全 文 ：收稿日期:2007-09-25
基金项目:山东省农业科学院高技术自主创新基金(2006YCX030);山东省农业科学院青年基金
作者简介:赵传志(1981-),男,山东东营人,硕士,研究方向:植物分子生物学研究
通讯作者:王兴军,教授
生物技术的发展为利用转基因植物作为生产
药用蛋白的反应器提供了技术支撑,目前已培育出
可生产药物和疫苗的多种转基因植物,利用植物反
应器生产药用蛋白和疫苗已成为制药产业重点开
发的热点领域之一[1,2]。植物生物反应器有着动物
和微生物生物反应器不可替代的优点:转基因植物
自交后得到的纯合体可以保证新性状的稳定遗传,
目的基因可以通过农杆菌或基因枪等多种途径转
移并整合到植物基因组中,而且表达产物在植物细
胞中能够进行翻译后加工和蛋白糖基化,使三维空
间结构更趋于自然状态,重组蛋白与天然蛋白之间
具有接近一致的免疫原性和生物活性;植物表达体
系生产药用物质成本低,来源广,易于大规模生产,
与动物、微生物反系统相比植物中不含危害人类健
康的病原生物[3~5]。但是由于外源重组蛋白质占植
物总生物量的比值通常都很低,使得分离纯化的成
本增加,因此如何提高植物中外源蛋白表达量,降
低下游生产成本,简化纯化过程是植物反应器研究
中急需解决的问题。近年来,利用植物种子表达外
源蛋白备受关注,主要是因为植物种子的蛋白含量
高,在种子成熟过程中,大约有 95%的水分会主动
失去[6],细胞中的水解酶活性大大降低,重组蛋白
以油体作为生物反应器的研究进展
赵传志 1 卢金东 2 苏磊 1 毕玉平 1 王兴军 1
(1山东省农业科学院高新技术研究中心,山东省作物与畜禽品种改良生物重点实验室,济南 250100;
2山东省农业科学院蔬菜研究所,济南 250100)
摘 要: 获得安全、经济、稳定具有生物活性的重组蛋白,应用于基础研究及临床应用是一个重大的战略课题,现
在可以利用酵母、细菌和动物细胞生产多种药物蛋白,但这些蛋白的生产过程还存在许多问题。利用植物作为生物反应
器生产药用蛋白和疫苗是目前生物反应器研究的热点。油体蛋白在油料作物种子中高水平表达且易于分离,经过改造后
是生产目的蛋白的一种理想载体。介绍了油体、油体蛋白的结构以及利用植物油体蛋白表达体系这一新型植物生物反应
器生产目的蛋白的研究进展和前景。
关键词: 油体 油体蛋白 生物反应器 重组蛋白
ProgressofOilbodyasaBioreactor
ZhaoChuanzhi1 LuJindong2 SuLei1 BiYuping1 WangXingjun1
(1High-TechResearchCenter,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryforGeneticImpovementof
CropAnimalandPoultryofShandongProvinve,Ji’nan250100;
2VegetableResearchInsistuce,ShandongShandongAcademyofAgriculturalSciences,Ji’nan250100)
Abstract: Securingasafe,economicalandstablerecombinantproteinwithbiologicalactivityforuseinbasic
studyandclinicaltrialsisanimportantisue.Today,bacteria,yeastandmammaliancelculturesareroutinelyusedfor
large-scalecommercialproductionofbiopharmaceuticalmoleoules,butthesesystemsarecostlyandalhavetheirown
disadvantage.Usingplantsystemasabioreactortoproduceproteinandvaccinehasbecomeahottopic.Oleosin,highly
expresedinsomecropseedsandeasytobeisolated,isanidealcarierproteinaftermodification.Thisarticlepresents
thestructureofoilbodyandoleosin,reviewstheresearchprogresbyusingoilbody-oleosinplantbioreactorsystem to
produceproteinswithmedicalvalue.
