全 文 ：健物杖术通报
· 研究报告 · 了’ 口 ’ 年增刊
不同生长 日龄罗汉果中糖基转普蛋白凝胶电泳分析
刘金磊 卢凤来 周玉恒 李典鹏
‘军臀篡曾鬓广西植物研究所 , 桂, ,
摘 要 采用十二烷基硫酸钠 一聚丙烯酸胺凝胶电泳法对不 同 日龄罗汉果内的主要糖基转普蛋白进行分析 ,
寻找罗汉果生长过程 中皂普形成的关键蛋 白 , 为生物转化法生产罗汉果甜普提供科学依据 。 得到一较清晰的罗汉
果糖基转普蛋白电泳图谱 。 据电泳图谱分析 , 初步得出罗汉果糖基转普蛋白的内在变化规律 。 结果表明 罗汉果
中存在多种糖基转等蛋白 , 不 同生长 日龄罗汉果的糖基转普蛋白也不一致 , 在几个关健时期糖基转普蛋白变化特
别明显 。
关键词 罗汉果 糖基转菩蛋白 聚丙烯酞胺凝胶电泳
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罗汉果 [sira itia gro s、norii ( sw ingle ) C J 毋卜e了」
是我国特有的经济药用植物 , 为广西桂北地区的传
统特产 。 罗汉果有清热润肺 、凉血 、 润肠通便的功
效 , 特别是用作祛痰剂 , 在治疗百 日咳 、慢性气管炎 、
感冒、便秘 、胃肠小疾等方面疗效显著(中华人民共
和国卫生部药典委员会编 , 1 9 7 ; 1 9 8 5; 1 9 90 ) 。 它的
营养价值高 , 含有丰富的果糖 , 蛋 白质和多种维生
素 , 特别是罗汉果中含有低热量的甜味成分 , 作为理
想的天然甜味剂广泛应用 于 医药 , 饮料和 食品
中〔’,2 , 川 。 目前 , 由罗汉果提取制成的天然甜味剂-
罗汉果甜昔已投人工业化生产 。
采用薄层层析方法检测罗汉果的子房及授粉后
不同座果 日龄果实发现 , 子房中并无皂昔成分 , 而授
粉后某一时刻的幼果 , 可 以在精确到以小时计的短
时内就有皂昔成分出现 ,但主要是呈苦味的二糖昔 。
随着座果日龄增加 , 二糖昔逐渐减少 , 而三糖昔 、四
糖昔 、五糖昔则顺次成为不同 日龄果实的主成分 。
充分成熟的果实以五糖昔为主 , 伴有少量的六糖
昔[s] 。 这种现象提示 :罗汉果皂昔的合成过程 , 很
可能是以植株中已经存在的具有昔元结构的物质为
前体 ,在果实中通过某些蛋白的催化作用与葡萄糖
连接 ,并随着葡萄糖残基的逐步转移 , 依次形成三糖
昔 , 四糖昔 , 五糖昔与六糖昔的过程 。
旨在通过对不同生长日龄的罗汉果糖基转昔蛋
白进行分析 , 寻找出其关键的罗汉果糖基转昔蛋白 ,
为罗汉果甜昔的进一步的生物转化研究提供科学依
基金项目:中国科学院“ 西部之光” 人才培养计划人选项 目(科发人教字「20 2」101 号 ) ;桂林市科技攻关项 目(20 70304 一 )
作者简介:刘金磊( 19 80 一 ) , 男 , 内蒙赤峰人 , 助理研究员 ,从事植物资源的开发利用研究
通讯作者:李典鹏 , E 一m ail : l d p @ 脚b.。 n
健物杖术通报 B to te ch n口勿舒 2008 年增刊
据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 丙烯酞胺凝胶储备液:取 309丙烯酞
胺(A rc )和 0.89 双丙烯酞胺(Bi s)溶于双蒸水中 , 并
定容至 1O0 m l( 过滤 , 4 ℃ 下储存备用 , 可保存 1 一 2
个月)10% 过硫酸按 ;10 % SD S;1.sm oF 口五S · H e l
( p H S
.
8) 分离胶缓冲液 (4℃存用 ) ;0.sm oF LT ris ·
H C I (
p H 6
.
