全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
副猪嗜血杆菌毒力因子研究进展
冯小明 储岳峰 贺英 高鹏程 赵萍 郭晗 樊祜卿 逯忠新
(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部草食动物疫病重点开放实验室
农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州 730046 )
收稿日期: 20100907
基金项目:国家重点基础研究发展计划 973!项目 ( 2006CB504403) ,国家 十一五 !科技支撑计划项目 ( 2006BAD06A01, 2006BAD06A12 )
作者简介:冯小明,男,在读硕士研究生,研究方向:细菌病原分子微生物; Em ai:l fxm 8006@ sohu com
通讯作者:逯忠新,男,研究员,研究方向:细菌分子生物学; Em ai:l luzhongx in@ hotm ail com
摘 要: 副猪嗜血杆菌 (Haem ophilus parasu is, HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌,但却因其被证明是以多发性浆膜炎、关
节炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的 G lasser病的病原体而广受关注。介绍了巴氏杆菌科一些常见的毒力相关蛋白、神
经氨酸酶、血清型以及毒力相关的三聚自身转运载体与 HPS毒力之间的关系, 另外就近年来对 HPS毒力因子方面的一些研究
报道和成果作一综述。
关键词: 副猪嗜血杆菌 毒力因子 毒力相关的三聚自身转运载体 神经氨酸酶 转铁蛋白
Advances in Research of V irulence Factors inHaemophilus parasuis
Feng X iaom ing Chu Yuefeng H e Y ing Gao Pengcheng
Zhao P ing GuoH an FanH uqing Lu Zhongx in
(K ey Laboratory of A nimal Virology of theM inistry of A griculture, S tateK ey Laboratory of Veterinary EtiologicalB iology,
Lanzhou Veterinary R esearch Institute, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Lanzhou 730046)
Abstrac:t Haem ophilus parasu is wh ich reside in the upper respiratory tract of sw ine ex tensively, w as pa id grow ing attention as the
pathogen o f G lassers diseasew ith po lyserositis, arthr itis, dyspnea, high fev er and high mo rta lity. The artic le introduced the re lationship
o f som e comm on v irulence re la ted pro teins by pasteure lla, mucopo ly sacchar ideNace tylneuram iny lhydro lase, sero type, transferr in and
v iru lence assoc iated tr ime ric auto transpo rters( V taA ). M o reover, the new reports and ach ievem ents o f the v irulence factors to HPS w ere
rev iew ed in th is article.
Key words: Haem ophilus parasuis V iru lence facto rs V iru lence assoc iated trim er ic au to transporters Neuram inidase T rans
ferrin
副猪嗜血杆菌是上呼吸道的常在病原微生物
的一种机会致病菌。试验证明, 支气管败血波氏
杆菌是造成副猪嗜血杆菌在上呼吸道定植的诱
因, 其机理与猪萎缩性鼻炎中多杀性巴氏杆菌的
作用相似。已有证据表明,圆环病毒 2型、肺炎支
原体、猪流感病毒、伪狂犬病毒、呼吸道冠状病毒
