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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
双色荧光多重 PCR技术及在禽流感病毒检测中的应用
侯立华 1, 2 黄新 2 朱水芳 2 王慧煜2 韩雪清 2
( 1沈阳农业大学生物科学技术学院,沈阳 110161; 2中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所,北京 100029)
  摘  要:  为快速检测 7种亚型禽流感病毒,对引物进行双色荧光标记,建立双色荧光多重 PCR ( DFM
PCR )方法, 通过运
用 DFM
PCR可一次检测出 7种禽流感病毒亚型。此方法为应用于病毒或病原等一些要求快速、高通量的检测领域打下基
础, 而且为禽流感病毒检测以及其他种类病毒等病原检测提供了一种新型方法。
关键词:  禽流感病毒 DFM
PCR 高通量
Detection ofAIV Subtypes Using Dual Fluorescence
Multiplex
PCR Technique
Hou L ihua
1, 2
Huang X in
2
Zhu Shuifang
2
W angHu iyu
2
H an Xueqing
2
(
1
Co llege of Biotechno logy, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161;
2
Institute of A nimal and PlantQuarantine, Chinese A cademy of Insp ection and Quarantine, Beij ing 100029)
  Abstrac:t  The dual fluorescencem ultip lex PCR ( DFM
PCR ) m ethod w as estab lished and used for the rap id detection of seven dif

ferent subtypes of A IV. The results show ed that there is no cross reac tion w ith o the r v irus and the DFM
PCR m ethod is reliable forA IV
detection, w hich can be used as a new detection m ethod for o ther v iruses o r pathogens.
Key words:  Av ian influenza v irus( A IV )  DFM
PCR H igh
through
收稿日期: 2009
10
14
基金项目:转基因生物新品种培育科技重大专项 ( 2008ZX08012
001 )
作者简介:侯立华,男,硕士,研究方向:从事植物检疫新技术方面研究; E
m ai:l holihua@ gm ai.l com
通讯作者:黄新,男,博士; E
m ai:l huangx@ caiq. org. cn
  禽流感 ( av ian inf luenza)是一种急性、热型、高度
接触性传染病,主要寄主为禽类。禽流感病原为禽流
感病毒 ( av ian influenza v irus, A IV ), 该病毒是正黏病
毒科 ( orthomyxoviridae)、流感病毒属的一个成员。禽
流感病毒属于 A型,主要依据血凝素 (HA )和神经氨
酸酶 ( NA )亚型来分型, 有 16种 HA亚型和 9种 NA
亚型。此外,对禽流感病毒还可以根据致病性进行分
类 [ 1]。禽流感不仅在禽类中传染致病,而且 1997年
就有报道禽流感病毒感染人事件 [ 2]。2003年以来,
禽流感在东南亚地区爆发。我国于 2004年公布首例
确诊高致病性禽流感疫情。根据 WHO统计, 截止
2008年 9月 10日,全球因禽流感病毒已有 245人致
死,其中中国 20人感染死亡 [ 3]。
因此, 作为禽流感防控基础的禽流感病毒检测
显得更为重要。目前检测禽流感病毒的方法除传统
的病毒 ELISA检测 [ 4 ]方法外,还有基因芯片 [ 5- 8]、实
时荧光 RT
PCR[ 9 ]等方法。在高通量、快速检测禽
流感病毒方法中,还应用到多重 PCR技术 [ 10
12]。多
重 PCR (mutiplex PCR )为同一管中加入多对特异性
引物,与 PCR管内的多个模板反应, 在一个 PCR管
中同时检测多个目标 DNA分子,比 ELISA、基因芯
片等方法更加简便快捷,备受青睐。但在 PCR产物
分子量相近 (或相同 )的情况下,便无法达到检测分
辨目的。本研究在建立多重 PCR检测体系基础上,
设计一套双色标记的 PCR引物, 建立了 7种禽流感
病毒亚型的双色荧光多重 PCR ( dual fluorescence
mu lt ip lex
PCR, DFM
PCR )检测方法, 达到高通量检
测禽流感病毒目的。
1 材料与方法
11 材料
禽流感病毒 H1亚型、H3亚型、H5亚型、H6亚
2010年第 1期 侯立华等:双色荧光多重 PCR技术及在禽流感病毒检测中的应用
型、H9亚型、N1亚型、N2亚型、H 12亚型、H14亚型
以及禽痘、马立克、PVA、PVX的病毒材料由中国检
验检疫科学研究院动植物检疫研究所提供。 DNA
M akerDL2000、T aK aRa Ex TaqTM聚合酶购自大连宝
生物有限公司。M J Research PCR仪 (美国 )、N ano
D rop
TM
ND
1000核酸 /蛋白检测仪 (美国 )、A lpha凝
胶成像仪 (美国 )和 Fu jifilm FLA
5100荧光成像分
析仪 (日本 )等。引物由大连宝生物有限公司合成。
引物序列及各禽流感病毒亚型扩增片段大小, 如表
1所示。
表 1 A型流感病毒 7重 PCR探针引物及扩增片段大小
型别 引物编号 序列 ( 5 - 3 )             片段长度 ( bp)
H 1
H 1 f
H 1r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGAGCAATTGAGTTCAGTATC
CY5
GGTTTCGGATGTTACAGCGTGACACTCTCCTATTGTGACTG 640
H 3
H 3 f
H 3r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGTGTTACCCTTATGATGTGCC
CY5
GGTTTCGGATGTTACAGCGTCCCTGTTGCCAATTTCAGAG 708
H 5
H 5 f
H 5r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGAGTGAATTGGAATATGGTAACTG
CY5
GGTTTCGGATGTTACAGCGTAACTGAGTGTTCATTTTGTCAAT 419
H 6
H 6F
H 6R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGGCACTTATTGGRTCAGG
TAMRA
GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCCTCTAGTTTCAATCTGTGG 724
H 9
H 9 f
H 9r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGAGAATGGTCCTACATCGT
TAMRA
GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGATCTTACTCGCAATGTCTG 532
N1
N1 f
N1r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGTCCCACTTGGAATGCAGAAC
TAMRA
GGTTTCGGATGTTACAGCGTCACATGCACATTCAGACTCTTG 367
N2
N2 f
N2r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGATAGCATGGTCCAGCTCAAG
TAMRA
GGTTTCGGATGTTACAGCGTACATGCTGAGCACTTCCTG 338
12 单重及多重反应条件建立
单重 PCR反应体系 ( 50
L) : 10 ! Bu ffer 5
L,
dNTP( 25 mmo l/L ) 4
L, 上游引物 ( 10
mol/L ) 1