8 ) 浓缩胶缓冲液(4℃存用 ) 。
样品溶解液:分别取双蒸水 4nil , 0 . s m 0 F LT ris
·
H C I ( p H 6
.
8 ) 浓缩胶缓冲液 l.om l, 甘油 0 .80m l,
1 0 % S D S 溶液 1.6m l, 琉基乙醇 0.4m l, 0 . 1 % ( 质量
浓度)嗅酚蓝 0.Zml , 总体积为 snil , ( 4 ℃存用) 。
电极缓冲液 :称取 3gTris , 14 . 4 9 甘氨酸 , l g s D s ,
用水溶解后 , 定容至 1 oo ml , p H S . 3 不必调节 。
染色液:称取 19 考马斯亮蓝 G2 50 , 溶于 250 ml
甲醇及 lo ml 冰醋酸中 , 溶解后定容至 1 ooo m l; 脱
色液:250 nil 甲醇 (或乙醇)和 lo ml 冰醋酸混合后 ,
定容至 1 o o m l。
1
.
1
.
2 样品采集 采 自桂林临桂县宛田乡罗汉
果 , 生长日龄分别为 ld 、 s d 、 l o d 、 一sd 、 Z o d 、3 o d 、 4 o d 、
S O d
、
6 0 d
、
7 0 d
、
8 0 d
、
8 5 d 果实 , 采后立即制备样品液
置冰箱冷藏。
1
.
1
.
3 用品与仪器 电泳仪(60 V , 恒流 , 恒压 ) ,
D Y C Z
一
2 8 A 型垂直板电泳槽 , 1 2 5 m m * 1 0 0 m m 制胶
玻璃板 , 16 孔样品梳子 , 胶管 , 微量注射器 , 自动取
液器 (20 一 1 0 闪) , 注射器 , 针头 , 培养皿 , 大小烧杯
等。
1
.
2 方法
1.2 .1 样品液的制备与纯化 取生果一个 (每个
样一个)约 809 , 打碎 , 加人磷酸氢二钾一磷酸二氢钾
缓冲液 100m l, 冲洗 3 次 , 过滤 , 取液 , 3 O 0 0 r/ m i n 离
心 sm in 。 取上清液即为罗汉果蛋白粗液 。 再用 5
0 0 目透析袋把蛋白粗液透析处理 , 再次 3 oo r/
m in 离心 sm in , 冷冻浓缩 , 即得到样品液 。
1
.
2
.
2 按表配制凝胶液
表 1 分离胶配方
凝胶浓度 7.5% T
10% SDS溶液
10 % 过硫酸钱
30 % 丙烯酞胺凝胶溶液
TEM ED
2(X) 林l
l(X) 卜l
分离胶缓冲液(pH S .8 、室温抽气
双蒸水
总体积
T 为 Arc 和 Bi s 总浓度
10 一 1 5 m in ) ) 5 . o m l
9
.
6 8 m l
表2 中层胶及浓缩胶配方
凝胶浓度 中层胶(6 .0 % T )
浓缩胶
(4 , 0 % T )
双蒸水
浓缩胶缓冲液(pHS.8)
10% SDS 溶液
30 % 丙烯酸胺凝胶溶液
(室温脱抽气 10 一 1 5 m in )
ro % 过硫酸钱
TE M E D
总体积
2.87 m l 3 .OInl
1.25 m l 1 25 m l
50卜1 5 0 林l
0 . s m l 0 .6 7 ml
2 5卜1 25 协l
5协1 25 卜l
5 衬 snil
1 .2 . 3 电泳 采用稳压 , 先将电压调 至 160 -
170 V , 待样品从浓缩胶进人中层胶时 , 将电压调至
ro o 一 1 10 V 并将电压保持至 电泳结束 。 结果如图
2 结果与讨论
电泳谱带根据染色深浅分为 4 级[“〕:色深者为
1级带 , 色浅者为2 , 3 级带 ,谱带扩散者为扩散带。
据图谱观察:将图谱分为 A , B 两个区域以便叙
述 。 ld 果在 A 区有 1条 2 级带 ,在 B 区有一较大的
扩散带 ;sd 果 、 10 d 果 、巧d 果在 A 区均有 1 条 3 级
带 , 在 B 区有 7 条 3 级带 ;20d 果 、 3 0 d 果 、 4 0 d 果在
A 区和 B 区各有 l 条 2 级带 :50d 果 、 6 0 d 果 、 7 0 d
果 、 80 d 果 、 8 5 d 果在 A 区和 B 区均各有 1 条 1 级
带 。
在 ld 果里出现的 A 区的 1跳级带 , 在以后的
年增刊 刘金磊等:不同生长日龄罗汉果中糖基转昔蛋白凝胶电泳分析 2 15
图 1 不同日龄罗汉果酶液的电泳图谱
从左至右为:1.罗汉果 1d 果 ;2 .罗汉果 sd 果 ;3.罗汉果
10 d 果 :4. 罗汉果 15 d 果;5 . 罗汉果 20 d 果 ;6. 罗汉果 30 d
果 :7 . 罗汉果 40d 果 ; 8 . 罗汉果 50 d 果 ;9 . 罗汉果 60d 果;10 .
