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综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
禽流感病毒新型疫苗的研究进展
胡建和 王青 杭柏林
(河南科技学院动物科学学院,新乡 453003 )
  摘  要:  疫苗免疫是禽流感防控的主要措施之一, 随着生物技术的不断发展, 基因工程亚单位疫苗、活载体疫苗、DNA
疫苗等新型疫苗得以研究和开发,这为禽流感的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有传统疫苗的保护效果外,在生物安全
和普遍防控等方面也具有广泛的优势,是禽流感疫苗发展的新方向。
关键词:  禽流感病毒 新型疫苗 研究进展
Progress in Development of Avian Influenza V irusNew Vaccine
Hu Jianhe W ang Q ing H ang Bolin
(School of A nimal Science and VeterinaryM edicine, H enan Institute of Science and T echnology, X inx iang 453003)
  Abstrac:t  Vacc ination as a prim arym eans o f prevention and con tro llingm easures had been increas ing ly ex tensive attention
W ith
the g reat developm ent and using o f them o lecular b io techno logy, new vacc ines, such as subun it vacc ine, recom b inant liv e vector vacc ine,
and DNA vaccine, etc, w ere used to prevent this disease
Due to the sa fety and efficacy, it cou ld be the new trends o f influenza vacc ines

Key words:  Av ian influenza v irus New vacc ine P rogress
收稿日期: 20100331
基金项目:河南省高校杰出科研人才创新工程项目 ( 2006KYCX020 )
作者简介:胡建和,男,副教授,博士,主要从事动物微生物学、免疫学和分子病毒学研究; Em ai:l 35675562@ qq. com
禽流感 ( A I)是由 A型流感病毒引起的一种禽
类病毒性传染病,可引起鸡、火鸡以及其它禽类,特
别是迁徙水禽的感染, 主要侵害各种鸟类的呼吸系
统、消化系统及神经系统等,产生从无症状或温和症
状到高度致死性的感染。根据禽流感病毒对易感禽
的致病性将其分为高致病性 ( HPA I)、低致病性
( LPA I)和无致病性 3种。其中 HPA I被世界动物
卫生组织 ( OIE )列为法定必须上报的传染病。早在
1878年, Perroncito[ 1]就报道了禽流感在意大利的流
行,近几年来多次发生的禽流感病毒直接感染人并
导致死亡的事件, 使该病具有重要的公共卫生学
意义。
禽流感病毒 ( av ian influenza virus, A IV )属于正
黏病毒科,流感病毒属。病毒粒子具有多形性,典型
的 A IV粒子呈球形,直径为 80- 120 nm。按照血凝
素 (HA )和神经氨酸酶 ( NA )表面抗原来区分, 可将
A型流感病毒分成若干亚型 [ 2]。目前, 已发现了 16
