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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
转查尔酮合酶基因对烟草花色及花器官的影响
夏玉凤 1 耿晓娜 1 王万双2 赵宝华 1
( 1河北师范大学生命科学学院,石家庄 050016; 2河北省种子管理总站,石家庄 050031)
  摘  要:  花色是重要的园艺性状, 一直是育种工作者苦苦追求的目标。利用植物基因工程技术可定向改良花色。根据
已知的 CH S序列 (序列号 M 20308
), 用 PCR方法从拟南芥中克隆 CH S基因, 并分别将其以正向、反向插入到真核表达载体
pB I121, 在农杆菌介导下用叶盘转化法转化烟草。对转基因烟草进行检测, 结果表明, 转基因烟草的花色变淡、花青素含量降
低; 叶片颜色变浅、叶绿素含量降低。转基因烟草花的形态也发生了明显变异。
关键词:  花青素 花色 基因工程 查尔酮合酶基因
The Influence of CHS Gene Expression on Flower Colour and
FlowerM orphology of Transgenic Tobaccos
X ia Yufeng
1
Geng X iaona
1
W angW anshuang
2
Zhao Baohua
1
(
1
College of L ife Science,H ebeiN ormal University, Shijiazhuang 050016;
2
Seed Adm inistrative Station of H ebei Province, Shij iazhuang 050031)
  Abstrac:t  F low er co lourm a inly dete rm ined by anthocyan ins is an im po rtant trait. The flo ra l co lo r could bem odified by using eng i
neering techno logy such as antisence, cosupression, RNA i and m ultipa l gene regu la tion. According to the subm itted chs sequence, w e
cloned CH S gene from A rab idop sis thaliana by PCR m ethod. The CH S gene w as cloned into pBI121, and tw o expression vectors inclu
d ing pB I chs S ( 35S prom oter: sence CH S gene) and pBI chsAN ( 35S promo ter: antisence CHS gene) w ere obta ined. P lan t express ion
vec to rs we re transfo rm ed into tobaccom ediated byAgrobacterium LBA4404
Resu lts ind icated that bo th leaves colour and flow er co lour
o f transgen ic tobaccow as weake r than w ild tobacco and Ch lorophyll leve l and anthocyan in leve lw as lowe r than tha t o f thew ild. It proved
tha t not on ly flow er co lours o f the transgen ic p lant we re a ltered, but the flow er mopho logy w ere m od ified too.
Key words:  Anthocyanin F lo ra l colour G ene eng ineering Cha lcone syn thase gene
收稿日期: 20090715
基金项目:河北省教育厅项目 ( Z2006438 ), 河北省科技厅项目 ( 07215520 ) ,河北师范大学博士基金 ( L2005B19 ), 河北师范大学青年基金
( L2006Q13)
