全 文 ：生物技术通银
研 究 报 告 刀了口r旧曰阴以址口 G Y B U L L E TJ W 2 X刃 年 增 刊
一种用质粒 D NA 转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧
陈洪栋 董文博 李红民
(西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室 植物生物技术研究室 西北大学 生命科学学院 ,西安 71 以拓9
摘 要: 目的是建立一种简化 实用的用质粗 D N A 转化大肠杆菌的操作方法采用氛化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
以质粗 pU C 18 , pC sN 4 , pAN 52 一IN ot , pET 朽, pA N th 和植物双元表达载体 PC A州田IA 1301 分别转化用于质杜扩增与保存的常
用大肠杆菌菌株 T oP 10 和 D H 5a 以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株 B L2 1(DE 3) 和花 1质拉与感受态细胞的混合液1
冰上作用一定时间后 ,直接涂布含有筛选扰生素的 LB 平板 , 于37 培养 12 一16 h 结果表明,用不同大小的质拉 D N A 转化不同
的大肠杆菌菌株 ,都可以获得满足实脸要求 ,转化效率可高达 103~4 阳性克隆 /卜g该方法较标准的转化流程更加简便 省时
实用
关. 词 : Escherichi a 01 转化方法 质杜
D o o hi cke y fo r th e S ta n d a rd T ra ns fo rm a ti o n P ro to co l o f P la sm id s
D N A T ra ns fe r in to C o m P ete n t E 跳力曰介力加 c 拉
C h e n H o n gd o ng D o n g 习V enb o L i H o n g n lu l
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K e y wo rds : Es ch eri c恤 co li T ~ fo ~ tio n me th od plas 而 d
引官
质粒 D N A 成功转化大肠杆菌 (Esc heriehia eol i,
E .011)由 Cohen 等首次报道f,1.此后 ,多位研究者对
影响质粒转化 E .co h 的条件如温度 离子强度和种
类 质粒分子质量大小等进行了优化和改进 12 ,最
终形成一致认可的转化程序 :E .coIJ 细胞与 D NA 在
抓化钙存在下于 0一4 作用一定时间后于 42 短
暂热激 2一 3 m in , 冰浴 2一3 m in ,随后在不含抗生素
的液体培养基中于 37 恢复培养 30 一60 m in 后涂
布选择性平板13 该方法被称为是 E .co h 细胞的标
准转化方法 ,在世界范围内的分子生物学实验室中
广泛应用并不断被完善 , 最高转化效率可达 107-
1护克隆单g 质粒 DN A1 4] 然而 ,利用该方法完成
质粒 D NA 对大肠杆菌的转化 , 至少需要约 2. 5 h ,
对于一般的质粒转化实验而言 , 比较费时费力
文章作者尝试劝这一标准转化程序进行简化 ,获得
收稿 日期 二2(X 玲一04 一29
羞金项目:西安市科技局科技攻关项目(以刀印78)
作者简介:陈洪栋(19 86 一),女,硕士研究生 ,研究方向:西北大学生命科学学院细胞生物学方向;E 一耐 l:huij ie102 2l lo@ sina .co m
通讯作者 :李红民 , E - . 11 :li卜.口侧X泛翰脚u.ed u. cn
298 吐物孩术通报 召川介互汤 2 (X 刃 年 增 刊
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了比较满意的结果
l 材料与方法
菌株和质粒 :两种 E. co h 菌种类型 :用于质粒
扩增与保存的大肠杆菌菌株 To plo 和 D H 5a , 用于
外源基因表达的 BI2 1 (n E3) 和 TB I , 均为本实验
室留存菌种 ; 转化用质粒 D NA 分别为 pu C 18 (2 .69
kb ,实验室留存) pc SN科(4.4kb ,美国真菌遗传与保
藏中心惠赠 ) PA N 52一IN ot (5.3kb ,荷兰 翎 营养
与食品研究所 Pu ni PJ 教授惠赠), 邱Tts (7. skb ,实
验室构建留存) 衅Nt h (9.g kb ,实验室构建留存),
pCA M BIA 13ol(11.8比 ,澳大利亚 CA M B认 惠赠).除
植物双元表达在载体 pCA M BI A 1301 携带卡那霉素
(K anam yci n , A ~ sc o) 抗性基因表达盒外 , 其他质
粒均具有氨节青霉素 (A m Pi cil hn , A Ine sc )抗性基
因表达盒
感受态细胞制备 :不同类型细胞的过夜培养液
分别以 2% 的接种量转接至 50m l LB 培养基中(1%
胰蛋白脉 , 0.5% 酵母提取物 , 0.5% Naa , 固体培
养基添加 1.5% 琼脂糖) 于 37 振荡培养至 A . -
0. 7一0. 8 , 收集菌液并冰浴 10 m in 以上 , 4 离心收
集菌体 , 重悬于 10 1 0.IM CaC12, 冰浴 10 m in 以
上 , 4 离心收集菌体 ,重悬于 2 ml O.IM Ca a Z[J.
质粒 DN A 制备与转化 : 所有质粒均按照质粒
提取试剂盒 (Ta K aRa M in iB E ST , Japan ) 说明书进
行 调整质粒浓度至 50n gl卜L 1闪 质粒 DN A 与
10 闪 感受态细胞混合 ,冰浴 一印 m in , 吸取 10闪
混合液涂布选择性 比 平板 , 37 培养 12 ~16 h 观
察抗性克隆的形成 ,统计实验结果
2 结论
文章作者用分子质量介于 2. % kb 和 1 .s kb
之间的各种质粒分别转化几种受试大肠杆菌细胞 ,
缺省了标准转化程序中的操作 实验表明 ,所有质
粒均可转化进人相应宿主细胞 结果显示 ,在缺省
热激和恢复培养的转化操作中 , 质粒 DN A 与感受
态细胞作用的时间称为影响转化效率的重要因素
圈 1 质较 O N A 与大肠杆菌盛受态细胞作用时间
对转化效率的影晌
伴随冰浴时间延长 , 质粒转化效
1) 当冰浴时间在 40 而n 以上时
有的可高达 1少个午g D NA .