等都可促进或加重副猪嗜血杆菌的感染引起继发
感染。近些年来, 关于该病的研究报道近年来虽
有不少,但对于副猪嗜血杆菌的毒力因子迄今尚
在探索研究之中, 这为该病的诊断和预防带来了
很大的困难。
1 毒力因子与血清型的关系
细菌的血清型已被普遍作为其毒力的标志, 不
同血清型的 HPS毒力和致病力存在差异。按
K ie leteinRappGabrie lson( KRG ) [ 1]血清分型标准,
用 15个血清型的副猪嗜血杆菌菌株经腹腔途径感
染 SPF猪,证实了其毒力存在差异, 且分离的同一
血清型的野外株与标准株的毒力一致,这表明血清
型和毒力之间可能存在某种关系 [ 2]。利用 SPF猪
腹腔内接种血清型 1、5、10、12、13和 14以后在 4 d
内发病或死亡,这些菌株则被归类为强毒力菌株,气
管内接种不足 100菌落形成单位 ( CFU ) , 就会引起
2010年第 12期 冯小明等:副猪嗜血杆菌毒力因子研究进展
全身病变, 患猪死亡或处于濒死状态;血清型 2、4和
15接种后引起多发性浆膜炎但不致死,这些菌株被
归类为中等毒力菌株;其它血清型 ( 3、6、7、8、和 11)
接种 SPF 猪后不引起临床症状, 被认为没有
毒力 [ 3]。
2 与副猪嗜血杆菌相关的毒力因子
副猪嗜血杆菌属巴氏杆菌科,而巴氏杆菌科成员
具有一些重要的毒力因子如荚膜多糖 ( Capsular poly
saccharide, CPS)、菌毛、脂多糖 ( L ipopo lysaccharides,
LPS)、外膜蛋白 ( Ou termembrane protein, OMP)、转铁
蛋白 ( T ransferrin b ind ing protein, Tbp)等。但是,副猪
嗜血杆菌是否就产生这些毒力因子,以及它们与本菌
的毒力是否有关, HPS感染后侵入全身的机理目前还
不清楚,但研究报道外膜蛋白、菌毛和脂多糖在细菌
感染与定植中的可能作用 [ 4, 5]。
2. 1 外膜蛋白、脂多糖、荚膜多糖、菌毛与毒力的关系
Ru iz等 [ 6 ]研究表明, 外膜蛋白 ( OMP)与副猪嗜
血杆菌的毒力有关, 患病猪与健康猪中分离出的副
猪嗜血杆菌的 OMP不同。M iniats等 [ 7]在 1991年
用免疫印迹技术分析免疫猪的体液反应与抗原、保
护作用之间的关系, 结果发现只有针对外膜蛋白的
抗体与攻毒试验的保护作用有关。用含有脂多糖
( LPS)和 OMP抗原的菌苗免疫动物, 有 OMP抗体
的猪才能抵抗强毒菌的攻击,证明外膜蛋白具有更
强的免疫原性。Morozum i和 N icolet[ 8]报道了分离
自健康猪上呼吸道的大多数副猪嗜血杆菌有荚膜,
而从其它部位分离的菌株多数无荚膜。
脂多糖 ( LPS )可能是一个重要的毒力因子, 血
清脂多糖似乎与血栓形成、血管内凝集物的传播密
切相关,其产生的超氧化物歧化酶有助于抗吞噬。
Amano等 [ 9]进一步研究了脂多糖的致病作用, 用血
清 5型菌株接种动物后发现,血液中脂多糖抗体的
出现与血栓形成和弥漫性血管内凝血有关。现已清
楚,副猪嗜血杆菌的脂多糖具有与其它革兰氏阴性
细菌内毒素相似的活性, 并有类似于菌毛的丝状结
构,这些结构可能有助细菌侵入机体后粘附于细胞
表面。Mnch等 [ 4 ]也证明了,副猪嗜血杆菌在体内
传代后能够生成菌毛样结构。荚膜、菌毛、外膜蛋白
与巴斯德菌科的多个成员与上呼吸道定居有关,其
与毒力之间的关系还有待进一步研究。
2. 2 神经氨酸酶与毒力的关系
神经氨酸苷酶 ( NA )是巴斯德菌科其它细菌的
一种潜在的毒力因子。L ichtensteiger等 [ 10, 11]指出,
神经氨酸苷酶与细菌在宿主细胞内生长活性有关。
他们在 HPS的分泌液中提纯了这种有潜在毒力的
神经氨酸酶,这进一步推动副猪嗜血杆菌致病因子
的研究。该酶存在于细菌对数生长末期,提供细菌
保持活力的非离子态钙。Lichtenste ige和 V im r[ 11 ]的
研究表明, 90%以上的现场分离菌株都产生神经氨
酸苷酶,这种酶与透酶和醛缩酶协同作用,通过夺取
宿主细胞的碳水化合物而增强细菌毒力。除了对营
养方面的影响以外,神经氨酸苷酶还介导清除与宿
主细胞糖原结合的唾液酸, 从而暴露出细菌定居或
侵入宿主细胞所需的受体, 并通过降低黏蛋白的黏
性从而干扰宿主的防御系统。
2. 3 转铁蛋白与毒力的关系
转铁蛋白 ( Tbp)是一种非血红素结合铁的 B球
蛋白,其 N端和 C端的两个同源结构域由一个短铰
链区链接,每个结构域上含有一个 Fe3+结合位点,
分别可逆结合一个 Fe3+ ,它以 TbpFe3+的复合物形
式进入骨髓中, 供成熟红细胞的生成。 Tbp的基本
的功能就是结合、运输、贮存,它调控着铁的代谢,阻
止游离铁通过自由基的形成对细胞的毒副作用。