作者简介:夏玉凤,女,博士,讲师,研究方向:植物基因工程; Em ai:l tw eiy@i sohu. com
通讯作者:赵宝华, Em ai:l zh aobaohua86178@ sohu. com
  花卉在人们的日常生活中扮演着重要角色,花
色是重要的园艺学特征, 是衡量观赏植物价值的重
要性状。花色在生化和遗传上都极为复杂。自然界
花卉颜色种类繁多, 但是一些重要花卉的色系却有
限,因此花色改良一直是育种工作者追逐的重要目
标。植物基因工程技术可以定向修饰观赏植物的特
定性状而不丧失其原有的其它性状, 因此它在花色
育种方面的研究和应用发展迅速, 可以提供崭新的
思路和途径 [ 1- 3]。
利用植物基因工程技术来影响花色素形成有关
的结构基因或调节基因的表达, 有可能改变植物花
色形成途径,从而改变花色。比如使用分子生物学
技术 (包括反义抑制、共抑制、RNA i等手段 )来下调
基因表达,或同时导入与某种花色有关的多种基因
从而改变花色素代谢途径。N akatsuka等 [ 4]用 RNA i
方式抑制烟草内源 F3 H 单个基因表达, 使得矢车
菊苷在花瓣中的积累减少,最终导致花色明显变淡,
但是色调没有改变。他们构建了新的载体来转化烟
草, 抑制内源 FLS( flavonol syn thase)和 F3 H,并且同
时过表达 GhDFR基因, 烟草类黄酮合成途径被改
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 1期
变,使代谢转向生成花葵素, 培植出开红色花的烟
草。Florigene公司与日本 Sandory公司合作,利用基
因工程手段将多个基因导入玫瑰, 花瓣积累大量花
翠素, 呈现蓝色, 成功地培植出蓝色玫瑰 [ 5 ]。
花青素属于类黄酮类色素, 可以使植物呈现由
粉红到蓝的颜色,范围较广, 颜色较鲜艳, 是人们研
究的主要对象。其代谢调控基因表达的结果使植物
细胞内花色素积累,在外观上表现出色彩的变化 [ 6]。
CHS基因编码的查尔酮合酶是花青素合成途径中
第一个关键酶,其催化生成的查尔酮是花青素代谢
途径的各种色素的前体 [ 7 ]。本研究克隆了 CHS基
因,并将其构建成正义表达载体和反义表达载体,转
化烟草, 下调 CHS基因表达,以期获得改变花色和
形状的转基因植株。
1 材料与方法
1
1 菌种、质粒及生物材料
宿主菌大肠杆菌 ( E scherichia coli) DH5
, 根癌
农杆菌 ( Agrobacterium tumefaciens ) LBA 4404、烟草
(N icotiana tabaccum L. )、质粒载体 pBI121均由中
国农业大学农业生物技术国家重点实验室植物基因
工程室提供。
1
2 工具酶、试剂
RN ase A、各种限制性内切酶、Taq DNA Po ly
merase。 pMD18T载体等购自 TaK aRa生物工程公
司;植物激素 6BA、NAA、氨苄青霉素 ( Amp)、卡那
霉素 ( Kan)、链霉素 ( Sm )、羧苄青霉素 ( Cb)、胶回收
试剂盒等购自华美公司。
1
3 拟南芥 CHS基因的克隆
取拟南芥叶片提取基因组, - 20! 保存备用。
根据网上所登录的 CHS基因序列设计引物, 用 PCR
的方法扩增 CHS基因。所扩增的片段大小为 1 432
bp,扩增的区段包括分布在两端的两个外显子和中
间的内含子。回收扩增的片段并与 T载体连接,进
行测序验证。所用引物如下: 上游: M 1 Ccg tc catct
aacct accac actc,下游: M 2 Ctg tt tagag aggaa cgctg tgc。
1
4 表达载体的构建
1
4
1 拟南芥 CHS基因正义表达载体的构建  用
chs正义基因替换 pB I121载体的 GUS基因来构建
正义表达载体。具体策略如下:将连接有目的基因
的 T载体用 sph I酶切回收, 然后用 T4聚合酶削平并
回收,再用 BamH I酶切并回收小片段备用; Sac I酶切
pBI121回收后用 T4聚合酶削平并回收, 然后用
BamH I酶切,回收大片段;将上述两个片段连接得到
pBI121sense CHS表达载体。载体结构如图 1。
图 1 拟南芥 chs正以表达载体的构建
拟南芥 CHS反义表达载体的构建用 CHS反义
基因替换 pB I121载体的 GUS基因来构建反义表达
载体。具体策略如下: 将连接有目的基因的 T载体
用 sph I酶切回收, 然后用 T4聚合酶削平并回收, 再
用 BamH I酶切后回收小片段备用;用 Sac I、Sma I
