全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
利用不同方法从深加工牦牛肉产品中
提取基因组 DNA效果的比较
何建文 1, 3 韩建林 2, 3 罗玉柱 1
( 1甘肃农业大学动物科学与技术学院,兰州 730070;
2中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室,北京 100193;
3中国农业科学院国际家畜研究所畜禽牧草遗传资源联合实验室中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193)
摘 要: 为了从深加工牦牛肉产品中获得片段较大、数量较多的基因组 DNA, 以用于分子追溯的检测,尝试并系统地比较
了异硫氰酸胍法、酚 -氯仿抽提法和试剂盒提取法的提取效果。通过定量分析、凝胶电泳和 PCR片段大小梯度扩增等手段, 对
利用 3种方法提取的基因组 DNA的数量和质量进行了比较。结果显示,利用酚 -氯仿抽提法提取的基因组 DNA质量不佳, 异
硫氰酸胍法和试剂盒提取法的提取效果相当, PCR可以扩增出 730 bp左右的核外基因细胞色素 b,而核内基因只能扩增出 300
bp左右的核基因 DNA片段 (内乳铁蛋白基因, 271 bp; BoLADRB3基因, 302 bp)。综合考虑提取时间、费用、数量和质量等各方
面的因素,认为异硫氰酸胍法操作简便、快速、廉价、有效,是较好的从动物深加工肉产品中提取基因组 DNA的方法。
关键词: 异硫氰酸胍法 酚 -氯仿抽提法 试剂盒方法 深加工牦牛肉产品 基因组 DNA
Comparison ofQuantity and Quality of Genom ic DNAs Extracted from
H ighly Processed YakM eat ProductsUsing DifferentM ethods
H e Jianw en
1, 3 H an J ianlin2, 3 LuoYuzhu1
(
1
College of A nimal Science and T echno logy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;
2
K ey Laboratory of Farm Animal Genetic Resources and Utilization of M inistry of Agr iculture,
Institute of A nimal Science, Chinese A cademy of Agriculture Science, B eijing 100193;
3
CAASILRI Joint Laboratory on Livestock and Forage Genetic Resources, Institute of Animal Science,
Chinese A cademy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)
Abstrac:t To recover suffic ient am oun t of large fragm en ts of the genom ic DNAs from h igh ly processed yak m eat products for the ir
mo lecular traceab ility tests, this study exp lored three extraction protoco ls of phenolchlo ro fo rm extraction, guan id ine th iocyanate m ethod
and commerc ia lDNA extraction k it, sepa rate ly. The quality and quan tity of the ex tracted DNAswere assessed using threem ethods o f quanti
tative analysis through spectrophotome ter, argarose gel electrophoresis and PCR amplifications fo r different sizes ofm tDNA and nuc lear genom
ic gene fragm ents. The resu lts showed that theDNAs ex tracted using bo th the guanidine thiocyanatemethod and DNA ex traction kit have bet
ter quality and quantity that enabled the PCR amplifica tions of both 730 bp fragment of Cyt b gene from them tDNA and 300 bp nuclear DNA
fragm ents ( 271 bp o f lactoferrin gene; 302 bp of BoLADRB3 gene). H ow ever, the DNAs recovered follow ing the pheno lchloro form method
failed comp lete ly in the amp lifications. In consideration o f all the factors inc lud ing tmi e and cost requ ired for and also quantity and quality o f
the DNAs recovered from different ex traction pro toco ls, we suggest that guanidine th iocyanatem ethod is a smi ple, rapid, cheap and suffic ient
pro tocol that can be used for routineDNA ex traction from the h igh ly processed yak meat products for their furthermo lecular traceab ility tests.