罗汉果70d 果 ;11. 罗汉果 80 d 果 : 12. 罗汉果 85 d 果 ;13 .四
种标准蛋白(见附图)
罗汉果实都没再出现过 , 说明其只是短暂时间的存
在 , 可能为罗汉果糖基转昔蛋白的起始转化源 ;而在
sd 一 巧d 果里所出现的全部 8 条带中有6 条带是阶
段性地存在 , 其可能在这个转化过程中扮演一个转
化介质的角色;从 sd 果开始到85d 成熟果里各在同
一个位置有2条带一直存在 , 且呈现随日龄增长越
来越粗的趋势 ,估计为罗汉果内最主要的两种糖基
转昔蛋白 , 含量随生长日期越来越多 , 到85d 达到顶
峰 。 据计算 , 在 A 区一直存在的区带的分子量约为
46 0 0 左右 ;而在 B 区一直存在的区带分子量约为
6 0 0 左右 。
上述为据电泳结果进行分析所得的一些规律 ,
与罗汉果中皂昔的形成与积累规律有一定的关联 ,
生长 日龄sd 的罗汉果有昔类物质出现 , 但这一时期
主要为苦味的二糖昔 , 4 0 d 后有罗汉果甜昔出现 , 至
85 d 甜昔含量达最高。 在这几个关键时期罗汉果糖
基转昔蛋白都有一定差异和突变 , 这为我们找出罗
汉果关键的糖基转昔蛋白 , 进一步研究生物转化法
生产罗汉果甜昔提供科学依据和直接证据 。
牛血清蛋白
(660(刃)
碳酸醉酶(29(洲卫〕)
细胞色素(12400)
Aprolinin(650() )
图 2 电泳图谱分析附图
从左至右为:1.第 ld果 ;2 .第sd果;3 .第 10d果 ;4 .第 15d
果 ;5 .第20d 果 ;6 .第 30d果 ;7 .第 40d 果 ;8.第 50d果 ;9 .第
60d 果 ;10.第70d果;11.第80d果 ;12 .第85d果 ;13 .四种标准
蛋白
参 考 文 献
金春花 , 姜秀莲 , 柯美珍 , 等 , 中药材 , 1 9 9 7 , 2 0 ( 1 1 ) : 5 7 4 一 5 7 7 .
苏瑞君 , 王晓岩 , 王秋芝 .吉林中医药 , 1 9 97 , 1 7 ( 6 ) : 38 一 39 .
中华人民共和国卫生部药典委员会 , 1 9 0 , 中华人民共和国药典
「M 〕.北京:化学工业出版社 , 1 70 一 1 71 .
李锋 , 李典鹏 , 蒋水元等 ,罗汉果栽培与开发利用.北京 :中国林业
出版社 , 2 (X) 3 . 1 2 3 一 1 2 8 ; 1 6 3 一 1 6 7 .
李典鹏 , 陈月圆 , 潘争红 ,等.广西植物 , 2 (X) 4 ( 6 ) : 5 46 一 5 49 .
汪底耀 , 细胞生物学实验指导 , 北京:高等教育出版社 , 19 81 : 3 82
~
3 8 5
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