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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
重叠 PCR法构建副猪嗜血杆菌外源打靶基因
张念章 储岳峰 赵萍 高鹏程 贺英 逯忠新
(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室
农业部草食动物疫病重点开放实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室，兰州 730046)
摘 要: 利用重叠 PCR法构建了包含副猪嗜血杆菌血清 5 型 hhdA 基因上、下游同源臂(H-up、H-down)和卡那霉素抗
性基因(Kan)的外源打靶基因 Hup-kan-Hdown。通过对反应条件进行优化，发现退火温度为 50. 5℃，加入 H-up、H-down和 Kan
各为 5 μL(450 ng)时得到 Hup-kan-Hdown的量最多。将此外源打靶基因的两端引入 Pst I和 Sac I酶切位点，克隆至具有迁移
作用的自杀质粒 pDS132，构建了可在大肠杆菌 E. coli SM10-λpir中稳定遗传的打靶载体，为下一步建立副猪嗜血杆菌的高效
基因打靶系统奠定基础。
关键词: 副猪嗜血杆菌 重叠 PCR 外源打靶基因
Construction of Foreign Targeting Gene of Haemophilus parasuis by
Overlapping PCR
Zhang Nianzhang Chu Yuefeng Zhao Ping Gao Pengcheng He Ying Lu Zhongxin
(Key Laboratory of Grazing Animal Diseases of Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture，
State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Lanzhou Veterinary Research Institute，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046)
Abstract: The foreign targeting gene，Hup-kan-Hdown，which includes upstream and downstream homologous genes of hhdA(H-
up，H-down)of Haemophilus parasuis serotype 5 and kanamycin resistant gene(Kan) ，was constructed by overlapping PCR for the first
time． The optimized condition for the maximum production of overlapping PCR was that annealing temperature of the first reaction was
50. 5℃，the amounts of H-up，Kan and H-down products was equal in 5 μL(450 ng)． The fusion fragment was then cloned to a suicide
plasmid pDS132 and a recombinant plasmid for gene targeting was constructed． The recombinant plasmid could stably duplicate in E. coli
SM10-λpir． The results provide the basis for establishment of an efficient gene targeting operating system for Haemophilus parasuis．
Key words: Haemophilus parasuis Fusion PCR Foreign targeting gene
收稿日期:2011-01-06
基金项目:国家重点基础研究发展计划(“973”)项目(2006CB504403) ，“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD06A01，2006BAD06A12) ，家畜疫
