全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-23
基金项目：兵团博士资金
作者简介：燕清丽（1982-），女，硕士，研究方向：能源工程与农业资源；E-mail：zitong2222@163.com
通讯作者：高剑峰
脂肪酶（E3.1.1.3）是类脂化合物分解、合成和酯交换的催化剂，在有机相中脂肪酶可以完成酯化、交换
及转酯等反应。 具有区域选择性、立体选择性、较高的稳定性，尤其是它的立体选择催化特性，可以完成用
化学法难以进行的消旋化合物的拆分、不对称合成等，使这一古老的酶在有机合成、精细化工、药物中间体
合成以及生物能源等诸多领域有着崭新而广阔的发展前景 [1~3]。
脂肪酶在微生物界的分布很广，几乎所有的微生物都能产生脂肪酶。 芽孢杆菌脂肪酶是细菌中产生的
脂肪酶的之一，具有能耐受较高的温度、较宽的 pH 作用范围和对有机溶剂良好的耐受性等特点，非常适
用于非水相的催化 [4~6]。 鉴于目前对芽孢杆菌脂肪酶研究较少，以及潜在的应用价值和巨大的需求潜力，寻
找新酶种和脂肪酶的扩大应用研究，具有十分现实的意义。 从油污土壤中分离到一株产脂肪酶菌株，经初
步鉴定属于芽孢杆菌，为后续产脂肪酶菌株的菌种改良以及脂肪酶基因工程菌的构建等工作奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土样采集 土壤采集于新疆石河子汇昌粮油公司油库旁、 炼油厂附近、 粮油加工厂和储油库等地
方，共 25 份土样。
1.1.2 主要试剂 橄榄油 （购于上海国药集团 ）， 聚乙烯醇 （聚合度 1750±50 购于上海国药集团 ），
Rhodamine B，维多利亚兰，Tris 碱，6mol/L Na2CO3，1mol/L HCl 等分析试剂。
脂肪酶产生菌的筛选及鉴定研究
燕清丽 周斌 孟晓娜 李振秀 陈芳 高剑峰
（石河子大学生命科学学院，石河子 832003）
摘 要： 为寻找合适的产脂肪酶野生菌，以期能高效的催化合成生物柴油。通过添加橄榄油作为惟一碳源进行富
集培养，然后以透明圈平板筛选法从油污土壤样品中成功地筛选到了一株酶活力值为10.12U/ml产脂肪酶菌株。通过对
该菌株表型、生理生化特征分析及16S rRNA部分序列的系统进化发育分析鉴定该菌为芽胞杆菌属，定名为Bacillus
pumilusB2。
关键词： 脂肪酶 菌株筛选和鉴定 芽胞杆菌属
Study on Screening and Identification of
Lipase Producing Bacteria
Yan Qingli Zhou Bin Meng Xiaona Li Zhenxiu Chen Fang Gao Jianfeng
（College of Life Science Shihezi University，Shihezi 832003）
Abstract： In order to seek appropriate lipase-producing strain which can be able to involve in biodiesel synthesis，
an isolate B2 with high activity of lipase originating from oil-strained soil samples was successfully isolated via direct
plating method and transparent cycle plate assay method. It was identified asBacillus pumilusB2 bas d on both
characteristics and phylogenetic analysis of 16S rRNA.
Key words： Lipase Screening and identifyingBacillus sp
2008年第 6期
1.1.3 培养基 （1）富集培养基组成 （%）：（NH4）2SO4 0.1，NH4NO3 0.1，NaCl 0.1，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO4
0.1。 用 6mol/L Na2CO3 调 pH 为 7.0，再加入 1%橄榄油，蒸馏水 100ml。 121℃蒸汽灭菌 20min。 （2）平板初筛