收稿日期: 20100320
基金项目: 十一五 !国家科技支撑计划项目 ( 2007BAD52B05) , CAASILR I联合研究项目 ( 2008C I03 )
作者简介:何建文,男,硕士研究生,研究方向:分子遗传学; Em ai:l H ejw in515@ 163. com
通讯作者:韩建林,男,教授,博士生导师,研究方向:动物遗传资源的评定、保护及利用; Em a i:l han j@l iascaas. net. cn
Key words: Guan id ine thiocyanate m ethod Pheno lch loroform ex traction Comm ercia l DNA ex traction k it H ighly processed
yak m eat product Genom ic DNA
2010年第 10期 何建文等 :利用不同方法从深加工牦牛肉产品中提取基因组 DNA效果的比较
随着分子生物学的发展,在 DNA水平上对动物
及其产品进行分子追溯 [ 1]、物种鉴别 [ 2]、个体识
别 [ 3]和动物源性检测 [ 4]等,已经成为一个备受关注
的问题。但对于深度加工的动物产品,如肉干、肉骨
粉和营养品等的检测来说, 其中存在的一个严重问
题就是在深加工过程中基因组 DNA的降解,从而导
致检测的不稳定性, 造成资源和时间的浪费 [ 5 ]。不
同的方法对深加工肉产品的提取效果有所不同,邵
碧英等 [ 6, 7]采用异硫氰酸胍法从牛羊肉、猪肉干、鱼
粉、牛奶粉以及牛油中提取到检测所需的线粒体基
因片段; S lan等 [ 8] 将牛肉在水浴锅中经煮沸处理
后,采用试剂盒法提取的基因组 DNA进行 PCR,扩
增出了 150 bp左右的核基因 DNA 片段; Pascoal
等 [ 9]采用试剂盒法从各种牛肉罐头和熏牛肉中提取
的基因组 DNA进行 PCR, 检测到了 174 bp的 Cyt b
基因片段; A lslan等 [ 10 ]将牛肉组织经热加工处理
后,采用酚 -氯仿抽提法提取的基因组 DNA进行
PCR, 检测到 271 bp的线粒体基因片段。牦牛肉干
的加工需要通过预煮 ( 100∀ , 30m in)、复煮 ( 100∀ ,
1h)、炒制 ( 120∀ , 30 m in )和烘干 ( 70∀ , 20 h)等复
杂过程 [ 11- 13] ,必定会使基因组 DNA遭受更为严重
的损伤。另外,由于牦牛与普通黄牛和瘤牛可进行
杂交繁育,在牦牛肉及其产品的鉴别中,只有提取到
片段较大、质量较好的 DNA,通过对核内、外基因的
同步分析才能鉴别出真正的牦牛源性成分, 进一步
与犏牛、黄牛和瘤牛、甚至是携带黄牛线粒体基因的
高代杂种牛加以区分 [ 14 ]。因此, 利用 3种方法对从
深度加工的牦牛肉产品获得基因组 DNA的效果进
行了分析比较,旨在探求一种比较适合于深度加工
肉产品基因组 DNA提取的方法, 以期获得稳定、高
质量的 DNA, 为产品的进一步检测带来方便和
快捷。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
1. 1. 1样品 从不同超市购买的 25袋来自 6个厂
家的牦牛肉干产品 (表 1), 从屠宰场采取到 5个牦
牛新鲜肌肉组织样品作为对照。
表 1 不同厂家的深加工牦牛肉干产品
样品名称 数量 (袋 ) 生产厂家 厂家地址
可可西里牦牛肉干 5 青海可可西里肉食品有限公司 青海省海南藏族自治县
唐古拉牦牛肉干 5 青海开心源食品有限公司 青海西宁市
西北骄牦牛肉干 2 青海西宁福青天然营养食品有限公司 青海西宁
遛洋狗手撕牦牛肉 5 成都遛洋狗食品有限公司 四川成都市
白牦牛肉干 5 甘肃天润白牦牛绿色食品开发有限公司 甘肃天祝
沙爹牦牛肉干 3 西藏喜马拉雅食品有限公司 西藏拉萨
1. 1. 2 试剂 异硫氰酸胍、T ritonX 100、蛋白酶 K
( 20mg /mL)、酚#氯仿 #异戊醇 (体积比 25#24#1)、
氯仿#异戊醇 (体积比 24#1)、异丙醇、无水乙醇、
75%乙醇、TE ( pH 8. 0)、SDS溶液 ( 10% )。
1. 1. 3 主要仪器与设备 9700型 PCR扩增仪 (美
国 AB I公司 ) ; 3K18型高速冷冻离心机 (德国 S igma
