全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
马铃薯块茎组织特异性启动子的克隆及序列分析
陈国梁 陈宗礼 贺晓龙 罗茜
(延安大学生命科学学院 陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，延安 716000)
摘 要: 利用 PCR技术从马铃薯陇薯 3 号基因组 DNA中扩增出长度约为 1. 0 kb 的 DNA 片段，经与 T 载体连接，测序
表明，克隆到的 DNA片段大小为 969 bp，该序列与 GenBank中已公布的 patatin启动子序列同源性为 97. 94%;采用植物顺式
调控元件数据库 PLACE和 PlantCare 进行序列分析，结果表明，该片段含有启动子的保守序列 TATA-box 和 CAAT-box，且在
CAAT-box上游有 8 bp的增强子。此外，还具有马铃薯块茎蛋白 patatin 基因启动子保守调控序列的蔗糖效应元件(SURE)4
个及马铃薯储藏物特异结合调控 patatin蛋白表达位点(B-box)2 个，而这些特异序列可能是基因特异表达所必须的。
关键字: 马铃薯 组织特异性 启动子 PCR
Cloning and Sequencing of Potato Tuber Tissue-specific Promoter Region
Chen Guoliang Chen Zongli He Xiaolong Luo Xi
(College of Life Science Yanan University，Shaanxi Engineering ＆ Technological Research
Center for Conversation ＆ Utilization of Regional Biological Resources，Yanan 716000)
Abstract: The patatin gene promoter region was amplified from Solanum tuberosumn genomic DNA by polymerase chain reaction
(PCR)and cloned into the T-vector． The sequence analysis showed that the size of sequence is 969 bp，and its homology was 97. 94%
with published sequence of the patatin promoter in GenBank． Using PLACE and PlantCare sequence database analysis showed that the
fragment containing the conserved promoter sequence，such as TATA-box，CAAT-box and enhancer element motif upstream of CAAT-
box． In addition，the fragment containing four Sucrose Responsive Elements(SURE)of conserved among genes regulated by sucrose in
the patatin gene promoter of potato and tow B-boxes of involved in potato tuber- specific and sucrose-inducible gene expression，these
specific gene sequences may be necessary for specific expression．
Key words: Potato Tissue-specific Promoter PCR
收稿日期:2011-02-18
基金项目:陕西省教育厅省级重点实验室重点科研计划项目(2010JS065) ，延安市科技发展计划项目(2010kn-03) ，延安大学专项科研基金项
目，延安大学大学生科技创新训练项目(YD2008-106)
作者简介:陈国梁，男，硕士，讲师，研究方向:植物生物技术;E-mail:glc9359@ 163． com
通讯作者:陈宗礼，E-mail:zongli_chen@ yahoo． com． cn
组成型表达启动子是植物基因工程中应用最
早、最广泛的一类启动子，由于其具有表达持续性、
表达量基本恒定等特点，致使其下游基因持续表达，
跨度宿主植物的整个生命周期以及所有的组织器
官，这不仅浪费宿主生物的能源，还可能导致宿主植
物性状的改变，甚至使得外源基因产物可能对植物
的生长发育产生不利影响而导致死亡［1 － 5］。而进行
遗传改良时，人们希望插入的外源基因能够在特定
的组织中表达，使受体获得有益的性状而不影响其
他特性，这就需要特异性启动子对靶基因的表达进
行调控。组织特异性启动子由于具有将外源基因在
转基因植物中定位表达，不仅可以降低植物负担、减
轻对作物农艺性状的影响，还可以提高外源基因在
特定部位的浓度，增加转基因的效果［4］，因此人们
对特异性启动子的研究和应用越来越重视［5 － 8］。基
于此，该研究对马铃薯块茎组织特异性启动子 pata-
tin进行了克隆及序列分析，为利用基因工程定向改
良马铃薯品质及其性状等研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 马铃薯试管苗 陇薯 3 号马铃薯试管苗，由