培养基组成 （% ）： （NH4）2SO4 0.1，NH4NO3 0.1，NaCl 0.1，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO4 0.1， 琼脂 1.2~1.8，用
6mol/L Na2CO3 调 pH 为 7.0，灭菌后再加入橄榄油聚乙烯醇乳化液。 （3）Rhodamine B 显色培养基：在配制好
的初筛培养基中加入 10ml（0.1mg/ml）Rhodamine B 作为指示剂。 （4）维多利亚兰显色培养基：在配制好的初
筛培养基中每 100ml 中加入 0.1g 维多利亚兰，充分振荡使其溶解。 （5）复筛培养基组成（%）：蛋白胨 2.35，
蔗糖 1，K2HPO4 0.1，MgSO4·7H2O 0.05。 用 6mol/L Na2CO3 调 pH 为 6.5，115℃蒸汽灭菌 30min。
1.2 方法
1.2.1 筛选方法 [7~10] （1）富集培养：采集的土样称 5g 溶于 10ml 无菌水中，充分摇匀，静置，取 1ml 上层液
体加入到装有 20ml 富集培养基的三角瓶中，在摇床上 30℃，180r/min，振荡培养 2d，富集 3 次。 （2）初筛培
养 ： 取 1ml 富集菌液加入到 9ml 无菌水中进行倍比稀释 ， 稀释到 10-7。 取 10-2，10-6，10-73 个梯度菌液各
200μl，分别涂布在 Rhodamine B 显色培养基和维多利亚兰显色培养基中。 30℃培养 2~3d。 （3）复筛培养：将
初筛培养后的菌株，在紫外灯波长为 365nm 下观察，将变色圈较大的菌落划线、分离纯化，随后接种到复筛
培养基中，在摇床上 30℃，175r/min，振荡培养 48h。
1.2.2 脂肪酶活力测定 [11~13] 平板扩散法检测酶活 [12]。在已制好的平板培养基上打孔，直径为 3.5mm。随后
将 30μl 发酵液注入孔中，于 30℃恒温培养，定时观察孔周围的变色情况。测定采用经典的聚乙醇橄榄油乳
化液法检测酶活力。酶活力单位定义：40℃，pH 7.2 条件下，以每分钟产生 1μmol 脂肪酸所需的酶量定义为
1 个活力单位（μmol /min·ml）以 U 表示。利用提取到粗脂肪酶催化棉籽油与甲醇发生转酯反应生成脂肪酸
甲酯检测脂肪酶转酯活性，采用薄层层析法对反应物进行分析。在加入少许展层液（石油醚：：乙醚：冰醋酸
85：15：1）的密闭缸中分离样品，展层结束后，晾干，再放入碘缸中进行显色观察。
1.2.3 菌种鉴定 （1）形态学及生理生化鉴定：参考《微生物学实验手册》 [14]、《常用细菌系统鉴定手册》 [15]、
和《伯杰细菌鉴定手册》 [16]对菌株进行形态学观察和生理生化实验。 （2）分子鉴定：细菌总 DNA 的提取参照
方法 [17]。 菌株 16S rRNA PCR 扩增采用引物及 PCR 扩增条件参见方法[18]。 PCR 扩增产物经 0.8%琼脂糖凝
胶电泳后用凝胶成像系统观察并保存，用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收，对纯化的产物进行测序。
用 DNASTA 软件包对 16S rRNA RNA 序列及同源性较高种属的 16S rRNA RNA 序列进行同源性分析 ，
PHYLIP V3.6 软件包进行系统发生分析，以邻位相连法 （neighbor -joining，NJ）构建系统发生树 ，分析采用
1 000 个多序列组。
2 结果与分析
2.1 筛选结果
选择油污地区的土壤，采样共 25 份。在富集培养基
中富集 3 次后，经倍比稀释涂布分离平板，筛到 360 株
可在以橄榄油乳化液为唯一碳源的培养基中生长的菌，
进一步划线分离单菌落后经罗丹明 B 显色培养基培养
筛得 69 株可产生橙色荧光物质的菌株（图 1-A）。 后者
经复筛培养后通过平板扩散法检测到有透明圈产生的
菌株 11 株（图 1-B）。 对 11 株阳性菌进行酶活力检测，
结果见表 1。发现酶活力在 5.0U/ml 以上的有 5 株，其中
B2 株的酶活力值最大为 10.12U/ml，A8、D18 株的酶活
次之分别为 8.32U/ml、7.12U/ml。 选择酶活力最高的菌
株进行生理生化分析及菌种鉴定。
图 1
A:初筛菌在紫外灯波长为 365nm 下产生的荧光圈 ；B:复筛
菌在平板上产生的透明圈 ；C:B2 菌的单菌落形态图 ；D: B2
菌菌体形态图
燕清丽等：脂肪酶产生菌的筛选及鉴定研究 171
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期