Keywords: Oilbody Oleosin Bioreactor Recombinantprotein
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
可以在种子内长期、稳定地贮存而不会被降解。种
子内的油体蛋白(oleosin)具有亲水和亲脂双重特
性,在植物种子中以膜嵌入方式覆盖在油体表面。
油体蛋白在油料作物种子中高水平表达且易于分
离,经过改造后是生产外源蛋白的一个理想的载
体。简单介绍了油体的结构以及油体蛋白作为生物
反应器相关的一些研究进展。
1 油体(oilbody)和油体蛋白(oleosin)
油体是植物种子的贮油细胞器,通常在子叶、
胚乳或盾片中积累,为种子的萌发和植株的早期生
长提供能量。油体为直径 0.5~2.5μm的球体,其大
小因植物种类的不同而不同,且受营养和环境的影
响。即使同一粒种子,不同组织中的油体大小也不
相同[7]。最近研究表明,在拟南芥中油体蛋白的积
累决定了油体的大小[8]。无论在细胞中还是在离体
状态下,油体均非常稳定,在干燥种子细胞内或在
体外离心分离的上浮液中,油体之间并不发生融合
或聚合,甚至经过长时间的贮存也能保持稳定[9]。
油体蛋白是一类特殊的储藏蛋白,并镶嵌在油体
表面,在油料植物种子中特异性表达。
1.1 油体的成分
油体的主要成分可为中性脂类、磷脂和油体蛋
白。中性脂类约占油体的 92%~98%,主要是三酰甘
油(TAG),另外还有少量的二酰甘油(DAG)和自由
脂肪酸;磷脂(PL)约占油体总成分的 1%~4%,主
要为磷脂酰胆碱,少量的为磷脂酰丝氨酸、磷脂酰
乙醇胺和磷脂酰肌醇;油体蛋白占油体总成分的
1%~4%,其中 90%为油体蛋白(oleosin),少量的为钙
结合油体蛋白(caleosin)及细胞色素c还原酶等[7]。
1.2 油体的基本结构
Tzen和 Huang(1992)提出的油体结构模型认
为油体是由半单位膜 (half-unitmembrane)包裹液
态三酰甘油而形成的球体(图 1)[11]。油体内部为液
态三酰甘油,外部是由单层磷脂分子及油体蛋白组
成的半单位膜,这个半单位膜的基本单位是由 13
个磷脂分子和 1个油体蛋白分子组成[7]。磷脂占油
体表面的 80%,其余 20%是油体蛋白。磷脂分子的
疏水酰基朝向三酰甘油基质,亲水的头部基团朝向
细胞液。油体蛋白的 3/5部分覆盖在油体表面,阻
止外部的磷脂酶作用于磷脂半单位膜,其余 2/5的
油体蛋白形成一个约 11nm的柄状结构的疏水区
域,伸入磷脂的疏水酰基部分及油体内部的三酰甘
油中,油体蛋白的疏水部分是 68~74个氨基酸组成
的发夹结构,发夹结构的顶端是 3个脯氨酸和一个
丝氨酸构成的“脯氨酸结”。等电聚焦结果显示,油
体的等电点为 5.7~6.6,即在 pH值为中性时,油体
表面带负电荷[7]。油体表面带的电荷和油体蛋白的
存在使得油体彼此之间不会相互聚合,即使植物种
子经长期贮存后,油体结构仍保持稳定[12]。最近的
研究结果显示,油体表面除主要镶嵌有油体蛋白
外,还镶嵌少量其它蛋白,如钙素结合蛋白。油体作
为植物中最小的细胞器,其结构可能较上述模型更
加复杂[9,10]。
1.3 油体蛋白
油体蛋白(oleosin)一般覆盖于油体表面,属于
碱性、嵌入的小分子量蛋白,分子量为 15~26kDa,
主要在种子中特异表达[13]。油体蛋白最早是从芥菜
中发现的,目前许多种植物(如芝麻、油菜、向日葵、
胡萝卜、玉米、大豆、拟南芥和棉花)的油体基因序
列和氨基酸序列均已报道[10,14,21]。油体蛋白具有 3
个基本的结构域:N端、C端和中心疏水区。N端镶
嵌于油体朝向细胞液的一面,由 40~60个氨基酸组
成,具有亲水亲脂性特性;中心疏水区由 68~74个
氨基酸组成,伸入到油体内部,面向三酰甘油,其顶
部有三个脯氨酸和一个丝氨酸组成脯氨酸结。这一
区域尤其是“脯氨酸结”在不同来源的油体蛋白中
高度保守,因此该区域可能对植物有重要意义。首
先,从中间区域的保守性可以推断,来自不同植物
或同一植物及杂交系中的不同油体蛋白可能是由
共同的原始蛋白衍生而来。其次,中心疏水区域的
保守性表明,它在功能上可能起着重要的作用,以
至于进化过程中不轻易置换氨基酸[14]。N端和 C端
两性区域在进化过程中也被保留下来,表明它们