病病原生物学国家重点实验室基金项目(SKLVEB2008ZZKT009) ，广东省兽医公共卫生公共实验室开放基金项目(GSKJ090202)
作者简介:张念章，男，硕士研究生，研究方向:细菌分子生物学;E-mail:nianzhang2008@ yahoo. com. cn
通讯作者:逯忠新，E-mail:luzhongxin@ hotmail. com
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)是猪
Glassers病的病原菌［1，2］。因能引起猪的纤维素性
多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎［3］而严重影响仔猪
的发育，给养猪业带来巨大损失。但目前对 Hps 的
毒力因子、致病机理等尚不十分清楚。因此，亟待建
立一套有效的基因操作系统，对 Hps 毒力基因进行
研究［4］。目前，除利用 cAMP 依赖的自然转化法构
建 Hps thy 与 fur 基因缺失株以外［5，6］，鲜有对其进
行定点突变的报道。
构建重组 DNA 片段的传统方法包括利用合适
的限制性内切酶连接重组和通过加连接子连接重组
等，这两种方法不但费时费力，而且对于长片段的连
接有时难以找到合适的酶切位点。而使用重叠延伸
引物，将 3 个 DNA片段放在同一个反应里进行聚合
酶链反应扩增的重叠 PCR(overlapping PCR)方法不
需要限制性内切酶消化和连接酶处理，为同源重组
2011 年第 7 期 张念章等:重叠 PCR法构建副猪嗜血杆菌外源打靶基因
DNA片段的构建提供了快速简捷的途径［7］。本研
究首次以 Hps hhdA 基因为对象，利用重叠 PCR 方
法构建其外源打靶基因，并对该反应体系和技术过
程进行优化，为下一步通过基因打靶建立可稳定遗
传的 Hps基因工程缺失株奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 菌株、质粒、培养基及试剂
菌株及质粒载体见表 1。LB 培养基，LB 抗性培
养基(卡那霉素 50 μg /mL、氨苄青霉素 20 μg /mL、氯
霉素 25 μg /mL)用于培养大肠杆菌。进行蓝白斑筛
选时分别将16 μL X-gal(24 mg /mL)和4 μL IPTG(20
mg /mL)涂布 LB平板［8］。固体培养基 TSA和液体培
养基 TSB 用于培养副猪嗜血杆菌［9］。细菌基因组
DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒为 TIANGEN
公司产品，Agarose Gel DNA Purification Kit Ver． 2. 0、
DNA Fragment Purification Kit Ver． 2. 0、Taq 预混酶、
连接酶、限制性内切酶、碱性磷酸酶和 DNA Marker购
自大连 TaKaRa公司。
表 1 菌株与质粒
菌株 /质粒 描述 来源
菌株
DH5α lacZ△M15△(lacZYA-argF) 由本实验室保存
Hps strain Nagasaki Hps血清 5 型参考菌株
澳大利亚昆士兰动物卫生研究所
P. J. Blackall博士惠赠
E. coli SM10-λpir thi thr leu tonA lacY supE recA::RP4-2-Tc::Mu Km λ pir Donnenberg and Kaper［10］
E. coli SM10-pDS132 含有 pDS132 的 E. coli SM10λpir 兰州兽医研究所刘永生博士惠赠
E. coli SM10-pDS-HPhhdA-Kan 含有重组质粒 pDS-HPhhdA-Kan的 E. coli SM10λpir 本实验构建
质粒
pMD19-T 含有氨苄青霉素抗性(AmpR) 本实验室保存
pMD-HPhhdA-Kan 克隆 Hup-kan-Hdown外源打靶基因的 pMD19-T 本实验构建
pET-30a 含有卡那抗性基因(KanR) 本实验室保存
pDS132 R6K ori，氯霉素抗性(CmR) ，蔗糖敏感基因(SacB) Nadege等［11］
pDS-HPhhdA-Kan 含 Hup-kan-Hdown外源打靶基因的 pDS132 本实验构建
1. 2 待融合片段的独立扩增
待融合基因片段包括 Hps hhdA基因上游同源臂
H-up、下游同源臂 H-down和卡那霉素抗性基因(Kan)。
其中，Kan基因为从质粒 pET-30a上扩增获得。各目的
片段所用引物、扩增条件及长度见表 2。其中，Kan-F的