双酶切 pB I121, 回收大片段;将上述两个片段连接,
得到 pBI121antiCHS表达载体, 载体结构图如图 2。
图 2 拟南芥反义表达载体
1
5 农杆菌感受态制备、表达载体转入农杆菌及烟
草转化
参考王关林等 [ 8]的方法进行。
1
6 花青素含量的测定 [ 9]
取花蕾,在 1% HC l的甲醇溶液 (w /v )中黑暗
震荡浸泡 48 h。535 nm测吸光度。
1
7 叶绿素含量测定 [ 10]
取植物叶片,洗净去中脉,称取样品 0
1 g,放入
研钵中,液氮充分研磨, 转入 5mL的 95%乙醇提取
液中,摇匀,静置 3- 5 m in直到样品变白。室温条
件下, 8 000 r/m in,离心 5m in,取上清至 25mL容量
瓶中,定容。把叶绿素提取液倒入光径 1 cm的玻璃
比色杯中,以 95%乙醇为空白对照, 在波长 633 nm
和 645 nm下测定光吸收值。
总叶绿素含量 (mg /g) = ( 8
02 ∀OD633 + 20
20 ∀
OD645 ) ∀稀释倍数 /样品鲜重
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2010年第 1期 夏玉凤等:转查尔酮合酶基因对烟草花色及花器官的影响
2 结果
2
1 表达载体鉴定
对构建的正义及反义表达载体进行鉴定, 以
M 1、M2为引物对两个表达载体进行 PCR检测, 均
扩增到 1
4 kb的片段,用多种不同的酶对载体进行
单酶切、双酶切, 分别得到了预期大小的片段, 证明
载体构建正确 (图 3,图 4)。
2
2 转基因植株分子检测
采用冻融直接转化法,将构建好的植物表达载
体分别转入根癌农杆菌 LBA 4404。以根癌农杆菌
LBA4404介导, 采用叶盘法转化烟草, 经组织培养
获得转基因烟草。提取烟草叶片基因组 DNA, 用引
物 M1, M 2进行 PCR, 扩增 CHS基因。取 10 L
PCR产物, 用 0
8% 琼脂糖进行电泳, 部分植株的
PCR结果如图 5。由图 5可知,部分植株已扩增出
1
4 kb左右的目的基因,与质粒所扩增的正对照位
置一致,而野生型烟草没有扩出相应条带。证明转
基因烟草为阳性植株。
1. M arker; 2. CK; 3. CK+ ; 4 - 8
转正义 CH S植株的 PCR产物;
9 - 14
转反义 CH S植株的 PCR产物
图 5 部分转基因植株的分子检测
2
3 转基因烟草叶绿素测定
转基因烟草幼苗时期, 叶片颜色较野生型烟
草的浅, 呈现黄绿色 , 叶片的厚度也较野生型的
薄 (图 6 )。
A.野生型烟草的叶子; B.转正义 CHS烟草的叶子;
C.转反义 CHS烟草的叶子
图 6 转基因烟草植株与野生型烟草叶片颜色比较
野生型烟草和转基因烟草叶片颜色有明显差
异, 这种差异是否与叶绿素的量有关, 为此, 检测了
叶片叶绿素含量,其测定结果如图 7。
由图 7可以看出野生型烟草叶片叶绿素含量平
均为 1
34 mg /g, 而转正义基因烟草和转反义基因
烟草叶片叶绿素含量平均为 0
374mg /g、0
566mg /
g。转基因植株较野生型烟草叶绿素含量明显降低,
导致叶片发黄。
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 1期
图 7 转基因烟草与野生型烟草叶绿素含量的比较
2
4 转基因烟草与野生型烟草的花色及形态比较
2
4
1 烟草花色的比较及花青素含量测定 在
生殖生长期,烟草的花陆续开放。发现野生型烟
草花冠颜色红艳 (图 8A, 图 8B ) , 而转正义基因
烟草花 (图 8C, 图 8D )和转反义基因烟草花 (图
8E, 图 8F) , 其花色都比野生型不同程度地变淡
了, 有些转正义基因烟草花色几乎接近白色 (图
8D )。
为了解花色差异是在花发育的哪个阶段开始出
现的, 摘取野生型烟草和转基因烟草不同发育时期
的花蕾进行观察 (发育时期 1- 5分别为花芽成长 3、
A、B. 野生烟草花; C、D转正义基因 CHS烟草花;
E、F. 转反义基因 CH S烟草花
图 8 转基因烟草花色与野生型烟草花色的比较
4、5、6、7 d的形态 )。发现在生长初期 ( 1- 3期 ),
即花未开放时,转基因烟草和野生型烟草在外观上
没有明显区别;花蕾生长第 4期,花冠稍微张开, 野
生型烟草花冠颜色红色,而转基因烟草花冠颜色很
浅;第 5期, 花完全开放后, 野生型烟草和转基因
烟草花色差异非常明显。野生型烟草花冠颜色红