也是重要的,但这些区域在进行某些氨基酸变换
后不至于影响二级结构及其功能[11];C端是由33~40
个氨基酸组成 α-螺旋结构域,该结构域也具亲水和
亲脂性,其带正电荷的基团朝向磷脂层带负电荷的部
分(磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、自由脂肪酸等),带负
电荷的部分朝向油体表面[10]。
油体蛋白的表达有组织特异性,主要在种子发
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2008年第2期
育和成熟过程中的胚(盾片和胚轴)及糊粉层中表
达[14]。油体蛋白的积累模式类似于胚胎发生晚期高
丰度蛋白 LEA(1ateembryogenesisabundantprotein),
且转录过程可能独立于油菜小蛋白(napin)、十字
花科蛋白(cruciferin)等常规的种子贮藏蛋白之
外[18,19]。在以油菜小孢子作为培养来源的心形胚中
可测到相应的油体蛋白的 mRNA,表明油体蛋白
在种子发育的早期就有表达[14]。在油菜花后 2周的
早期胚胎中未检测到油体蛋白的 mRNA,到种子达
最大鲜重开始脱水时转录水平增加 50～100倍 [19],
随后以很低的水平在胚中表达,在叶片中一直未能
检测到油体蛋白的 mRNA的存在。其他研究也进
一步证实油菜中油体蛋白基因在花后 6～12周种子
脱水过程高水平表达,只在子叶中积累[20]。油体蛋
白表达的峰值出现在花后 9～11周,比油菜小蛋白
(花后 4～6周)和十字花科蛋白(花后 6周)要晚,
可以推测油体蛋白积累比常规的种子贮藏蛋白晚
3～4周[19]。
油体蛋白基因5端上游区域有特异的启动子调
控序列:如大豆 24kDa油体蛋白基因(GenBank,
U09118)存在“-300box”、“CA-rich”,“G-box”,“SEF-3”,
“SEF-4”,“RYseedbox”,“ABAbox”,“cAn”,“TATAbox”
等调控序列[21]。在水稻油体蛋白基因上游存在谷物贮
藏蛋白基因的调控元件CATGCANG。油菜油体蛋白
基因上游存在的AATGCATG序列,与豆科植物中控
制 种 子 特 异 表 达 基 因 的 保 守 序 列 RY基 序
(CATGCATG)高度同源[10]。拟南芥油体蛋白基因上
游上存在豆科植物种子蛋白基因上游普遍具有的
序列 TAACACA(俗称 CACA序列)[10],在拟南芥中
对这些调控序列的研究表明这些序列与油体蛋白
在种子中的特异表达有关。
油体蛋白的表达受水分胁迫、茉莉酸、ABA和
渗透调节剂(如山梨醇)的调节[22,23]。如油菜受 ABA
诱导后 4h内即可检测到 20kDa的油体蛋白及其
mRNA;山梨醇处理 1h可测到 mRNA,3~6h可检测
到油体蛋白的积累。另外大豆和拟南芥油体蛋白基
因的启动子区域均存在 ABA反应基元序列(T/
CACGTGGC),特异地受 ABA诱导[10]。茉莉酸则很
可能在转录后水平上对油体蛋白基因表达进行调
控[24]。
2 植物油体表达系统
通过对不同植物油体蛋白基因核苷酸序列的
研究发现,不同油体蛋白分子间除中部疏水区域高
度保守外,N端和 C端的核苷酸序列差异都很大。
当外源小分子量蛋白插入到油体蛋白的 N端或 C
端后,不会影响到油体蛋白在植物油体上的定位[26],
而且形成的重组融合蛋白非常稳定,可在种子中长
期贮存,通过漂浮离心很容易地将它与其他细胞成
分分开[27,28]。油体蛋白在油料植物种子中高水平积
累,例如,在油菜种子中能达到总蛋白的 8%~20%,
当外源基因与油体蛋白一起表达时,表达产物通常
也能达到很高的水平。将目的蛋白基因插入到油体
蛋白基因的 3端,构建由油体蛋白启动子驱动的
“油体蛋白+目的蛋白”植物表达载体(图 2),转化
受体植物,目的蛋白在转基因植物中是以融合蛋白
的形式与油体蛋白一起在油体中特异表达。利用油
体亲脂疏水的特性,将转基因植物种子粉碎,液体
抽提,离心处理,回收上层油相即可将融合蛋白与
细胞内其它组分分开,可去除 90%以上的种子蛋
白。为了方便从融合蛋白中分离纯化目的蛋白,得
到具有生物活性的目的蛋白,一般会在目的蛋白和
油体蛋白质之间引入一个蛋白酶识别位点,比较常用
的是溶血酶(Thrombin)和肠肽酶(Enteropeptidase)。融