公司 ); ND1000型紫外分光光度仪 (美国 NanoDrop
公司 ); DYY8C型高压电泳仪 (北京六一仪器厂 ) ;
B INTA 2020D凝胶成像紫外分析仪 (北京 B inTa公
司 ) ; Casada LS水纯化系统 (美国 Pall L ife Sc ience
公司 )。
1. 2 DNA提取方法
从每袋牦牛产品中抽取一份样品, 先用蒸馏水
冲洗,然后在 10∀ 的蒸馏水中浸泡过夜, 以便除去
残留在肉产品上的盐分、调料和油类等杂质,减少对
提取效果的影响;尽量从肉样内层取样,减少肉样的
污染。每一样品分别取 3份、每份各取 100 mg, 分
别采用异硫氰酸胍法 [ 6]、酚 -氯仿抽提法 [ 15]和试剂
盒提取法从牦牛肉干和卤制牛肉产品中提取基因组
DNA。组织基因组 DNA提取试剂盒由北京博迈德
科技发展有限公司生产, 试验方法参照使用手册
进行。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
1. 3 紫外分光光度计检测
对采用上述 3种方法抽提所得的 DNA,用紫外分
光光度仪测定 DNA浓度和 DNA的纯度。为避免操作
误差,所有方法均平行操作 2次。DNA含量的计算公
式: DNA的含量 (g /L) = 50 ∃OD260 ∃稀释倍数来计
算,根据 OD260 /OD280来估计 DNA的纯度 [ 16]。
1. 4 凝胶电泳检测
分别取上述 3种方法提取的 DNA样本各 4 L,
加上样缓冲液 1 L,在 2. 0%琼脂糖凝胶中以 120 V
电压条件电泳 0. 5 h。在紫外灯下观察结果,用凝胶
成像分析系统拍摄成像。
1. 5 PCR检测
以 3种方法提取的基因组 DNA为模板, 参考
H assanin等 [ 17]提交的牦牛线粒体基因组 (m tDNA)细
胞色素 b ( Cytochrome b, Cyt b)基因 ( GenBank登录
号: AF091631)和裴杰等 [ 18]提交的牦牛乳铁蛋白
( Lacto ferrin, LF)基因 ( GenBank登录号: EU547255)
各设计 3对引物 (表 2),建立不同长度的 PCR产物扩
增梯度,检测不同提取方法从深加工牦牛肉产品中所
能得到的核内、外基因的片段大小和提取效果。为了
更进一步检验深加工肉产品核基因组 DNA的降解程
度,再进一步参考李齐发等 [ 19]报道的牦牛 DRB3基
因 (GenBank登录号: AY847739)和 Carg ill等 [ 20]报道
的牛 TLR3基因 (GenBank登录号: EF076749)的两对
引物分别进行 PCR检测。
表 2 Cytb基因、LF基因的、DRB3基因和 TLR3基因的不同扩增片段引物序列及退火温度
区域 引物 引物序列 引物位置* 片段长度 ( bp) 退火温度 ( ∀ )
核外基因
CytbF1 GAATGGATTTGAGGTGGGTT 484- 503
CytbR1 TGGATTGTTGGAGCCTGTTT 605- 624
CytbF2 TACCATGAGGACAAATATCATTCTG 398- 432
CytbR2 CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG 845- 869
CytbF3 CGATACATACACGCAAACGG 238- 257
CytbR3 GCTGAGTGGTCGGAAGATTA 962- 981
141 51∀
472 53∀
729 53∀
核内基因
LFF1 GATGGCAGTGGAGGATGA 242- 257
LFR1 TGTTTCCCTACAGATGGTTT 496- 513
LFF2 GATGGCAGTGGAGGATGAAG 242- 261
LFR2 GGTGGGTTAGTCACTCAGTCG 752- 772
LFF3 CCAGCATGGAGTGGTCAT 1- 18
LFR3 TGGTGGTGGTGGGTTAGT 761- 778
DRB3F ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC 1- 24
DRB3R TTTAAATTCGCGCTCACCTCGCCGCT 287- 302
