全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
异源表达脂肪酶的重组酵母筛选培养基的改良
赖红星 万霞 张银波 黄凤洪 陈洪 江木兰
(中国农业科学院油料作物研究所 农业部油料作物生物学重点实验室,武汉 430062 )
摘 要: 在脂肪酶产生菌的筛选中, 最常用的方法是三丁酸甘油酯琼脂平板透明圈法和橄榄油琼脂平板变色圈法。而
传统的三丁酸甘油酯平板缺乏有效营养成分,重组酵母无法生长; 橄榄油平板灵敏度较低, 低脂肪酶活力的重组酵母不能产
生变色圈, 这给产脂肪酶基因工程菌的鉴定带来了困难。本研究在三丁酸甘油酯平板的基础上, 添加适合酵母生长的营养成
分, 获得了新的改良培养基;重组酵母在该培养基上生长良好、水解圈清晰, 检测脂肪酶灵敏度高。
关键词: 脂肪酶 重组酵母 改良培养基
Improvement of SelectiveM edium for Heterologous Expression
of Lipase by Recombinant Yeast
LaiHongxing W an X ia Zhang Y inbo H uang Fenghong Chen H ong J iangM ulan
(K ey Laboratory of O il Crops Biology of M inistry of Agriculture, O il Crops Research
Institute of Chinese A cademy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062)
Abstrac:t Them ost common m ethods used for screen ing o f lipaseproduc ing strains a re observa tion o f transparent c ircle on tr ibu
tyr in agar p la te and co lo rchang ing c ircle on olive o il ag ar plate. H ow ever, the recom binant yeast could no t g row on the trad itiona l tr ibu
tyr in p la te because this k ind of med ium is lack o f essen tia l nutrients for yeast g row th. M oreover, the recom binant yeastw ith re la tive ly low
lipase activity could not change co lorw hen g rown on o liv e o il plate, due to the low sensitiv ity o f this se lective medium. These two m eth
ods a re not app licab le for screen ing o f lipaseproduc ing recom binant stra ins on a large scale. In this study, a novel improved m ed ium w as
developed by add ing selected nutr itiona l composition to the or ig ina l tr ibutyr in plate. This m ed ium is proven to be su itab le for yeast
g row th. Results show ed tha t the recomb inant yeast grew we ll and exh ib ited clear transparent c irc le on th is m ed ium. Furtherm ore, th is im
proved m edium is of h igh sensitiv ity w hen used fo r lipase de tection.
Key words: L ipase Recom binant yeast Im proved m edium
收稿日期: 20091015
基金项目:武汉市重大科技产业专项 ( 200720112022) ,武汉市青年科技晨光计划 ( 200950431223)
作者简介:赖红星,男,主要从事脂肪酶工程研究; Ema i:l la ihx999@ 163. com
通讯作者:江木兰, Em ai:l m ljiang@ o ilcrop s. cn
脂肪酶 ( L ipase, EC3. 1. 1. 3) , 又称三酰甘油酰
基水解酶,是一种水解三酰甘油生成游离脂肪酸和