种 H亚型 (H1- H16)和 10种 N亚型 (N1- N10)。
A型流感病毒具有宿主特异性, 感染禽类并致病的
通常是 H5、H7和 H9亚型。但由于流感病毒经常
发生抗原变异,同时各亚型之间无交叉保护性,给禽
流感的防制带来极大困难。禽流感防制的实践表
明, 疫苗免疫是防止禽流感暴发的主要措施。
目前应用的禽流感疫苗主要是传统的全病毒灭
活疫苗。但是灭活疫苗存在以下主要缺点: 免疫力
低下,保护效果不理想, 而且在制备工艺、安全性和
大面积应用上均存在很多隐患。近年来,随着生物
技术及分子生物学、基础免疫学、反向遗传学等科学
理论的飞速发展,促进了疫苗研究的进展,使得新型
禽流感疫苗的开发和应用有了更大的发展空间。
1 新型禽流感疫苗种类、特点
1
1 基因工程亚单位疫苗
基因工程亚单位疫苗是指利用 DNA重组技术,
将编码病原微生物保护性抗原基因导入受体菌 (如
大肠杆菌 )或细胞, 使其在受体中高效表达,分泌保
护性抗原肽链,提取保护性肽段加入佐剂后免疫动
物进而引起机体特异性免疫反应。
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
亚单位疫苗是病毒粒子的一部分,不含有核酸,
具有很好的安全性, 也能刺激机体产生足够的免疫
力,而且已研制出的亚单位疫苗在抵抗同源病毒的
攻击方面显示了良好的保护力,因而具有很好的应
用前景。但亚单位疫苗仅代表了蛋白抗原的一部
分,免疫力持续时间短,所以必须和佐剂合用。
血凝素 ( hemagglutinin, HA )是构成禽流感病毒
囊膜纤突的主要成分之一, 在病毒吸附及穿膜过程
中起关键作用,可刺激机体产生中和抗体,为禽流感
病毒中最为重要的保护性抗原。刘明 [ 3]构建了杆
状病毒转移载体, 分别表达了 H5N1亚型禽流感病
毒的 HA基因和 NA基因, 将这些表达产物对 SPF
鸡进行免疫,结果表明 NA + HA联合免疫组的免疫
效果最好。禽流感病毒的 HA基因极容易发生变
异,而 M2蛋白是禽流感病毒的跨膜蛋白它含有高
度保守的抗原决定簇。有研究表明, M 2抗体在小
鼠体内能够抑制流感病毒的复制。因此, 利用 M2
来研制具有交叉保护作用的通用亚单位疫苗是一种
有效预防流感病毒的措施, 是今后开发研究疫苗的
一种新思路 [ 4]。
1
2 重组活载体疫苗
活载体疫苗是指将病原体的抗原保护性基因和
基因缺失的病毒载体相连接,将制备的含有目的基
因的活病毒直接免疫动物引起机体特异性免疫反
应。目前常用的病毒载体有痘病毒、腺病毒、疱疹病
毒和逆转录病毒等, 目前研究最多的是利用痘病毒
进行禽流感活载体疫苗的研究 [ 5 ]。
重组活载体疫苗兼具死疫苗和活疫苗的优点,
克服了常规活疫苗毒力返强的缺点, 免疫效果也较
理想。但重组载体系统本身特性以及在对插入的外
源基因的选择等方面仍存在很多问题, 这为以后的
研究提供了新的方向。
1991年 Tripathy等 [ 6]将 A /Ty /w is/68 ( H5N9)
的 HA基因插入禽痘病毒疫苗株 TK基因,构建了表
达 HA基因的重组痘病毒疫苗, 接种 SPF鸡产生了
特异性 H I抗体。国内进行禽流感活载体疫苗研究
集中在哈尔滨兽医研究所, 2003年 Q iao等 [ 7]构建
了能同时表达 H 5N1亚型 HA基因和 NA基因的重
组禽痘病毒 ( fow l pox v irus, FPV )重组疫苗, 攻毒结
果显示该疫苗具有良好的免疫保护性; 2004年, 乔
传玲等 [ 8]将表达 H5亚型禽流感病毒 HA和 NA基
因的 rFPV以不同剂量分别经翅下刺种、肌肉注射、
皮下注射、点眼及滴鼻途径接种于 4周龄 SPF鸡。
结果该疫苗经翅下刺种、肌肉注射、皮下注射途径接
种的 SPF鸡,能够诱导其产生 H I抗体;用 100LD50