TLR3F TTCCGAGCCTGGTCATTCT 8 838- 8 861
TLR3R CTTTGCAGGGTGATACATCG 2 391- 9 416
271 55∀
530 60∀
778 58∀
302 65∀
579 57∀
* 分别以 AF091631、EU547255、AY847739和 EF076749为参考序列来确定引物的位置
2 结果与分析
2. 1 定量分析结果
3种方法提取基因组 DNA其样本量、耗时、
OD260 /OD280、DNA含量和 DNA溶液体积的比较结果
见表 3。综合各方面的因素,异硫氰酸胍法所提取的
DNA含量最多,操作时间较短,但所提取的 DNA的纯
度不是太高。酚 -氯仿抽提法所提取的 DNA的纯度
和含量适中,蛋白含量较低,但其缺点是试验的时间
较长。试剂盒提取法所提取的 DNA的时间少、纯度
高,但 DNA含量太低、价格相对较高。
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2010年第 10期 何建文等 :利用不同方法从深加工牦牛肉产品中提取基因组 DNA效果的比较
表 3 三种方法提取基因组 DNA的比较
方法 总样本量 样品类型 数目 耗时 ( h ) OD260 /OD 280 DNA含量 (g /L) DNA溶液体积 ( L )
异硫氰酸胍法 25
块状 11
酱卤 4
颗粒 10
3 2. 042 % 0. 164 421. 5 % 434. 8 100
酚 -氯仿抽提法 25
块状 11
酱卤 4
颗粒 10
16 1. 993 % 0. 076 191. 28 % 84. 63 100
试剂盒提取法 25
块状 11
酱卤 4
颗粒 10
3 1. 734 % 0. 128 31. 10 % 19. 84 100
通过考察 3种方法所得 DNA在纯度和得率上
的差异, 统计分析时以 OD260 /OD 280衡量各方法的
DNA纯度差异, 并用从 100 mg样品中可提取到的
DNA量来衡量各方法的 DNA得率差异。通过 SPSS
软件进行数据处理, 分别采用 2种方法间的配对 t
检验, 对 3种抽提方法所得 DNA的纯度和得率差异
进行统计分析,结果表明异硫氰酸胍法在提取基因
组 DNA纯度上与酚 -氯仿抽提法比较表明差异不
显著 (P = 0. 174> 0. 05) ,但与试剂盒提取法的差异
达到极显著水平 (P < 0. 001), 酚 -氯仿抽提法与试
剂盒提取法之间也存在极显著差异 (P < 0. 001) ,采
用异硫氰酸胍法所获得的基因组 DNA极差异的多
于酚 -氯仿抽提法和试剂盒提取法 (P < 0. 001) ,但
酚 -氯仿抽提法与试剂盒提取法之间没有明显差异
(P = 0. 282> 0. 05)。
2. 2 凝胶电泳结果
采用 3种提取方法从 5份皮肤组织所获得的总
基因组 DNA呈一条整齐的亮带, 无降解; 而从深加
工牦牛肉产品得到的总基因组 DNA呈现一条长长
的拖带,降解较为明显。
2. 3 PCR检测的结果
从 3种提取方法所获得的总基因组 DNA中均
可扩增出 141 bp左右的 Cy t b基因片段 (图 1A ),
条带清晰而致密,可用于进一步的分析; 但从图 1B
可以看出,用异硫氰酸胍法和试剂盒提取法提取的
总基因组 DNA也扩增出 472 bp左右的片段, 但从
用酚 -氯仿抽提法获得的总 DNA中仅扩增出条带
比较暗淡的产物;从图 1C可以看出,用异硫氰酸胍
法和试剂盒提取法所获得的总基因组 DNA中仍能
得到片段大小达 730 bp左右的清晰条带,而从用酚
-氯仿抽提法获得的总基因组 DNA中仅扩增出一
条弱的条带。就核内 LF基因而言, 仅从采用异硫
氰酸胍法和试剂盒提取法所获得的总基因组 DNA
中得到了 271 bp左右的 LF基因的片段, 而利用酚
-氯仿抽提法得到的总基因组 DNA则未能显示任
何扩增产物 (图 1D ); 图 1E和图 1F也均显示利
用这 3种提取方法均不能实现片段大小在 530 bp
以上的 PCR扩增。
为了更进一步检验深加工牦牛肉产品核基因的
降解程度, 用两个扩增不同片段长度的引物进行
PCR检测, 通过不同基因检测发现, BoLADRB3基