甘油的界面酶,广泛应用于食品、皮革、化妆品、洗涤
剂、印染、医药、造纸、有机合成、能源等领域 [ 1 ]。脂
肪酶广泛地存在于动物、植物和微生物体内,其最主
要的来源是通过微生物发酵生产 [ 2]。从自然界选
育的野生菌株产脂肪酶的能力一般不高, 不能进行
规模化生产。近年来, 从野生产脂肪酶菌株中克隆
脂肪酶编码基因,再转化到大肠杆菌、酵母中高效表
达,构建产脂肪酶的基因工程菌株,已经成为生产脂
肪酶的一种重要手段。
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)表达系统和
巴斯德毕赤酵母 (P ichia pastoris)表达系统是两种表
达真核微生物脂肪酶最常用的系统。在基因工程操
作中,检测脂肪酶活性最常用的两种方法是三丁酸
甘油酯琼脂平板透明圈法和橄榄油琼脂平板变色圈
法 [ 3]。三丁酸甘油酯琼脂平板含有一定浓度的三
丁酸甘油酯,当它被酯酶或脂肪酶水解时,就会在平
板上形成透明圈, 据此可用于检测脂肪酶的活性高
低。早期的研究者,均通过首先制备脂肪酶酶液,然
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
后再转接到三丁酸甘油酯琼脂平板上检测脂肪酶活
性的高低。这种方法虽然较简单, 但这种平板不含
有酵母生长的营养成分, 不能直接用于重组酵母的
筛选。李江华等 [ 3]认为三丁酸甘油酯和丁酸能够
抑制部分微生物的生长和脂肪酶的产生, 当微生物
产酶水平达到一定程度后, 传统的透明圈法和变色
圈法就很难分辨各种微生物产酶水平的差异, 于是
他们在马铃薯培养基上添加 0. 75%三丁酸甘油酯
和 0. 4%丁酸, 用于圆弧青霉碱性脂肪酶的筛选。
这种改良的马铃薯培养基可直接将菌落点接到平板
上进行筛选,但只能用于脂肪酶高水平表达菌株的
筛选,而无法用于筛选产酶水平很低的微生物。橄
榄油琼脂平板变色圈法, 需要加入一定浓度的罗丹
明 B,因此又称为罗丹明平板变色圈法。脂肪酶能
在这种平板上产生橙红色变色圈, 在紫外光下可进
行观察,从而用于脂肪酶活性检测。牛卫宁等 [ 4]将
少根根霉脂肪酶基因转化到毕赤酵母中分泌表达,
使用了罗丹明平板筛选具有脂肪酶活性的重组毕赤
酵母。杨江科等 [ 5]研究洋葱假单胞菌脂肪酶基因
的同源表达时,也使用了罗丹明平板筛选脂肪酶活
性高的菌株。但在本实验中发现, 罗丹明平板的筛
选灵敏度不高,当毕赤酵母和酿酒酵母表达的脂肪
酶活性很低时,就不能产生变色圈,给试验带来一定
误差。
基于以上问题, 本研究以三丁酸甘油酯平板为
基础,开展了培养基营养成分改良研究,目标是获得
既能使酵母生长良好、又能灵敏地检测重组酵母的
脂肪酶活性的新型培养基, 为产脂肪酶工程菌的构
建及鉴定提供一种简便可行的方法。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株与酶液 白地霉 42 (G eotrichum candi
dum 42)脂肪酶酶液由本实验室保存, 白地霉脂肪
酶基因 lip42由本实验室克隆, 其它供试菌株见
表 1。
表 1 供试菌株
菌株 特性 来源
酿酒酵母 INVSc1 H isLeuT rpU ra 购自 Invitrogen
毕赤酵母 GS115 H is 购自 Invitrogen
重组酿酒酵母 INVSc1 /pH BM 354 转化空载体的重组酿酒酵母 本实验室
重组酿酒酵母 INVSc1 /pH BM 354l ip42 转化 lip42的重组酿酒酵母,分泌表达脂肪酶 本实验室
重组毕赤酵母 GS115 /pHBM768 转化 lip42的重组毕赤酵母,分泌表达脂肪酶 本实验室
重组毕赤酵母 GS115 /pH BM 769 转化 lip42的重组毕赤酵母,展示表达脂肪酶 本实验室
1. 1. 2 试剂 酵母氮碱 YNB ( YeastN itrogen Base)
购自 D ifco公司; 三丁酸甘油酯购自 ACROS公司;
罗丹明 B购自 Sigma公司; D生物素、组氨酸、亮氨
酸、色氨酸和琼脂由日本进口分装;葡萄糖、半乳糖、
橄榄油和甲醇以及其它常规试剂均为国产分析纯。
1. 1. 3 培养基 三丁酸甘油酯平板: 10%三丁酸甘
油酯乳化液 (三丁酸甘油酯与 4%聚乙烯醇 1 3搅
拌乳化 ) , 50 mM 甘氨酸NaOH 缓冲液 ( pH9. 2) ,
1. 5%琼脂。
酿酒酵母改良型培养基:以三丁酸甘油酯平板
为基础培养基, 添加 0. 67% YNB, 1% 半乳糖,
0. 004%色氨酸, 0. 002%亮氨酸, 0. 002%组氨酸。
SC罗丹明培养基: 0. 67% YNB, 2% 半乳糖,
0. 004%色氨酸, 0. 002%亮氨酸, 0. 002% 组氨酸,
1%橄榄油, 0. 001%罗丹明 B, 1. 5%琼脂。
毕赤酵母改良型培养基: 以三丁酸甘油酯平板
为基础培养基, 添加 0. 67% YNB, 0. 5%甲醇, 4 !