前28个碱基位置在Hps hhdA的949 －976 nt，是H-up的
最后28个碱基。Hdown-F的前 28个碱基位置在 pET-
30a的4863 －4890 nt，是 Kan-R的最后 28个碱基。
表 2 待融合片段 PCR反应条件及扩增产物长度
待融合片段 引物名称 引物序列 退火温度(℃) 扩增长度(bp)
H-up
Hup-F CCGAGCTCCGAGTATCATCGGTGGTC 50 794
Hup-R GTAATGCTGCCTTGTGCT
Kan
Kan-F
CTAAATTTGAAGCACAAGGCAGCATTAC
CCTTTGATCTTTTCTACG
52 958
Kan-R AATATGTATCCGCTCATG
H-down
Hdown-F
AGAATTAATTCATGAGCGGATACATATT
CTGATGTTGCAGTGGGTA
49. 5 512
Hdown-R GCTGCAGCTTGTTTCGCTGACTTTAT
下划线表示片段间重叠区域序列，斜体表示酶切位点
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1. 3 重叠 PCR条件优化及外源打靶基因的构建
构建外源打靶基因的重叠 PCR 采用二步法操
作。第一步反应在 50 μL 体系中进行，其中加入纯
化后的 3 条待融合片段的量各为 5 μL(450 ng) ，Taq
预混酶 25 μL，灭菌蒸馏水补足。反应条件为 94℃
预变性 5 min后，94℃ 45 s、50. 5℃ 45 s、72℃ 1 min
50 s进行 18 个循环。优化条件时，将该反应在不同
退火温度(49℃、49. 5℃、50℃、50. 5℃)下进行，摸
索其最佳退火条件。然后，将 3 条待融合片段按不
同量(3 － 6 μL)等体积混合，以确定其最佳用量。
第二步反应以第一步产物 2 μL 为模板，Hup-F 和
Hdown-R为引物各 1 μL，Taq预混酶 25 μL，加水至
50 μL 进行 PCR。反应条件为 94℃ 5 min，94℃ 1
min 45 s，58. 5℃ 1 min 45 s，72℃ 2 min 共 30 个循
环。将第二步 PCR 产物凝胶电泳后，回收约 2 200
bp的目的条带。将回收产物连接 pMD19-T，转化
DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆，并进行酶切和测序鉴
定。构建外源打靶基因的技术路线，见图 1。
图 1 重叠 PCR方法构建 Hps hhdA外源打靶基因图解
1. 4 打靶载体的构建
从 1. 3 获得的阳性克隆中提取重组质粒，用 Sac
I和 Pst I 双酶切，回收大约 2 200 bp 的外源打靶基
因。同时双酶切自杀质粒 pDS132，经碱性磷酸酶消
化后，与打靶基因用 T4 DNA 连接酶 4℃过夜连接。
热击法转化 E. coli SM10，LB 卡那霉素抗性平板筛
选重组阳性菌落，命名为 E. coli SM10-pDS-HPhhdA-
Kan，提取重组质粒进行 PCR和测序鉴定。
1. 5 打靶载体在宿主菌中的稳定性
将 E. coli SM10-pDS-HPhhdA-Kan 在含氯霉素、
卡那霉素双抗性的培养基上连续传代 5 次，甘油保
存-70℃反复冻融两次后接种卡那霉素抗性培养基
培养，观察其生长情况，并扩增融合片段观察重组质
粒在 E. coli SM10 中的稳定性。
2 结果
2. 1 三个待融合片段的 PCR扩增
分别从 Hps 血清 5 型基因组 DNA 中扩增得到
hhdA基因上游同源臂 H-up 794 bp 和下游同源臂
H-down 512 bp目的片段，从质粒 pET-30a中扩增出
958 bp Kan基因片段(图 2)。
M． DNA分子量标准;1． H-up 基因 PCR 产物;2． H-down 基
因 PCR产物;3． kan基因 PCR产物;4．空白对照
图 2 H-up、H-down 和 Kan基因 PCR产物电泳图
2. 2 重叠 PCR条件和融合片段的构建
重叠 PCR第一步反应中，当 3 条待融合片段均
为 3 μL 时，不能出现预期电泳条带，5 μL 和 6 μL
时电泳条带亮度相同(图 3)。而仅当退火温度在
50. 5℃时可获得第一步反应目的产物(图 4)。在打
靶基因连接 pMD19-T载体、转化 DH5α 后的阳性克
隆中提取重组质粒，经 Sac I和 Pst I双酶切后，出现
大约 2 700 bp和 2 200 bp 的条带(图 5) ，表明试验
获得了含有外源打靶基因的重组质粒。将重组质粒
外源打靶基因的测序结果用 NCBI 网站在线 BLAST
