草药材滇紫草细胞总 RNA. 2004,
  15( 4) : 372
373.
[ 2] C hom czyn sk i P, Sacch i N. S ingle step m ethod of RNA iso lation by
acid guan idin ium th iocynate
ph enol
ch loroform extraction. Anal B io

chem, 1987, 162 ( 1 ) : 156
159.
[ 3]王昆,王颖,鲍永利,等.提取高质量人参 RNA的方法研究.生物
化学与生物物理进, 2006, 3( 1 ) : 95
99.
[ 4]袁明珠,温柔,刘吉升,等.几种植物材料中总 RNA的提取.分子
植物育种, 2005, 3( 2) : 285
292.
[ 5] Geh rjg H, W inter K, Cushman J, et a.l An imp roved RNA isolation
m ethod for succu lent p lant species rich in po lyphenols and polysac

charide. P lan tMo lB iolRep, 2000, 18 ( 3) : 369
376.
[ 6]孙超,陈维多,林忠平. 一种改进沙蒿总 RNA的提取方法.生物
技术通报, 2004( 5) : 43
44.
[ 7 ]李宏, 王新力. 植物组织 RNA 提取的难点及对策. 生物技术通
报, 1999 ( 1) : 36
39.
[ 8]W an CY, W ilk ins TA. A m od ified hot borate m ethod s ign if ican tly en

hances the y ield of h igh
quality RNA from cot ton. Anal B iochem,
1994, 200 ( 3 ): 712.
[ 9] M atth eus N, E kram oddou llah AK, Lee SP. Isolation of h igh
quality
RNA from wh ite spruce tissue us ing a th ree
stage purif icat ion m ethod
and subsequen t clon ing of a transcript from the pp
10 gen e fam ily.
Phytoch em Ana, 2003, 114 ( 4) : 209
215.
[ 10]周明兵,汤定钦.小佛肚竹和螺节竹总 RNA的提取.竹子研究
汇刊, 2004, 23( 3 ) : 710.
[ 11]周明兵,王红珍,赵德刚,等.杜仲叶和树皮总 RNA的快速提取
法.山地农业生物学报, 2003, 22 ( 5 ): 430
431.
[ 12]杨传平,姜静,那冬辰,等.白桦花芽 RNA的快速提取. 东北林
业大学学报, 2002, 30( 3 ) : 14.
[ 13]庄军平,苏菁,陈维信,等.一种从香蕉果实提取高质量 RNA的
方法.分子植物育种, 2006, 4( 1 ): 143
146.
[ 14]孟丽,周林,张明姝, 等.一种有效的花瓣总 RNA的提取方法,
生物技术, 2006, 16( 1 ) : 38
40.
[ 15]齐春辉,韩烈保,梁小红, 等. 以基因枪法转化日本结缕草获得
转基因植株.北京林业大学学报, 2006, 28 ( 3) : 71
75.
[ 16]M urash ige T, Sk oog F. A rev ised m ed ium for rap id grow th and b io
assays w ith tob acco tissue cultures. Physiol Plan t, 1962, 15:
473
497.
136