10
- 5
%生物素。
MM 罗丹明培养基: 1. 34% YNB, 0. 5% 甲醇,
4 !10- 5%生物素, 1% 橄榄油, 0. 001%罗丹明 B,
1. 5%琼脂。
SCU ra(葡萄糖为碳源 )培养基: 0. 67% YNB,
2% 葡萄糖, 0. 004% 色氨酸, 0. 002% 亮氨酸,
0. 002%组氨酸 1. 5%琼脂。
YPD培养基、MD培养基配制见 Inv itrogen毕赤
酵母操作手册。
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2010年第 2期 赖红星等:异源表达脂肪酶的重组酵母筛选培养基的改良
1. 2 方法
1. 2. 1 酵母单菌落的制备 分别从保存的酿酒酵
母 INVSc1和毕赤酵母 GS115斜面挑取一环菌落,
接种到 1 mL YPD液体培养基, 28∀ 培养过夜, 各
自取 100 L菌液 10倍梯度稀释至 10- 6倍; 再取
100 L涂布于 YPD平板, 重组酿酒酵母 INVSc1 /
pHBM 354和 INVSc1 /pHBM 354lip42按上述方法
稀释至 10- 6倍, 分别取 100 L涂布于 SCU ra平
板 (葡萄糖为碳源 ) ; 重组毕赤酵母 GS115 /pH
BM 768和 GS115 /pHBM 769按相同方法处理, 分
别取 100 L涂布于 MD平板, 30∀ 培养直到出
现单菌落。
1. 2. 2 重组酿酒酵母脂肪酶的诱导表达 将在
YPD培养基上长出的酿酒酵母 INVSc1单菌落以及
在 SCU ra培养基上长出的重组酿酒酵母 INVSc1/
pHBM 354和 INVSC1 /pHBM 354lip42单菌落, 用无
菌牙签分别转接到三丁酸甘油酯平板、酿酒酵母改
良型培养基和 SC罗丹明培养基, 25∀ 培养 5 d诱导
脂肪酶的表达。
1. 2. 3 重组毕赤酵母脂肪酶的诱导表达 将在
YPD培养基上长出的毕赤酵母 GS115单菌落以及在
MD平板上长出的重组毕赤酵母 GS115/pHBM 768和
GS115 /pHBM769单菌落,用无菌牙签分别转接到三
丁酸甘油酯平板、毕赤酵母改良型培养基和 MM 罗丹
明培养基,倒置培养,每隔 12 h添加 100 L 100%甲
醇到培养皿盖子上, 25∀ 培养 5 d诱导脂肪酶的
表达。
2 结果与分析
2. 1 重组酿酒酵母的诱导表达
酿酒酵母 INVSc1未转入任何基因, 作为阴性
对照不会产生异源脂肪酶, 但在三丁酸甘油酯平板
和酿酒酵母改良型培养基形成了较小的透明圈 (图
1A,图 1B) ,这可能是酿酒酵母本底表达了酯酶或
脂肪酶造成的。该菌株在供试的 3种培养基上都不
生长 (表 2) , 这是因为 INVSc1是营养缺陷型菌株,
不能在未补充尿嘧啶的培养基上生长。
作为对照的白地霉脂肪酶酶液在三丁酸甘油酯
平板和酿酒酵母改良型培养基上产生了透明圈,在
SC罗丹明培养基上产生橙红色变色圈。
1.酿酒酵母 INVSc1(阴性对照 ) ; 2. 白地霉脂肪酶酶液 (阳性
对照 ) ; 3.重组酿酒酵母 INVSc1 /pH BM 354; 4.重组酿酒酵母
INVSc1 /pHBM354 lip42; A.三丁酸甘油酯平板; B.酿酒酵母改
良型培养基; C. SC罗丹明培养基
图 1 重组酿酒酵母的脂肪酶活性检测
重组酿酒酵母 INVSc1 /pHBM 354也不能在三
丁酸甘油酯平板上生长, 但能在酿酒酵母改良型培
养基和 SC罗丹明培养基上生长;在三丁酸甘油酯平
板和酿酒酵母改良型培养基上产生了较小的透明圈,
在 SC罗丹明培养基上无橙红色变色圈 (图 1,表 2)。
INVSc1 /pHBM 354转入了空载体 pHBM354,该载体带
有尿嘧啶编码基因,因此它能在添加了色氨酸、亮氨
酸和组氨酸的酿酒酵母改良型培养基和 SC罗丹明
培养基上生长。由于载体未连接脂肪酶基因,故该菌