合蛋白经酶切后,设法将两者分开,回收目的蛋白
(图 3)[30]。
Xu[21]等克隆了大豆的 24kDa油体蛋白的基因
和启动子,构建了由油体蛋白启动子驱动的“油体
蛋白-肠肽酶-水蛭素”植物表达载体,在转基因烟
草中成功表达了重组蛋白,通过肠肽酶切割,SDS/
图1 玉米油体结构示意图(引自 tzen)[7]
A 油体的几何模型 B 油体半单位膜上的油体蛋白和磷脂
C 磷脂(黑色球体)和油体蛋白(白色球体)
赵传志等:以油体作为生物反应器的研究进展 75
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
PAGE分离得到了水蛭素。Nykiforuk等[30]在拟南芥
中利用油体-油体蛋白这一系统生产人胰岛素,植
物性胰岛素累积到相当高的水平 (0.13%种子总蛋
白)。在大肠杆菌中表达纳豆激酶(丝氨酸蛋白酶)
时往往形成不溶性沉淀,导致没有酶活。Chiang等[32]
通过一个内含肽(intein)片断将纳豆激酶连接接到
油体蛋白的 C端,构建重组蛋白,通过温度诱导内
含肽,释放得到可溶性的具有生物活性的纳豆激
酶。Chen[33]等用三酰甘油酯、磷脂和油体蛋白合成
了人工油体(AOB),只有天然油体的 1/10,通过一
系列生理试验证明 AOB保留了天然油体的特性而
且非常稳定。Peng[31]等利用人工油体优化了油体-
油体蛋白表达体系,在大肠杆菌中构建了“油体蛋
白-Xa-GFP”表达载体,通过离心,olesosin-GFP全部
富集到人工油体的表面,通过蛋白酶 Xa将 GFP从
嵌入油体的油体蛋白中分离,再一次离心,收集上
清液得到高浓度的 GFP。另外,ABA和山梨醇的诱
导对油体蛋白的表达有增益效应[29],可以提高外源
蛋白在油体中的表达量;种子易于加工和运输,因
此有利于工业化生产;分离目的蛋白后的油体仍可
作为食用油或工业用油,而由于有了目的蛋白则可
大大增加农产品的经济附加值。
油体-油体蛋白表达系统是一个从植物中表达
分离外源重组蛋白的新途径,利用该方法目前已经
获得了具有生物活性的 β-葡聚糖醛酸酶 (gus)、木
聚糖酶、降钙素、水蛭素,以及其他药用蛋白,其中
水蛭素在加拿大已经实现了商业化生产,胰岛素在
美国已经通过了 cGMP(curentGoodManufacturing
Practice现行药物生产质量管理规范)的审核,并开
始了商业生产。
3 展望
生物技术的发展日新月异,产业发展势头强
劲。国际上,生物技术的竞争异常激烈,各国均把发
展生物技术作为抢占世界科技制高点、促进本国经
济发展的重要手段。利用植物作为生物反应器,生
产口服疫苗、饲料添加剂和其他重要的蛋白质,可
大大降低疫苗和饲料添加剂的生产成本。在国外,
一些研究机构和公司已经开始从这些产品生产中
获得巨大的经济效益:比如美国星球生物技术有限
公司(PlanetBiotechnology,Inc)利用转基因烟草中
表达的抗体 sIgA生产新药 CaroRxTM,可用于预防
和治疗由细菌引起的龋齿;孟山都公司(Monsanto)
已经培育出一种转基因玉米,每公顷玉米可以产生
3.7kg达到药用蛋白标准的人类抗体。人们对生物
蛋白医药需求的种类和数量正在不断增加,如何建
立高效表达技术平台,如何降低从植物中提取药用
蛋白和工农业用酶的生产成本仍然是需继续探索
和创新。而植物油体表达体系作为一种新的表达和
生产外源蛋白的技术体系,不仅保留了传统植物反
应器安全、经济的特点,对于获得高附加值的医用
蛋白、工农业用酶等有独特的优势。利用该技术生
产的胰岛素(Insulin)、人源脂蛋白(ApoAI)、动物疫
苗、饲料添加剂以及一些营养品和护肤品具有广阔
的市场前景。我国拥有丰富的植物资源,棉花、芝
麻、花生、大豆、油菜和蓖麻等都有着很好的栽培面
积,这为利用油体-油体蛋白表达系统生产药用蛋
白提供了条件。优化该技术生产的程序,解决目前
生物反应器所存在的问题,对提高我国农产品的附
加值,增加农民收入具有重要意义。
参考 文献
1 WernerRG.JBiotech,2004,113:171～182.
2 RothGY.Bio-outsourcingreport.Wilbio-genericscreateanewC
MObusinessContractPharma,2004,43~50.