延安大学生命科学学院提供。
96
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
1. 1. 2 试剂 pGEM-T vector购买于北京泽平科技有
限责任公司;限制性内切酶、连接酶、Taq酶与 RNase
A均购自上海生物工程公司;寡核苷酸引物由上海
生工生物技术公司合成;其他生化试剂和常规试剂
均为国产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 马铃薯总 DNA的提取 取马铃薯试管苗叶
片，采用 CTAB法［9］提取马铃薯总 DNA。
1. 2. 2 目的片段的扩增 在 GenBank 中查找已公
布的马铃薯块茎 patatin 启动子序列并利用 Oli-
go6. 0 软件设计 PCR 扩增引物 P1(5-TGCGTATT-
AGTTTTAGCGACGA-3)与 P2(5-TACAAGCATG-
GTATATATAGGCACG-3) ;以所提取 DNA为模板，
P1、P2 作引物，配成 25 μL 的反应体系(含 Taq 酶
缓冲液、dNTP、Taq酶) ，在 95℃ 5 min;95℃ 40 s;
54℃ 50 s;72℃ 60 s 扩增 30 个循环;72℃保温
10 min。
取 5 μL PCR 扩增产进行电泳检测，将扩增的
单一条带进行回收。
1. 2. 3 PCR产物与 T 载体的连接及鉴定 取上述
PCR回收产物与 T 载体连接，采用热激法转化大肠
杆菌 DH5α并进行蓝白斑筛选，将经 PCR鉴定的阳
性质粒 DNA用 SacⅠ、XhoⅠ进行双酶切鉴定，经上
述鉴定所得阳性重组子送至上海生物工程公司
测序。
1. 2. 4 序列分析 序列同源性分析采用 DNAMAN
软件完成，启动子序列调控元件分析利用植物顺势
调控元件数据库 PLACE(http:/ /www． dna． affrc． go．
jp /PLACE /signalscan． html)和 PlantCare (http:/ /
bioinformatics． psb． ugent． be /webtools /plantcare /ht-
ml /)完成。
2 结果
2. 1 目的片段的扩增结果
以马铃薯总 DNA 为模板扩增所得产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为 1 000 bp 的
DNA片段(图 1) ，条带单一、整齐、明亮。
2. 2 重组质粒的 PCR检测及酶切鉴定
以初步筛选出来的质粒 DNA 为模板进行 PCR
扩增及经 SacⅠ /XhoⅠ双酶切后电泳检测，均获得
大小约为 1 000 bp 的单一明亮条带(图 2，图 3) ，片
段大小与预期一致，表明外源 DNA片段已经连接到
T载体上。
1，2．扩增片段;M． MarkerⅡ
图 1 目的片段 PCR扩增产物电泳图
1． PCR产物;M． DL2000 Marker
图 2 重组质粒 PCR鉴定电泳图
M． Marker Ⅱ;1，2．酶切产物
图 3 重组质粒 SacⅠ、XhoⅠ酶切电泳图
2. 3 测序结果
将所克隆的马铃薯启动子与 GenBank 中的马
铃薯 patatin启动子序列进行对比分析表明，克隆到
的序列大小为 969 bp，与 GenBank 中已公布 patatin
启动子序列的同源性为 97. 94%，说明 patatin 启动
子区序列呈现高度保守。
07
2011 年第 7 期 陈国梁等:马铃薯块茎组织特异性启动子的克隆及序列分析
图 4 马铃薯 patatin启动子序列分析图
3 讨论
本研究所克隆的马铃薯块茎组织特异性启动子
969 bp 片段内 AT 碱基含量较高，占 68. 5%，采用
PLACE及 PlantCare在线进行启动子预测分析，结果
(图 4)显示，在 805 － 811 bp、881 － 885 bp 和 951 －
958 bp处有 3 个 TATA-box，其功能是保证转录得以
精确起始;在 611 － 615 bp、664 － 667 bp 和 913 －
924 bp处有 3 个 CAAT-box，决定着启动子的起始频
率，且在 913 － 924 bp 处的 CAAT box 上游有 8 bp
的增强子顺式作用序列，以增强启动子转录活性;
有 2 个 SURE1 和 2 个 SURE2 蔗糖效应元件，分别
在 504 － 512 bp、823 － 831 bp、491 － 499 bp和 810 －
818 bp处，是马铃薯块茎蛋白 patatin 基因启动子一
保守调控序列;在 413 － 422 bp、770 － 779 bp 处有 2
个 B-box位点，是马铃薯储藏物特异结合调控 pata-
tin蛋白表达位点;在 399 － 403 bp、461 － 465 bp 和
499 － 503 bp处有 3 个 TAAAG motif，是反式作用因
子 StDof1 蛋白结合位点，与马铃薯块茎保卫细胞
K +通道调节相关;还含有众多光效应的顺式作用元
件，如 G-box(56 － 61 bp、942 － 947 bp)、I-box(617 －
625 bp)、AAAC-motif(681 － 691 bp、942 － 947 bp)、
ATCT-motif(153 －161 bp)、马铃薯块茎 3-AF1结合位
点(223 －333 bp)。以上序列分析表明，克隆的片段
不仅具有完整的启动子表达调控元件，还具有可能