 B2 A8 C30 D18 D11 I10 I18 C1 I14 I19 I45
 10.12 8.32 6.71 7.12 5.02 3.21 3.09 2.90 1.09 0.09 -

表 1 脂肪酶活力测定结果
2.2 B2 菌脂肪酶的转酯活性测定
选择叔丁醇作为溶剂，B2 菌脂肪酶催化棉籽油与甲醇发生酯交换反应，反应 24h 后，采用薄层层析检
测，同时选择 NOV435 的酶催化同样的底物做阳性对照（图 2）。 由图 2 可知从 B2 菌株中粗提的脂肪酶具
有的转酯活性。
2.3 菌种的鉴定
2.3.1 B2 菌的形态及生生化特征 此菌在 LB 培养基上生长良好，菌落最初形成表面光滑、凸起、微透明、
粘稠状，培养 24h 后菌体表面出现褶皱、干燥且不透明（图 1-C）。 在显微镜下发现该菌为革兰氏阳性、杆
状、圆端，菌体大小约为（0.5~0.6μm）×（3.5~7.2μm）（图 1-D）。 为初步确定此革兰氏阳性菌的种属，从该菌
的生理生化指标来确定该菌的分类（表 2）。 综合菌落的形态及生理生化特性研究结果，查阅《常用细菌系
统鉴定手册》、和《伯杰细菌鉴定手册》，初步确定该菌为 Bacillus sp.。

 B2
 B2
 +  0.001% +
  + pH5.7 +

+  NaCl (10%) +
 +  +
40 + !" NO #NO +
$%&’() + *+,- +


图 2 薄层层析法检测菌株转酯活性
1:阴性对照 ；2: B2 菌脂肪酶 ；3: 阳性对照 （NOV435）
箭头所指为脂肪酸甲酯
表 2 B2 菌的生理生化特性
2.3.2 B2 菌 16S rRNA 的鉴定 16S rRNA 序列是细菌分子鉴定的重要指标，是细菌分子系统进化研究的
基石。 通过测定菌株 B2 的 16S rRNA 部分序列，并与 GeneBank 中同源种属的 16S rRNA 序列进行比对，结
果见表 3。 并构建了该菌的系统进化树，对该菌进行了鉴定。 暂定为 Bacillus pumilusB2。 Bacillus pumilus.B2
的系统进化树 （图 3）。 由图 3 可见，Bacillus pumilusB2 在系统进化树上与 Bacillus pumilus strain 1RN-3E、
Bacillus pumilus strain F3、 Bacillus sp.TP72 等 9 株芽胞杆菌属的菌株亲缘关系较近，其中和 Bacillus pumilus
101 分在一起，进化关系最近推测为其同源种。
3 讨论
对油污土壤中的菌进行富集培养时发现，用 6mol/L NaOH 调节富集培养基时，富集菌种的 pH 会下降
到 5.0~5.5， 结果导致菌体大量死亡； 而改用 6mol/L Na2CO3 调节 pH 后， 发现菌株生长良好， 这可能与
Na2CO3 在 pH7.0 附近有一定的缓冲能力有关。
制作筛选培养基可选择多种显色指示剂，如维多利亚兰（pH9.5~10.0）、罗丹明 B 及其它酸碱指示剂。
它们以产脂肪酶的菌株能分解油脂生成的脂肪，形成明显的变色圈为筛选依据。在初筛时曾选择维多利亚
兰作为显色剂，但发现大部分的菌无法生长，不利于菌种的初筛。 随后改选罗丹明 B 作为菌株筛选的显色
剂，结果发现筛选效果较好。其原因可能是因为维多利亚兰显色平板碱性太强，不利于菌的生长，导致大部
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2008年第 6期
分产脂肪酶的菌株被淘汰， 而罗丹明 B 中的阳离子会与脂肪酶结合， 在紫外灯下观察产生荧光色的物质
同时罗丹明 B 不受 pH 值的制约，能筛选出更广 pH 值的脂肪酶菌株。
目前测定脂肪酶活力的方法还没有一个标准的方法。一般测定脂肪酶的活力分为 2 部分：定性检测和
定量检测。 定性检测主要方法用浊度测定法，通过酶作用于底物使得显色剂发生变化来衡量活力的大小。
此法对于显色剂有一定的要求，在检测的过程中只能通过视觉来观察变色圈的大小，因此存在一定的局限
性。定量检测常用的方法为酸碱滴定法，但是由于其反应物中含有缓冲液，所以在测定上有一定的偏差。而
且，此方法测定的脂肪酶的活性主要针对于脂肪酶的水解活性。由于本研究基于微生物酶法生产生物柴油
的研究，因此既采用了平板扩散法与滴定法两者相结合得方法来筛选脂肪酶活力高的菌株，又采用了转酯
反应来检测脂肪酶的转酯活性。 研究中筛选到的菌株 B2 能够催化棉籽油与甲醇发生转酯反应，说明该菌
种的脂肪酶具有一定的转酯活性。 在检测过程中发现，利用平板法筛选出来具有变色圈的菌 11 株与利用
滴定法检测酶活结果一致，变色圈越大，检测到的酶活越高。
芽胞杆菌脂肪酶是目前研究热点之一的工业用脂肪酶。 从油污土壤中分离出具有高活力的产脂肪酶
野生菌一株，通过 16S rRNA 序列进行系统进化分析将该菌株定名为 Bacillus pumilus B2。 16S rRNA 序列是
细菌分类的重要指标，也是对细菌快速鉴定的有效方法。 根据 16S rRNA 序列同源性分析法鉴定菌株的种
属原则，所鉴定菌株与标准菌株的同源性达到 95%以上者可认定为同属菌株。 菌株 B2 与短小芽胞杆菌的
16S rRNA 序列同源性为 99%。 因此，可认定所分离的菌株为芽胞杆菌属，并定名为 Bacillus pumilus B2。 在
后续的优化条件下发现分离菌株的酶活提高到 20.33U/ml （资料未发）， 表明该菌株在具有脂肪酶生产能
力，同时说明该菌株在优化条件后其酶活大增，具有较大的开发潜力。因此，油污土壤中产脂肪酶菌株鉴定