株不表达脂肪酶,小透明圈是本底表达造成的。
重组酿酒酵母 INVSc1 /pHBM 354lip42同样不
在三丁酸甘油酯平板上生长, 在酿酒酵母改良型培
养基和 SC罗丹明培养基上生长; 并且在三丁酸甘
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
油酯平板和酿酒酵母改良型培养基上产生了明显的
透明圈, 在 SC罗丹明培养基上无橙红色变色圈
(图 1,表 2)。载体 pHBM354lip42带有尿嘧啶编码
基因和白地霉脂肪酶基因, 所以重组酵母 INVSc1/
pHBM 354lip42能在酿酒酵母改良型培养基、SC罗丹
明培养基生长,并且能表达脂肪酶在三丁酸甘油酯平
板和酿酒酵母改良型培养基产生透明圈。重组酿酒
酵母的分泌能力弱,且脂肪酶逐步分泌到胞外, 因此
胞外脂肪酶活性低。 SC罗丹明培养基灵敏度低,低
酶活力的脂肪酶不能形成变色圈。
表 2 酿酒酵母在不同培养基的生长和脂肪酶产生情况
三丁酸甘油平板 酿酒酵母改良型培养基 SC罗丹明培养基
是否生长 透明圈 是否生长 透明圈 是否生长 变色圈
INVSc1 ! ﹢ ! ﹢ ! ﹣
白地霉脂肪酶酶液 ﹢﹢﹢ ﹢﹢﹢ ﹢﹢﹢
INVSc1 /pHBM354 ! ﹢ # ﹢ # ﹣
INVSc1 /pHBM354 lip42 ! ﹢﹢﹢ # ﹢﹢﹢ # ﹣
注: #表示酵母生长; !表示酵母不生长;﹢表示产生透明圈或变色圈,且﹢越多表示圈越大;﹣表示不产生透明圈或变色圈
以上结果证明, 酿酒酵母改良型培养基既适合
酿酒酵母生长,又可用于产脂肪酶的重组酿酒酵母
筛选, 且具有较高的灵敏度, 能鉴定出低酶活产生
菌,适合于酿酒酵母这种分泌能力较弱的菌株筛选。
2. 2 重组毕赤酵母的诱导表达
从图 2可以看出原始菌株 GS115在 3种平板上
都不生长,但却在三丁酸甘油酯平板和毕赤酵母改
良型培养基产生了极小的水解圈。毕赤酵母 GS115
是一种带有已突变的丧失功能的组氨酸脱氢酶编码
基因 H IS4的菌株, 它不能自身合成组氨酸, 不能在
缺少组氨酸的培养基上生长,故它在上述 3种平板
上都不生长。极小的透明圈可能是毕赤酵母本底表
达了酯酶或脂肪酶,水解三丁酸甘油酯所致。
白地霉脂肪酶酶液为阳性对照, 能在三丁酸甘
油酯平板和毕赤酵母改良型培养基产生透明圈,在
MM 罗丹明培养基上产生橙红色变色圈,如图 2和
表 3所示。
重组毕赤酵母 GS115 /pHBM 768和 GS115 /pH
BM769,不在三丁酸甘油酯平板生长, 而在毕赤酵母
改良型培养基和 MM 罗丹明培养基上缓慢生长 (图
2) ;它们在三丁酸甘油酯平板和毕赤酵母改良型培
养基上均能产生透明圈 (图 2A, 图 2B ) , GS115/
pHBM 768在 MM 罗丹明培养基上产生了橙红色变
色圈, 而 GS115/pHBM 769在 MM 罗丹明培养基上
无变色圈产生 (图 2C)。由于这两种重组毕赤酵母
基因组上的突变基因 H IS4在转入外源基因时已被
修正为正常的具有功能的组氨酸脱氢酶编码基因
1.毕赤酵母 GS115 (阴性对照 ) ; 2.白地霉脂肪酶酶液 (阳性对
照 ) ; 3. 重组毕赤酵母 GS115 /pHBM769; 4. 重组毕赤酵母
GS115 /pH BM 768; A.三丁酸甘油酯平板; B. 毕赤酵母改良型
培养基; C. MM罗丹明培养基
图 2 重组毕赤酵母的脂肪酶活性检测
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2010年第 2期 赖红星等:异源表达脂肪酶的重组酵母筛选培养基的改良
H IS4,因此能在添加了营养成分和生物素的毕赤酵
母改良型培养基和 MM 罗丹明培养基上生长, 但仍
不能在三丁酸甘油酯平板上生长。GS115 / pHBM 768
是脂肪酶分泌表达重组酵母, GS115 /pHBM 769为脂
肪酶展示表达重组酵母, 分泌表达的脂肪酶活性要