与组织特异性相关的特异序列(如 SURE 和 TAAAG
motif，且 TAAAG motif 位于两个 SURE 之间) ，而这
些特异序列也正是基因特异表达所必须的［10］。
在植物基因工程研究中，利用组织特异性启动
子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织
部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营
养的不必要浪费，并表现出发育调节的特性。pata-
tin启动子是马铃薯块茎特异蛋白启动子，能够专一
性的在块茎发生和形成过程中高水平表达［11］。试
验表明［12］，将组成型表达的花椰菜花叶病毒启动子
和大肠杆菌 ADPG焦磷酸化酶(AGPP)的表达载体
转入马铃薯植株中，淀粉的颗粒形态发生了变化，显
微镜下可以看到淀粉颗粒出现了裂痕，但在马铃薯
块茎特异表达启动子 patatin 的控制下淀粉形态却
没有发生任何改变。而对马铃薯品质的改良，归根
结底是对贮藏器官———块茎中的基因表达进行调
控，因此，克隆到的 patatin 基因启动子，作为一种重
要的顺式作用元件，为其在马铃薯品质改良的基因
17
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
工程研究中进一步应用奠定基础。
参 考 文 献
［1］马莲菊，张宝石．特异性启动子在植物基因工程中的应用．生物
工程学报，2006，22(6) :882-890．
［2］宋扬，周军会，张永强．植物组织特异性启动子研究．生物技术通
报，2007(6) :21-24．
［3］姚嵘，马三梅．植物果实的特异型启动子． 生命的化学，2006，26
(4) :336-338．
［4］胡廷章，罗凯，甘丽萍，等．植物基因启动子的类型及其应用．湖
北农业科学，2007，46(1) :149-151．
［5］王淼，王旭静，唐巧玲，等．高等植物绿色组织特异表达启动子研
究进展．中国农业科技导报，2010，12(2) :33-37．
［6］李翠，谢华，徐勇，等．桃 PpMADS1 基因启动子的克隆及功能分
析．中国生物工程杂志，2010，30(5) :57-62．
［7］林元震，张志毅，郭海，等． 杨树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)
基因启动子的克隆与分析． 基因组学与应用生物学，2009，28
(3) :445-449．
［8］王静澄，李昊，崔东清，等．毛白杨 PtSEP3-1 基因启动子的克隆分
析及其表达载体构建． 基因组学与应用生物学，2010，29(2) :
239-244．
［9］萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯 T． 分子克隆实验指南
［M］．北京:科学出版社，1992．
［10］Liu XJ，Prat S，Willmitzer L，et al． Cis regulatory elements directing
tuber-specific and sucrose-inducible expression of a chimeric class I
patatin promoter GUS-gene fusion． Mol Gen Genet，1990，223(3) :
401-406．
［11］刘兴军，赵微平，林忠平． 马铃薯 Patatin class-Ⅰ启动子及信号
肽基因的克隆和序列分析．生物工程进展，1996，16(2) :29-30．
［12］ Iglesias AA，Barry GF，Meyer C，et al． Expression of the potato tu-
ber ADP-glucose pyrophosphorylase in Escherichia coli． The Journal
of Biological Chemistry，1993，268(2) :1081-1086．
(责任编辑 马鑫
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 68 页)
［12］于寒松，张继星，马兰青，等． 利用 CODEHOP 方法克隆高山红
景天葡萄糖基转移酶基因 cDNA 片段． 吉林农业大学学报，
2008，30(2) :150-153．
［13］ Sambrook J，Russell DW. Molecular cloning:a laboratory manual
［M］(3rd ed．)． New York:Cold Spring Harbor Laboratory
Press，2001．
［14］牛天敏，马会勤，陈尚武． 大豆查尔酮合成酶(CHS)基因的克
隆、表达及其在雪莲提取液中的代谢产物分析．中国生物工程
杂志，2007，27(2) :58-64．
［15］谢修志，陈兆平，王小菁．非洲菊查尔酮合酶基因的克隆、序列
分析及在大肠杆菌中的表达． 热带亚热带植物学报，2004，12
(5) :431-434．
［16］ Xu F，Cheng SY，Wang Y，et al． Efficient amplification and se-
quence analysis of chalcone synthase gene from Ginkgo biloba by
thermal asymmetric interlaced PCR. J Fruit Science，2007，24(2) :
237-243．
(责任编辑 李楠)
27