L,下游引物 ( 10
mo l/L ) 1
L, 模板 1
L , Ex
Taq
TM
05
L,补去离子水至 50
L。多重反应体系
( 50
L) : 10 ! Buffer 5
L, dNTP ( 25 mmo l/L ) 4

L,上游引物 ( 10
mo l/L ) 1
L ! 7, 下游引物 ( 10

mo l/L ) 1
L ! 7 , 模板 1
L ! 7, Ex TaqTM 05
L,
补去离子水至 50
L。反应条件: 95∀ 5 m in; 94∀
30 s, 52∀ 60 s, 72∀ 90 s, 35个循环; 72∀ 10 m in。
反应结束后取产物 5
L, 用 2%琼脂糖凝胶电泳,
SYBR G reen#染色分析。
13 多重 PCR验证
将 7种单重 PCR产物混匀, 取 5
L与多重
PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
14 DFM
PCR及其检测
以上述多重体系进行 DFM
PCR, 反应结束后,
取 5
L PCR产物用 2%琼脂糖以无核酸染料方式
电泳,用 FLA
5100荧光成像分析仪分别在 532 nm
和 635 nm下对凝胶扫描分析。
15 特异性试验
用上述方法对 A IV H12亚型、A IV H14亚型、禽
痘、马立克、PVA、PVX的病毒材料进行特异性试验。
16 敏感性试验
通过 ND
1000核酸 /蛋白检测仪对 A IV H1、H3、
H5、H6、H9、N1、N2共 7种亚型病毒质粒定量,将禽流
感病毒质粒 10倍梯度比稀释,进行敏感性试验。
2 结果
21 单重 PCR和多重 PCR扩增结果
对 7个单重 PCR和 7重 PCR产物进行琼脂糖
凝胶电泳然后进行 SYBGreen I染色检测, 结果如图
1所示。从图 1可以看出, 在 7重 PCR反应中,检测
出 6条电泳条带。通过与单重 PCR条带对比分析,
可以判断由于 H3、H6亚型 PCR产物条带分子量相
169
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 1期
接近 (分别为 708 bp和 724 bp)多重中 H3亚型和
H6亚型 PCR产物条带重合, 因而无法通过普通
PCR以及琼脂糖凝胶电泳得以区分。
图 1 单重 PCR和多重 PCR扩增产物
22 多重 PCR验证
从图 2可以看出,第 1泳道和第 2泳道的条带
数目和位置一致,即 7重 PCR电泳条带与 7种单重
PCR混合后再电泳的条带结果一致, 说明 7重 PCR
试验结果与推断相符。
M. DL2000; 1.多重 PCR; 2.单重 PCR混合
图 2 多重 PCR和 7个单重 PCR混合电泳图
23 DFM
PCR的荧光检测
对双色荧光 7重 PCR琼脂糖凝胶进行扫描,结
果如图 3、图 4所示。在 532 nm下, 双色荧光多重
PCR产物检测出 4条带 (图 3) ,与荧光单重 PCR对
照,可知检测出的 4条条带分别为 5 Tamra标记的
H6、H9、N1和 N 2等 4种亚型。而 5 Cy5标记的
H1、H3和 H 5等 3个单重条带不可见, 其对应的荧