笼明显
,抗性克
提高 (图
隆的数量
3 讨论
在早期的 E. coli 遗传转化中, 大量的研究致力
于提高转化的效率以满足部分实验研究的需要 ,如
基因组文库或 cDN A 文库的构建 ,高转化效率对于
文库质量至关重要 伴随文库构建方法的发展和
改进 ,质粒已经不再是文库构建当中唯一可选的载
体分子 但是 ,用质粒 D N A 转化 E .o1i 感受态细胞
一直是分子生物学实验室非常重要而且常规化的
操作之一 , 特别是用于质粒载体的扩增与保存 基
因克隆 表达载体构建以及质粒 D N A 在不同宿主
细胞间的转移
作者的研究表明 , 质粒 D NA 与大肠杆菌感受
态细胞冰浴作用一定时间后直接涂布选择性平板 ,
可以获得足够高的转化效率 尽管转化效率 (最
高可达 1少个单g DN A) 较标准转化方法的效率
(l 护一, 个单g D NA) 低 , 甚至低于 Po pe 等建立的 5
m in E 诫 转化方法 15 , 但是利用作者建立的简化
程序在较短的时间内获得的转化克隆的绝对数量
对于后续操作已经足够 实际上 ,如果转化的目的
只是为了质粒载体的扩增与保存 基因克隆 表达
载体构建以及质粒 DN A 在不同宿主细胞间的转
移 ,热激和恢复培养完全可以省略 使用者可以根
据 自己的目的和要求 , 通过调整质粒 D NA 的浓度
及其与感受态细胞冰上作用的时间以获得比较满
意的转化效率 另外 ,因为操作步骤的减少 ,污染杂
菌的风险也随之减少 但是 ,用连接产物转化大肠
杆菌感受态细胞时 ,热激和随后的恢复性培养操作
十分必要 ,否则大大影响实验结果
2X珍 年 增 刊 陈洪栋等:一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态谕胞的实用操作技巧 299
C oh en sN , C han g ,
2 11小 2 114 .
H 胡 ah an D M OI B IOI
今考文献
ACY ,H su, L PNAS , 197 2, 69 (8):
1983 , l肠 :557~ 580
3 5 切山ro k J , Fri 砚 h E F , M 田心西5 T. M ol ec ul ar C1 0川ng : 人 兀 卜卜 5
皿创甲 M anu al . Znd 记 , N ew Yo rk : C old SPri ng H az ho r l别喃ra-
协叮 P 湘 s, 1989 .
C bung C T , N ie砚 la SL , M iler R H .PN A S , 1989 . 86 7 ):
2172~2 175 .
Po伴 B , K ent H M .N二leie Ac ids R esarc h , 19 6, 24 (3): 536一537
闷卜咖闷卜巾刁卜巾月卜啦月卜咖闷卜咖月卜巾月卜啦门卜 肋月卜中 闷卜巾闷卜咖闷卜巾 月卜巾月卜巾月卜咐门卜啦月卜咖月卜啦月卜巾叫卜啦闷卜啦闷卜 卜月卜啦月卜巾阅卜.朴闷卜 加月卜啡闷卜心阅卜咖月卜啦闷卜伞 月卜 朴月卜咐阅卜 和月卜巾门卜 如闷卜 和门卜 牡叫卜 种月卜 1 闷卜 断叫卜 牡闷, 朴川,
(上接第 283 页)
8 Boulton CA , R刘司乎 C.API M ie功biol Biot ec b,1984 ,20 :72 76 .
9 Z hao X , K ong X , H us Y ,et al .E ur J U Pid sci .n父俪d .2加8 , 110
(5):405~4 12.
10 曲威 , 刘波, 等.辽宁师范大学学报 (自然科学版),2以场.29
(l):88一92 .
1 Du j加 B , Sh~ D , F i舰卜巴 G ,d 址.N at ure ,2仪辫,430 (倪为5):
3 5 ~ 4 4 .
Mli ekova K , R oux E , A th 翻 妞妇t K ,et ai .A 即 1 E nviro n M ierob iol ,
2城抖,70(7):3918一3924 .
P甲 耐 ko肠 u s , Chev目ot l, Ko 耐 tis M ,et ai A nton ie v an
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L笼wenb 此k ,2(X) 1,80(3礴 ):215一224 .
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(上接第 286 页)
今考文献
1 特奈普西德(知而p~ Is B) ,朗(肠叱 A R) . 动物源性食品中
药物残留分析方法M I. 福建进口食品行业协会译. 天津 :
科技翻译出版公司 , 19 9 , 404 .
Z T卜 e~ A .C七卜对ng, et 吐.10帅 al 试Chro ma t电喇Ph y B, 2以拓.
众 鱿试 E , et 日.J倒回目 of C 知m m 川雌 p hy A . 2以抖, l以 7:85 ~ 92 .
徐维海 ,林黎明 ,朱校斌,等.分析测试学报 , 2以抖, 23(5) .
庞国芳 , 曹彦忠 . 张进杰 , 等.分析化学研究报告 , 2加5 , 9
(33):125 2~1256.
林海丹 ,谢守新.冯德雄.分析侧试学报 ,2(X) 3 ,22 (1) .