比展示表达的活性高,故 GS115 /pHBM 768在三丁
表 3 毕赤酵母在不同培养基的生长和脂肪酶产生情况
三丁酸甘油酯平板 毕赤酵母改良型培养基 MM罗丹明培养基
是否生长 透明圈 是否生长 透明圈 是否生长 变色圈
GS115 ! ﹢ ! ﹢ ! ﹣
白地霉脂肪酶酶液 ﹢﹢﹢ ﹢﹢﹢ ﹢﹢﹢
GS115 /pH BM 769 ! ﹢﹢ # ﹢﹢ # ﹣
GS115 /pH BM 768 ! ﹢﹢﹢﹢ # ﹢﹢﹢﹢ # ﹢
注: #表示酵母生长; !表示酵母不生长;﹢表示产生透明圈或变色圈,且﹢越多表示圈越大;﹣表示不产生透明圈或变色圈
酸甘油酯平板和毕赤酵母改良型培养基产生的透明
圈比 GS115 /pHBM 769产生的透明圈大, 且它在
MM 罗丹明培养基上产生了变色圈而 GS115 /pH
BM769未形成变色圈。GS115 /pHBM 768在三丁酸
甘油酯平板和毕赤酵母改良型培养基上形成的透明
圈比酶液形成的透明圈大,而在 MM 罗丹明培养基
上形成的变色圈要比酶液形成的变色圈小, 可能是
因为 GS115 /pHBM 768产生的脂肪酶是持续分泌
的,故积累的透明圈较大, MM 罗丹明培养基因灵敏
度低不能积累出更大的变色圈。
以上结果证明, 毕赤酵母改良型培养基既适合
毕赤酵母生长,又可用于产脂肪酶重组毕赤酵母的
筛选, 同时它的灵敏度比传统的罗丹明平板高,可用
于低酶活产生菌的筛选。
3 讨论
在产脂肪酶微生物的大规模筛选、脂肪酶的定
性检测、产脂肪酶工程菌的构建以及脂肪酶的定向
进化等工程技术中, 高通量的筛选方法是解决问题
的关键。常用的三丁酸甘油酯琼脂平板透明圈法和
橄榄油琼脂平板变色圈法是两种最重要的技术。在
产脂肪酶微生物的筛选和脂肪酶定性检测过程中,
将两种方法结合使用可取得良好效果; 但是进行脂
肪酶工程菌的构建和脂肪酶定向进化时, 这两种方
法表现出不足。三丁酸甘油酯平板制作方便, 培养
时间短,灵敏度高,但酯酶和脂肪酶都能产生透明水
解圈, 且该平板不含其他营养物质,一般仅用于检测
脂肪酶酶液的活性 [ 6 ]。罗丹明平板也易于制作,但
培养时间稍长,且灵敏度不高,产酶水平很低的微生
物不能形成变色圈,另外罗丹明平板需要在紫外光
下观察,这又可能导致微生物产生突变。
本研究选择灵敏度较高的三丁酸甘油酯平板进
行改良,添加适合酵母生长的营养物质,改良后的平
板既适合酵母细胞的生长, 又能使产脂肪酶的重组
酵母形成十分明显的透明圈。此外改良的平板还具
有很高的灵敏度,并且改良的培养基乳化效果较好,
油滴微小,使得形成的透明圈也更加清晰。这种改
良型平板不仅可用于脂肪酶酶液的定性检测, 也可
以直接将酵母单菌落点接到平板上进行筛选。在产
脂肪酶工程菌的构建中,无需制备酶液,操作更加简
便; 在脂肪酶的定向进化中, 可进行大规模的高通量
筛选。
参 考 文 献
[ 1] H asan F, Sh ah AA, H am eed A. Industrial appl icat ion s ofm icrob ial
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[ 3] 李江华,房竣,邬显章.碱性脂肪酶高产菌的平板筛选模型.食品
与发酵工业, 2000, 26( 6) : 1114.
[ 4] 牛卫宁,谭天伟.少根根霉 (R hizopu s a rrh izus)脂肪酶基因在毕赤
酵母中的分泌表达.生物加工过程, 2006, 4( 2 ) : 3741.
[ 5] 杨江科,郭道义,闫云君.洋葱假单胞茵 G63脂肪酶基因及其伴
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[ 6] 翁丽星,胡志浩,邓子新,等.类产碱假单胞菌耐热碱性脂肪酶基
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