%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 Bacillaceae bacterium BL-87 * 99.8 98.8 98.5 99 98.3 99 98.4 98.8 99.2
2 Bacillus pumilus1RN3E * 98.9 99.7 99.6 99.6 99.7 99.4 99.8 99.5
3 Bacillus pumilus strain F3 * 98.8 99.7 99.4 99.7 99.5 99.6 98.8
4 Bacillus sp. Z14 * 98.3 99.6 98.6 99.1 99.1 98.8
5 Bacillus sp. YIM C730 * 98.9 99.7 98.7 98.8 98.7
6 Bacillus sp. TP72 * 98.4 99.5 99.8 99.4
7 Bacillus sp. MH07 * 98.8 99 99.5
8 Bacillus pumilus strain JH3 * 99.5 98.8
9 Bacillus pumilus101 * 99.4
10 Bacillus pumilus B2 *
表 3 菌株同属间 16SrRNA 同源性比较 (%)



图 3 B2 菌 16S rRNA 的 PCR 电泳检测图
图 4 基于 16S rRNA 的部分序列以 NJ 法构建
的系统进化树，显示大于 60%的自展值
燕清丽等：脂肪酶产生菌的筛选及鉴定研究 173
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
（上接第 169页）
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

(h) A (µg/ml) B(µg/ml)
0 143.7 126.7
24 276.3 230.1
48 286.8 269.5
72 321.3 300.1
96 398.1 347.6
120 552.3 515.7
144 502.8 473.4

表 1 不同时间内不同酵母转化子总蛋白的表达量导表达水平成正相关（表 1）。
3 讨论
外源基因在毕赤酵母中表达的一个关键环节是
高表达菌株的筛选。 在免疫筛选法的基础上进行部
分改进，建立了基于免疫印迹的原位双膜筛选法。 通
过将固体培养基上的转化子转移到醋酸纤维素薄膜
上， 再用硝酸纤维素薄膜原位捕获分泌在醋酸纤维
素薄膜上的蛋白， 然后用免疫印迹的方法原位筛选
转化子分泌的蛋白，根据显色程度可以直观地反映转化子菌落表达蛋白的能力。
以重组人内皮抑素为例开展了原位双膜法筛选高表达转化子的探索，试验结果显示：免疫印迹显色强
的转化子菌落其表达量相对较高，初步验证了此筛选方法是可行的。
应用原位双膜法可以实现酵母转化子的高通量筛选，根据免疫印迹显色的强弱可以非常直观、快捷地
筛选出高表达转化子菌落，对于其它类型的酵母高表达转化子的筛选工作也具有一定的借鉴意义。
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