艳,无论是转正义基因还是转反义基因植株,其花
的颜色都比野生型烟草花的颜色不同程度的变淡
了 (图 9)。
A.野生型烟草; B.转正义基因 CH S烟草花; C.转反义基因 CHS烟草花
图 9 野生型烟草和转基因烟草花蕾不同发育时期花色的比较
  分别取各个生长时期的花蕾, 提取花青素, 在
535 nm比色, 测定结果见图 10。在花发育的 1期,
野生型烟草与转基因烟草花色素含量都非常低,并
且没有什么差异, 花蕾外观上也没有颜色差异。花
发育的第 2、3期, 花青素含量依然很低, 但差异明
显,转基因烟草明显低于野生型, 认为有可能在第
2、3期, 转基因烟草花的 CHS基因表达受到干扰,导
致花青素的量比野生型低。然而此时期的花蕾在外
观上却没有肉眼可见的明显差别, 可能是因为花青
素含量太低,还有花冠包裹在花的内部,肉眼观察不
到这种差别;在第 4、5期, 花青素含量都升高了, 转
基因烟草花青素的含量较野生型烟草的低, 转正义
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2010年第 1期 夏玉凤等:转查尔酮合酶基因对烟草花色及花器官的影响
基因的烟草花青素含量最低,转基因烟草花冠颜色
浅粉色,远不如野生型红艳, 差异明显 (图 10)。烟
草内源 CHS是花瓣特异性表达基因,花色主要呈现
在花冠上。随着花冠比例的增大, CH S基因表达导
致花青素量上升,野生型烟草花色红艳,而转基因烟
草 CHS基因表达受到共抑制或反义抑制, 导致花青
素量上升幅度明显低于野生型。花色观察和花青素
测定结果表明花青素含量与花色深浅呈正相关。
图 10 转基因烟草与野生型烟草花不同
发育阶段花青素量的比较
2
4
2 转基因烟草与野生型烟草花的形态比较 
转基因不仅改变了花色, 而且还影响了花的形态。
试验发现野生型烟草雄蕊的花药与雌蕊柱头的高度
是一致的 (图 11A,图 11C),转正义基因烟草却表现
出雄蕊花药的位置高出雌蕊柱头 (图 11B,图 11D )。
野生型的花蕊与花瓣的位置高低基本平齐 (图 11F),
而一些转反义基因烟草的花蕊比花瓣却高出许多
(图 11E )。
3 讨论
将来自拟南芥的查尔酮合酶基因分别以正义、
反义两种方式转入烟草, 转基因植物的花色呈现出
多样性。有的花瓣边缘颜色较深而其它部分则很
浅,有的花瓣颜色粉红而各花瓣结合处为白色。正
义、反义两种方式的转基因效果也有所差别,转正义
基因较转反义基因效果更明显,转正义基因烟草花
色普遍更浅,有些花几乎为白色。李毅等 [ 11]将查尔
酮合酶基因转入矮牵牛, 有的植物在花瓣的中部形
成圆形的色斑,有的植物则形成紫白相间的条纹,还
有的植物则在花脉上具有较高的色素积累水平。赵
万苓等 [ 12]将来源于矮牵牛的查尔酮合酶基因 CHSA,
转化大岩桐,有一株玫红品系植株的花瓣上出现了白
色的不规则斑点, 然而将 CHSA基因转化仙客来,却
使得 8株白花植株的花瓣出现了黄斑或略显黄色,个
别花瓣变成了黄色花瓣; 3株白花植株的个别花瓣出
现了桃红色条带,甚至整个花朵完全变成了桃红色。
也许不同植物,花色合成途径及调控途径有差异,所
以尽管都是通过调控 CHS基因的表达来干扰花色,
得到的花色变异情况却并不完全相同。
A, C, F.野生型烟草花; B, D. 转正义 CHS基因烟草花;
E . 转反义 CH S基因烟草花
图 11 转基因烟草与野生型烟草花形态比较
试验中除了转基因烟草的花色明显变浅外, 花
的形状也有所变化。有些转基因花的花瓣分裂较野
生型程度大,转正义基因植株的雄蕊比雌蕊长,花药
高出柱头。测量了雌蕊的长度, 发现野生型烟草雌
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 1期
蕊与转正义基因烟草雌蕊长度上几乎没有差异。每
朵花有 5个雄蕊, 将其按长短排序,分别取野生型烟
草与转正义基因烟草相应排序的雄蕊进行比对,发
现转正义基因烟草的 5个雄蕊都比野生型烟草的雄
蕊长。由此可以看出雄蕊变长,使得转正义基因烟
草的柱头与花药之间的高度出现差异。
花色在生化和遗传上都极为复杂,植物基因工
程改良植物花色是研究基因表达、调控和互作的热
点课题。本试验成功地改变了烟草花色, 这为其它
花卉品种的改造打下了基础。目前, 还不能随心所
欲地改变植物花色,需要继续摸索规律, 深入探究,
逐步揭示花色调控机理,创造出更多新奇花色。
参 考 文 献
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