软件进行分析，结果表明用重叠 PCR方法构建的外
源打靶基因没有发生碱基改变。
2. 3 打靶载体的构建
提取 LB 卡那霉素抗性平板上生长的阳性菌落
中的重组质粒，用引物 Hup-F、Hdown-R 对重组质粒
进行 PCR鉴定，结果扩增出约 2 200 bp 的条带(图
6)。对 pDS-HPhhdA-Kan中的插入序列进行测序并
与 3 条独立基因片段碱基序列进行在线 BLAST 比
较，结果与预期的一致。
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2011 年第 7 期 张念章等:重叠 PCR法构建副猪嗜血杆菌外源打靶基因
M． wide rang DNA marker(500 － 12 000 bp) ;1． 3 μL;2． 4
μL;3． 5 μL;4． 6 μL
图 3 三个待融合片段分别为 3 －6 μL
时重叠 PCR产物电泳图
M． wide rang DNA marker(500 － 12 000 bp) ;1． 50. 5℃;2．
50℃;3． 49. 5℃;4． 49℃
图 4 Hup-kan-Hdown片段不同退火温度下
重叠 PCR产物电泳图
M． wide rang DNA marker(500 － 12 000 bp) ;1． pMD19-
HPhhdA-Kan酶切产物
图 5 pMD19-HPhhdA-Kan酶切鉴定
M． wide rang DNA marker(500 － 12 000 bp) ;1． PCR扩增
结果
图 6 pDS-HPhhdA-Kan PCR鉴定结果
2. 4 打靶载体稳定性分析
E. coli SM10-pDS-HPhhdA-Kan 在含氯霉素、卡
那霉素双抗性的培养基上连续传代 5 次，甘油保存
－70℃反复冻融两次后，其生长速度未发生明显改
变。提取两种方法处理后的重组菌中的质粒进行
PCR鉴定，结果均可扩增出预期的约 2 200 bp 目的
条带。
3 讨论
建立一套有效的 Hps遗传操作系统是研究 Hps
基因功能、阐明其致病与免疫机制的重要平台，其中
构建有效的打靶载体是建立平台的重要工具之一。
目前，文献报道的 Hps 定向突变体构建成功的例子
仅有 Bigas等［5，6］利用 cAMP 依赖的自然转化法构
建的 Hps thy 与 fur 基因缺失株，均是利用 DNA 连
接酶将互补的黏性末端连接构建外源打靶基因。这
种构建融合片段的方法易造成碱基的突变，而且往
往因为找不到合适的酶切位点而受到限制。因此，
自 2006 年该方法被报道以来，再无进一步报道。重
叠 PCR方法因其节省了操作步骤，提高了融合片段
的保真度和产量，减少了无关碱基的引入，可以确保
DNA片段的精确重组，是用来构建基因敲除打靶基
因的较优方法，已在多种微生物的研究中应
用［12，13］。本研究将该方法用于构建 Hps 外源打靶
基因并进一步构建了打靶载体，对重组质粒 pMD-
HPhhdA-Kan、pDS-HPhhdA-Kan 插入片段测序分析
表明其碱基序列与融合前基因片段序列一致，从而
成功构建了 Hps hhdA 基因的外源打靶载体。研究
表明，同源重组的效率会随同源序列长度的增长而
提高。Meike等［14］利用 1 kb 的同源序列构建出痤
疮丙酸杆菌的突变株，而李文军［15］利用不足 1 kb
的同源序列便构建了多株链球菌突变株。因此，本
试验设计了约 1. 3 kb 的同源序列作为外源打靶基
因，可以确保同源重组的发生。
重叠 PCR技术的操作过程需注意引物重叠延
伸区域的长度、退火温度、加入待融合片段的量及其
保真性等方面［7］。本试验在引物中设计了 28 bp 的
重叠延伸区域，确保了片段间的有效融合。为提高
待融合片段的保真性，用 PCR产物纯化试剂盒取代
凝胶产物回收试剂盒进行纯化，避免了紫外光照和
EB可能引起的碱基的变化。对退火温度与使用的
待融合片段的量进行优化时，得到了 50. 5℃的退火
温度和加入待融合片段各为 5 μL的最优条件。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
重组菌传代及冻融试验结果表明重组质粒均没
有丢失，构建的重组菌具有较好的稳定性，外源打靶
载体可在含 λpir 基因的大肠杆菌中稳定存在，这为
下一步 Hps 同源重组突变株的构建奠定了物质
基础。
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(责任编辑 李楠)
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