的 HPA IV /Goose /Guangdong /1 /96 (H 5N1 )毒株
攻击后,免疫鸡无发病和死亡。
1
3 冷适应流感弱毒疫苗
冷适应流感弱毒疫苗是指将野毒株感染鸡胚在
较低温度下 ( 25- 30 )培养, 连续传代后可较快的
使病毒的致病力减弱,从而获得冷适应流感弱毒株,
之后使用该弱毒株免疫使机体产生特异性免疫
反应。
美国和俄罗斯的科学家研究出这一方案后, 得
到了遗传稳定的减毒冷适应的甲型、乙型流感病毒
株。这种冷适应株被认为是减毒活疫苗的供体
株 [ 9]。由于弱毒疫苗的接种途径是滴鼻或喷洒入
鼻腔,因此可减少肌肉注射存在的应激反应。弱毒
疫苗可诱导细胞免疫和体液免疫, 其能在体内复制
使其抗体维持时间长,对表面抗原发生漂移的流行
株病毒有一定的保护作用 [ 10]。但是, 冷适应减毒活
疫苗与其它流感病毒可能发生基因重配得到毒力恢
复的重配株病毒,此外, 冷适应减毒活疫苗在免疫缺
陷患者中使用有致病的危险。
1
4 温度敏感突变株 ( TS)疫苗
温度敏感突变株疫苗是指在化学诱变剂 ( 5氟
尿嘧啶碱基类似物 )的作用下培养病毒, 筛选出对
温度敏感并能稳定遗传变异株, 并用这种温度敏感
变异株免疫使机体产生特异性免疫反应。
该疫苗经鼻腔黏膜免疫, 能产生局部免疫和细
胞免疫,而且其与病毒自然感染过程相似,有效地将
病毒阻止在上呼吸道,在第一时间将病毒杀死,阻止
病毒在上呼吸道细胞中的繁殖, 同时由于病毒能在
接种部位繁殖,能产生持续抗体。然而,重配 TS疫
苗在遗传学上不稳定,临床试验发现有 TS表型丧失
和毒力回复现象,从而妨碍了其进一步开发应用。
Parkin等 [ 11]对 PB2聚合酶几个特定的氨基酸
突变,产生 2个温度敏感型毒株,其只能在较低温度
复制,当温度为 38 时, 病毒的复制停止。这样病
毒就只可能存在于上呼吸道, 避免了病毒进一步进
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2010年第 8期 胡建和等:禽流感病毒新型疫苗的研究进展
入机体内部危害宿主的可能性。
1
5 复制缺陷型流感病毒疫苗
复制缺陷型流感病毒疫苗是指运用反向遗传学
方法从 cDNA水平上获得缺失的病毒粒子,该病毒
粒子感染细胞时,能在细胞内表达病毒蛋白但不能
形成有感染力的病毒粒子, 进而使机体产生针对流
感病毒的免疫。
该疫苗在组织培养物中生长良好,免疫动物后,
不仅能产生保护性抗体, 而且能诱导很强的细胞免
疫。该疫苗是一种有发展前途的活疫苗, 但由于此
苗在试验动物 ! ! ! 小鼠体内生长有限, 因此该疫苗
只能作为一种潜在的侯选活疫苗。
利用反向遗传学技术可获得减毒的 A IV,不仅
能产生保护性抗体,而且能诱导很强的细胞免疫,是
一种很有发展前途的活疫苗。此疫苗能够在几个星
期内获得,从而能应付紧急流感事件来临时对疫苗
的需求。
Subbarao等 [ 12]利用反向遗传学技术将高致病
性的 H 5N1病毒株的 HA基因裂解位置的序列改
变,把内部基因用 A /PR /8 /34(H 1N1)的基因替换,
最终得到的病毒毒株制备的疫苗能保护小鼠对野生
型 H5N1病毒的攻击, 而且阻止 H5N1强毒在鼠肺
中的复制。W atanable等用从 cDNA获得的 NS2蛋
白缺失的病毒粒子感染细胞表达后, 能产生无感染
力的病毒粒子。用此疫苗免疫小鼠 3个月后, 可抵
御 10或 100 LD50 A IV的攻击。
1
6 裂解病毒疫苗
裂解病毒疫苗是由去除了病毒核酸和大分子蛋
白但同时保留了抗原的有效成分, 而后经过不同的
工艺去除裂解剂和纯化抗原有效成分制备而成。它
是建立在全病毒灭活疫苗的基础上, 通过选择适当
的裂解剂和裂解条件来进行病毒的裂解 [ 13 ]。
裂解疫苗具有副作用少、可以大规模投入使用,
具有广阔的开发前景,因此具有重要的研究价值。