Tbp还参与了呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节等
过程。因此,它是一类具有较全面生理功能的特殊
蛋白质。Charland( 1995)证明猪血清中存在 Tbp受
体, TbpA和 TbpB能够特异地捕获宿主的转铁蛋
白, 并将铁转运到细胞浆中, 以提供细菌生长所需。
HPS含铁细胞利用 Tbp提供细菌生长必须的铁离
子, 并认为 Tbp在副猪嗜血杆菌感染宿主动物以至
引起发病起到决定性作用。
2. 4 毒力相关的三聚自身转运载体 (V taA )
P ina和 O lvera等 [ 12]报道了 V taA与 HPS的毒
力因子相关。V taA属于表面蛋白家族中的一员, 这
种蛋白有一个特殊的功能领域, 包括 N末端信号
肽, 还有一个 C末端传输领域。 C末端有 25- 300
个氨基酸残基折叠并深入到外膜蛋白中形成一个
孔状的区域,这种结构可以推断出 N 末端的毒力基
因会容易暴露出来,这种暴露的蛋白可能是细菌细
胞表面配基、溶血素类蛋白、蛋白酶、细胞毒素类蛋
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
白,但是对此尚存很多争议。V taA蛋白的结构是在
转运蛋白区域有一个镶嵌结构,它暴露在细胞表面
有运输功能,它由茎、颈圈、头 3部分组成。V taA蛋
白和宿主细胞具有多价黏附亲和力, 它也是细胞外
基质的重要组成部分。V taA重组蛋白还能激发动
物的免疫保护,部分蛋白还有抑制食菌作用和帮助
完善细菌自杀, 克服细菌先天的免疫应答。O lvera
等 [ 13]采用 15个重组 V taA蛋白片段在免疫血清中
用免疫印迹的方法来寻找能和抗体反应的蛋白片
段,以此来研究 V taA蛋白在副猪感染过程中的抗原
性。结果显示,在感染的小猪中产生了 V taA抗原反
应的 IgG, 由此可以推断出 V taA是在细菌体内表
达,并且能促进宿主和动物病原体之间的相互作用,
所以, V taA在疫苗的研发上是理想的免疫原候选
对象。
3 其它 HPS毒力因子的研究
近些年来, 许多学者应用一些新技术来发掘副
猪嗜血杆菌毒力因子。加拿大的 H ill等 [ 14]首次用
DDRTPCR ( differential display RTPCR)鉴定了菌株
1 185(血清 5型 )的 7个在 40∀ 高温热应激条件下
上调表达基因。M eln ikow等 [ 15]在实验室模拟 HPS
自然感染时所处的环境,利用基因芯片鉴定 HPS在
适应宿主时需要表达的毒力基因。总共鉴定出 75
个相关基因, 其中大多数为编码铁离子转运、糖代
谢、酶代谢、DNA代谢的基因,以及几个功能不清楚
的假定蛋白质基因。Metca lf等 [ 16] 利用改进的
DDRTPCR技术在铁离子限制条件和脑脊髓液体内
环境条件下差异表达的基因鉴定出 fba、purA、cpdB、
lspA、lytB、sodC、tyrS和 cysK等多个上调表达基因。
Sach等 [ 17]运用代表性差异分析方法 ( represen
tational d ifference analysis)对 HPS强毒株 5型和无
毒 11型进行比较分析,其中有 5个毒力相关基因只
在血清 5型中发现。其中有一种假定溶血素操纵子
在一半的强毒力株中发现, 但是在无毒菌株中却不
存在 [ 17]。 Jin等 [ 8]用 SCOTS鉴定 HPS感染 7 d后坏
死猪肺中的 HPS特异性上调表达的基因,与培养基
培养条件下相比, 感染猪肺组织中的 HPS有 38个
基因上调表达。陈鑫等 [ 19]用体内诱生抗原鉴定技
术 ( in vivoinduced antigen techno logy, IV IAT)也鉴定
出 6个开放阅读框 ( ORF)。胡军勇 [ 20]在筛选到的
差异表达的功能基因中,通过序列相似性的比较,鉴
定了副猪嗜血杆菌的 40个高温应激基因。 X ie
等 [ 21]用 SCOTS技术筛选到了 HPS在体外铁限制环
境下上调表达的 36个基因。 Pina和 O lvera等 [ 12 ]报
道了 V taA与 HPS的毒力因子相关。 Zhou等 [ 22]利
用消减杂交技术鉴定出 15个开放阅读框在血清 5
型中存在而在 3型弱毒株中不存在。本实验室利用
体内诱导抗原技术鉴定出 12个 ORF, 经 RTPCR验
证出 2个体内表达基因: 5甲基四氢蝶酰三谷氨酸
盐高半胱氨酸S甲基转移酶和毒力相关三聚自身
转运载体。
目前所有这些用不同方法鉴定到的基因与 HPS
致病性之间的关系尚在研究中,没有 HPS毒力因子
方面更多明确的鉴定及其作用机制的资料, 对于
HPS毒力基因的挖掘还需要进一步的探索研究。
参 考 文 献
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