光探针 7重 PCR处也无条带。
在 635 nm下扫描 7种禽流感亚型的 DFM
PCR
产物琼脂糖凝胶 (图 4), 在多重 PCR泳道中, 有 3
条条带,分别对应于荧光引物单重 PCR产物中 H1、
H 3和 H5亚型。标记有 Tam ra的亚型条带不可见。
琼脂糖电泳凝胶在 635 nm扫描下,又检测出 3种禽
流感病毒亚型。
禽流感 H3和 H6亚型的 PCR产物由于分子量
相近而无法检测分辨,普通引物 PCR的琼脂糖凝胶
在相同的条件下检测出 6条 (图 1)。通过对 7重亚
型的引物加上不同的荧光标记,由于 PCR产物中分
子大小相近条带携带有不同荧光, 进行 DFM
PCR
反应后,在特定波长扫描下, 7种亚型被扩增检测到
(图 3, 图 4)。
24 特异性试验
采用本研究的 DFM
PCR方法对禽流感 H1、
H 3、H 5、H 6、H 9、N1、N 2 7种亚型进行扩增并且经过
双波长扫描, 共获得 7条特异性条带; A IV H12亚
型、A IV H14亚型、禽痘、马立克、PVA、PVX的检测
结果均为阴性,未检测出任何条带 (图 5, 图 6)。说
明该 DFM
PCR只能特异性地扩增检测出 A IV H1、
H 3、H 5、H 6、H 9、N1、N 2等 7个亚型。
170
2010年第 1期 侯立华等:双色荧光多重 PCR技术及在禽流感病毒检测中的应用
25 敏感性试验
A IV 7种亚型质粒分别经定量、10倍梯度稀释
后经行多通道荧光 PCR, 结果如图 7和图 8所示。
所建立的 DFM
PCR对 A IV H1、H3、H5、H6、H9、N1
和 N 2亚型检测的敏感性分别达到 5 ! 105拷贝、6 !
10
4拷贝、4 ! 106拷贝、4 ! 105拷贝、5 ! 106拷贝、6 !
10
5拷贝、3 !106拷贝。
3 讨论
本研究中,多重 PCR在高通量检测同时, 受琼
脂糖凝胶特性影响,使得分子大小相近的条带 (图 1
中 708 bp和 724 bp两个片段 )无法被区分检测, 从
而抑制多重 PCR高通量特性的发挥。
为达到区分相近条带目的,本试验采用双色荧
光标记引物, 扩增后使 PCR产物携带不同荧光标
记, 对其进行特定波长扫描, 从而区分检测出分子量
相近条带,如图 3和图 4所示。本试验成功获得 7
重 PCR反应体系并通过双色荧光多重 PCR ( DFM

PCR)高通量地检测了 7种禽流感病毒亚型。
据文献报道 [ 13 ] ,运用毛细管电泳也可达到分离
分子量相近的 PCR产物片段的目的,但毛细管电泳
操作复杂,对设备和试剂有特殊要求。在实验室条
件下, DFM
PCR是以多重 PCR和荧光标记为基础,
便于操作和掌握, 能够更好地应用于病原的快速检
测领域。
该方法可根据扩增基因序列特征, 设计多重荧
光标记 PCR进行检测, 实现基因片段多色识别。不
仅提供了禽流感病毒的一种新型高通量检测方法,
而且为其它种类的病毒、病原等要求快速、高通量的
检测领域打下了基础,对于生物检测领域具有重要
的借鉴意义。
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