1968年,香港流感全球大流行, 裂解疫苗开始
大规模使用,我国使用的裂解疫苗较长时间为进口
的。2002年,上海生物制品研究所从日本引进制备
裂解疫苗的技术, 裂解疫苗开始在国内投产上市。
目前, 由北京科兴生物制品有限公司与中国疾病预
防控制中心共同研制的人禽流感裂解病毒疫苗,经
国家食品药品监督管理局批准, 开始进入 2期临床
试验。
1
7 DNA疫苗
DNA疫苗又称为基因疫苗或核酸疫苗。是指
利用 DNA重组技术将病原微生物的保护性抗原基
因克隆到真核表达载体上, 然后将构建好的表达载
体直接导入到动物体内进而使机体产生特异性免疫
反应。
DNA疫苗可提高免疫原性和保护性, 然而该疫
苗的研制和开发才刚刚起步, 还有很多的关键性问
题急待解决。第一,所用载体多带有抗生素基因,导
致被免疫机体可能对相应的抗生素产生抗体, 给一
些常见的细菌性疾病的预防和治疗带来困难。第
二, DNA疫苗体内表达效率不够高, 从而降低了核
酸疫苗的免疫效果。
Gao等 [ 14]研究了编码 A /VN /1203 /2004(H5N1)
的 HA的腺病毒载体 DNA疫苗的免疫作用,结果表
明疫苗成功诱导了 HA特异性抗体和细胞免疫反
应, 并成功地保护小鼠抵抗来自高致病性 H5N 1亚
型禽流感病毒的攻击。何宏轩等 [ 15]、姜永萍等 [ 16]
分别将不同亚型 A IV的 HA基因构建了真核表达质
粒, 并用构建好的质粒对试验鸡进行免疫,进行攻毒
后, 将免疫组和对照组的试验结果进行比较,结果都
表明所构建的 HA基因表达质粒可作为基因疫苗诱
导鸡产生免疫保护反应。
1
8 RNA复制子疫苗
RNA复制子疫苗是指用含有外源基因的 RNA
复制子载体免疫机体使产生特异的免疫反应。RNA
复制子可以不依赖于宿主细胞而自主复制, RNA复
制子载体包含病毒基因组 5∀和 3∀末端的顺式作用
元件、全部非结构蛋白基因编码区 (包括复制酶编
码基因 ), 结构蛋白基因被缺失由外源基因取代。
RNA复制子疫苗复制效率高,用量远远低于常
规 DNA疫苗; 可同时诱导抗体应答和 CTL应答; 安
全性好, RNA复制子在胞浆内复制, 避免了核的参
与, 不存在整合进宿主基因组的可能性; RNA复制
子导致转染细胞的溶解, 避免了有自主复制能力的
病毒的产生;复制子系统能自主复制,可针对多种病
原进行连续免疫,而不受已有载体病毒抗体的干扰。
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1
9 转基因植物疫苗
转基因植物疫苗是指利用植物作为生物反应器
大量表达外源蛋白进而生产可食疫苗。转基因植物
疫苗具有以下优势: 表达产物具有较好的免疫原性
及生物活性;口服植物疫苗能诱导黏膜免疫反应;植
物细胞的细胞壁可以起到生物胶囊的作用, 更好的
刺激机体产生特异性免疫反应; 生产简便、成本低
廉,不需要冷藏和低温运输; 安全性好, 无外源性病
原污染等。
宋长征等利用转基因马铃薯表达 A IV的 HA蛋
白,结果显示, 用转基因马铃薯生产口服 A IV疫苗
具有较好前景。
1
10 具有交叉保护性的通用疫苗
交叉保护性的通用疫苗是指一种能对抗不断改
变的禽流感病毒抗原型、可以提供交叉保护性的通
用疫苗 [ 17]。由于流感病毒的表面抗原易发生突变,
使得疫苗株的组分经常发生变化才能有效的应用于
疫苗的制备, 从而给流感免疫工作带来很大不便。
由此能提供交叉保护性的通用疫苗受到了广泛的
关注。
近年来的研究表明, 流感病毒 A /Ann Arbo r/6/
60的 M 2蛋白通过杆状病毒载体在 sf9细胞中表
达,经动物试验表明表达产物可以保护小鼠受同型
或异型甲型流感病毒的致死攻击。Mozdznaow s
ka
[ 18]等利用 23个氨基酸的 M2e和 Th表位偶联构
建多表位疫苗,免疫小鼠, 4- 5周后加强免疫一次,