3 CramerCL,BootheJG,OishiKK.CurTopicsMicrobiolImmunol,
1999,240:95~118.
4 FischerR,EmansNTransgenicRes,2000,9:279~299.
5 FrankenE,TeuschelU,HainR.CurOpinBiotech,1997,8:411～
416.
6 GoldbergRB,BarkerSJ.Cel,1989,56:149~160.
7 TzenJTC,CaoYZ.PlantPhysiol,1993,101:267～276.
8 SilotoRM,FindlayK,etal.PlantCel,2006,18(8):1961~74.
图2 Oleosin融合蛋白载体构建
图3 回收目的蛋白流程图
(下转第79页)
76
2008年第2期
9 FrandsenGI,etal.PhysiolPlant,2001,112:301～307.
10 刘昱辉,贾士荣.农业生物技术学报,2003,11(5):531~537.
11 TzenJTC,HuangAHC.JCelBiol,1992,117:327～335.
12 SlackCR,BertaudWS,ShawBP,etal.BiochemJ,1980,190:551～
561.
13 AnthonyH,HuangC.PlantPhysiol,1996,110:1055～1061.
14 程红焱 宋松泉.植物学通报,2006,23(4):418～430.
15 LaceyDJ,WelnerN,BeaudoinF,etal.Biochemj,1998,334:
469～477.
16 LiM,SmithLJ,ClarkDC,etal.JBiolChem,1992,267:8245
~8253.
17 MilichipM,TathamAS,JacksonF,etal.BiochemJ,1996,314:
333~337.
18 MurphyDJ,BatchelderC,CumminsI,etal.JCelBiochem,1990,
14E(Suppl):323.
19 KeddieJS,HubnerG,SlocomberSP,etal.PlantMolBiol,1992,
19:443~453.
20 MurphyDJ,CummiusI.JPlantPhysiol,1989,1354:63～69.
21 XuMY,LiuDH,LiGQ.AgriculturalSciencesinChina,2004,
3(5):321~329.
22 HatzopoulosP,FranzG,ChoyL,etal.PlantCel,1990,2:457~467.
23 PlantAL,vanRooijenGJH,AndersonCP,etal.PlantMolBiol,
1994,25:193~205.
24 眭顺照,祝钦泷,郑丽,郭余龙,李名扬,裴炎.中国生物工程
杂志,2003,6:17~22.
25 HuangAHC.APhysiolPlantMolBiol,1992,32:177~200.
26 GijsJHVanRooijen,MauriceMoloney.BioPTechnology,1995,
13:72～77.
27 VanRooijenGJH,MoloneyMM.Bio/technology,1995,13:72.
28 MoloneyMM.KoreanJournalofPlantTissueCulture,2000,27
(4):283.
29 AineLPlant,GijsJHvanRooijen,CarolPAnderson,etal.Plant
MolBio,1994,25:193~205.
30 NykiforukCL,BootheJG,MurayEW,etal.PlantBiotechnolJ,
2006,4(1):77~85.
31 PengCC,ChenJC,ShyuDJ,etal.JBiotechnol,2004,111(1):
51~7.
32 ChiangCJ,ChenHC,ChaoYP,etal.JAgricFoodChem,2005,
53(12):4799~804.
33 ChenMC,ChyanCL,LeeTT,etal.JAgricFoodChem,2004,52
(12):3982~3987.
的力学加载的研究要求。
3 结束语
该装置很好地解决了对较大弹性膜的力学加
载问题,且整个装置在实验条件下,工作情况稳定,
实验结果重复性好,具有很好的一致性。证明了装
置设计完全达到了实验的要求。本装置还具有适用
于不同大小的弹性膜加载实验、操作方便、结构简
单耐用,价格低廉等优点,易为各研究机构所采用,
可广泛的运用于细胞力学加载的相关领域的研究
工作。
参考 文献
1 BoegeholdMA.AmJPhysiol,1996,271(2):H387~395.
2 PedersenEM,OyreS.EurJVascEndovascSurg,1999,18(4):
328~333.
3 DardikA,ChenL.JVascSurg,2005,41(5):869~880.
4 TricotO,MalatZ,etal.Circulation,2002,101(21):2450~2453.
5 Shunsuke,etal.JSMEInternationalJournal,2006,49(2):545~555.
6 ShikataY,RiosA,etal.CelRes,2005,304(1):40~49.
梅翀等:细胞培养基底单轴拉伸装置的研制
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第76页)
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