因可以检测到 302 bp的清晰条带 (图 1G);当把基
因片段进一步递增到 500 bp以上时, TYL3基因也
未检测到 579 bp的目的片段。从而说明牦牛深加
工产品由于在加工过程中受外界因素的影响, 使总
基因组 DNA严重降解,其中核内基因比核外基因受
损更严重, 核内基因只能扩增出 300 bp左右的
片段。
3 讨论
从动物深加工产品中提取总基因组 DNA的目
的是开展遗传标记的分型检测,达到分子追溯、同源
性分析、物种鉴定、个体识别或亲权关系鉴定等目
的。DNA分型成败的关键取决于 DNA样品质量的
好坏,不同的检测技术对 DNA质量的要求也略有不
同。从总体上讲, DNA要尽可能纯化, 否则会干扰
反应,降低检测的灵敏度和可重复性 [ 7]。根据定量
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
1, 2.牦牛鲜肉 DNA(对照 ); 3, 4.试剂盒提取法; 5, 6.异硫氰酸胍法; 7, 8 .酚 -氯仿抽提法
图 1 不同方法提取基因组 DNA的 PCR扩增结果
分析可以初步判断 DNA的浓度和纯度, 只有根据
PCR的扩增结果才能确定是否提取到片段较大的
DNA,以及 DNA样品中是否存在可抑制 PCR反应
的其它成分,从而避免用 PCR方法检测其他成分时
出现假阴性结果 [ 7, 21 ]。
H ird等 [ 22]将肉样先煮沸 30m in再煎烤 ( 180∀ )
30 m in后提取的基因组 DNA进行 PCR, 能检测到
351 bp的 Cyt b基因片段; M atsunaga等 [ 23]将牛肉和
马肉在 120∀ 处理 30m in后提取的基因组 DNA进行
PCR检测,在牛肉样品中得到了 274 bp的 Cy t b的基
因片段,而在马肉中却未能得到 439 bp的 Cy t b基因
片段;胡强等 [ 24]采用 Cy t b基因对牛肉干和卤制肉干
提取的基因组 DNA进行 PCR检测,能得到 472 bp的
目的片段,但从油炸型肉干中未提取到质量合格的
DNA;陈冬等 [ 25]将牛肉在 100∀ 、120∀ 、140∀ 、160∀
和 180∀ 的温度下处理 30 m in后提取的基因组 DNA
进行 PCR,能检测到 453 bp(普通牛 452 bp)的线粒体
基因组 12S rRNA基因片段,但是条带从 120∀ 开始变
淡。以上文献大部分都对深加工肉产品的核外基因
扩增效果做了探讨,而对核基因的扩增效果没有做更
进一步的研究。
通过定量分析、凝胶电泳和 PCR片段大小梯度
扩增手段对 3种方法的提取 DNA效果进行比较,其
主要目的是在 DNA受损严重的深加工肉产品中,能
够提取到片段较大、质量较好的基因组 DNA。通过 3
种方法的比较,酚 -氯仿抽提法所提取 DNA的纯度、
DNA含量适中,但试验周期过长,从 PCR扩增效果来
看,得不到大片段的 DNA, 不易用于深加工肉类产品
基因组 DNA的提取。虽然试剂盒提取法操作简便、
省时可以得到预期的效果,但所得 DNA量少,价格比
较昂贵; 异硫氰酸胍法操作简便、省时、所得基因组
DNA量大、价格便宜,同样能够达到试剂盒提取基因
组 DNA的效果。在动物深加工产品提取的基因组
DNA中,从核内外基因不同片段 PCR扩增效果来看,
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2010年第 10期 何建文等 :利用不同方法从深加工牦牛肉产品中提取基因组 DNA效果的比较
核内基因的降解比核外基因更严重,核外基因可以扩
增到 730 bp左右的大片段, 而核内基因不易扩增到
大片段基因,从核内基因的 PCR扩增程度来看,核基
因组 DNA可以扩增到 300 bp左右的基因片段。但从
总体扩增的基因片段大小来看, 300 bp左右的基因片
段足以对深加工肉产品进行检测分析。因此,通过定
量分析、凝胶电泳和 PCR片段大小梯度扩增等手段
对利用这 3种方法提取的基因组 DNA的数量和质量
进行了比较,综合各方面因素考虑, 异硫氰酸胍法简
便、快速、廉价、有效, 为较好从深加工肉产品中提取
基因组 DNA的方法。
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