然后用异源病毒攻毒, 结果显示疫苗能有效防止病
毒在呼吸道的繁殖, 显示了该多表位疫苗的应用潜
力。A型流感病毒蛋白中较为保守的蛋白为 NP和
M蛋白,这两种蛋白是诱导具交叉保护性 CTL反应
的特定多肽,因此从理论上讲, 研究交叉保护疫苗可
以从这两条途径着手。
1
11 以哺乳动物细胞为基质制备流感疫苗
以哺乳动物细胞为基质制备流感疫苗是指用哺
乳动物细胞代替鸡胚来生产流感疫苗。以哺乳动物
细胞为基质 [ 19, 20 ]制备疫苗具有无外源因子污染、易
于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定等优点。
目前用于制备流感疫苗的哺乳动物细胞主要是 MD
CK细胞和 V ero细胞 (非洲绿猴肾细胞 ) [ 21]。
MDCK细胞是培养和分离流感病毒的最佳哺乳
动物细胞系,此细胞系具有感染后迅速产生流感病
毒、在短时间内取得高滴度的特点。 Fo rt Dodge实
验室已经将 MDCK细胞系应用到马流感疫苗的生
产中,这种流感疫苗生产工艺的转变使生产成本下
降到鸡胚培养工艺的 40%, 而抗原的效力却提高了
3倍,同时消除了外源因子污染的危险。
Vero细胞是WHO规定的可用于生产生物制品
标化的传代细胞系, 可进行发酵罐大规模培养。在
欧洲用 1200 L发酵罐培养 Vero细胞试制的高产流
感疫苗与鸡胚制备的流感疫苗在小鼠动物试验中产
生的免疫原性相近,并在英国等国家的临床试验证
明 Vero细胞试制的流感疫苗有较高的免疫原性, 安
全性好。但是能用于疫苗生产的细胞系很少, 并且
是否具有致癌性等问题制约着利用哺乳细胞生成疫
苗的发展。
1
12 选择宿主范围变异体
人流感病毒株在非人细胞中连续传代或在有血
清抑制剂存在的情况下在鸡胚中传代可产生宿主范
围变异体。已开发出两个供体株 A /PR /8 /34
( H1N1)和 A /Okuda /57( H2N2 ), 在鸡胚中连续传
代后均显示对人毒力减低。它们所产生的重配体在
人体中具有免疫原性且毒力减弱。但是这种重配体
减毒程度变化不定,阻止其用于活疫苗。
1
13 抗独特型抗体
抗独特型疫苗是指以抗独特型抗体作为抗原的
模拟物,代替病原体免疫机体,进而诱导机体产生抗
病原体的特异性免疫反应。该疫苗比天然病毒抗原
免疫诱导的中和抗体水平低, 需辅以适量佐剂才能
发挥良好效果。
自 Jerny[ 22]提出免疫网络学说以来, 对抗独特
型抗体 ( ant iidiotypic ant ibody, Ab2)的研究日益增
多。李宝全 [ 23 ]等首次用纯化的鸡抗 H9亚型 A IV
免疫球蛋白 ( IgG)作为抗原免疫家兔, 制备兔源的
多克隆抗独特型抗体 ( Pab2) , 同时免疫小鼠, 制备
分泌抗 A IV独特型单克隆抗体 (M ab2) ,试验显示所
制备的两种独特型抗体均能竞争性抑制鸡抗 A IV
IgG与 A IV的结合, 并能诱发 SPF鸡产生血凝抑制
抗体。该试验表明,单克隆和多克隆抗独特型抗体
均能对免疫鸡产生保护作用。
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2010年第 8期 胡建和等:禽流感病毒新型疫苗的研究进展
2 小结与展望
随着我国养禽业的迅猛发展以及近几年来禽流
感对人类健康和经济发展带来的危害日益严重,研
制高效、安全、普遍适用的禽流感疫苗迫在眉睫。上
述各种禽流感疫苗各有其优缺点。随着分子生物学
手段的不断更新,将会出现更多更有效的疫苗用于
禽流感的防控。然而,由于禽流感病毒血清型众多、
变异频繁,要研制出一种能够保证禽类能抵抗多种
亚型禽流感病毒攻击的疫苗,需要科研工作者共同
的努力。
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