全 文 ：文章编号:1673-2995(2009)01-0001-03 ·论　著 ·
笃斯越桔果实总 DNA提取方法的比较研究
王　程 ,罗　军 ,田志杰 ,姜艳霞 ,李　妍 ,许　娜 ,芦晓晶 ,吕士杰　(吉林医药学院生物化学教研室 ,吉林 吉林
132013)
摘　要:目的　探讨越桔果汁总 DNA的最佳提取方法 。方法　分别采用 SDS法 、高盐低 pH值法 、CTAB法 、
异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组 DNA,并对其进行核酸含量测定和电泳及 RAPD-PCR检测。结果　SDS
法 、高盐低 pH值法 、CTAB法 、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组 DNA其 OD260 /OD280分别为 1.944、1.738、
1.661、1.813,其浓度分别为 2.363μg/μl、0.548 μg/μl、0.735 μg/μl、1.455 μg/μl;电泳检测显示异硫氰酸胍
法提取 DNA条带最清晰 ,扩增产物最多。结论　用异硫氰酸胍法提取越桔果汁总 DNA优于其它方法 。
关　键　词:越桔;DNA提取;SDS法;高盐低 pH值法;CTAB法;异硫氰酸胍法
中图分类号:Q781　　　文献标识码:A
ComparativestudyonextractingDNAfromblueberry
WANGCheng, LUOJun, TIANZhi-jie, JIANGYan-xia, LIYan, XUNa, LUXiao-jing, Lǜ Shi-jie　(Departmentof
Biochemistry, JilinMedicalColege, JilinCity, JilinProvince, 132013, China)
Abstract:Objective　ToacquireaneficientmethodofextractingDNAfromprocessedblueberyjuice.Methods　
DNAwasextractedbySDS, HighsaltylowpHvaluebufer, CTABandGuanidiniumthiocyanaterespectively, thequal-
ityandquantityofextractedDNAwereanalysedbyspectrophotometer, electrophoreticandRAPD-PCR.Results　
OD260 /OD280 ofblueberyjuicegenomeDNArespectivelyextractedbySDS, HighsaltypHvaluebufer, CTABand
Guanidiniumthiocyanateextractionwas1.944 , 1.738, 1.661, 1.813, thedensitywas2.363 μg/μl, 0.548 μg/μl,
0.735 μg/μl, 1.455 μg/μl.Conclusion　Guanidiniumthiocyanatewasbeterthanaltheothermethods.
Keywords:blueberry;DNAextraction;SDS;HighsaltylowpHvaluebufer;CTAB;guanidiniumthiocyanate
　　笃斯越桔 (VacciniumuliginosumL.)又名蓝莓
(bluebery)、地果 、甸果 、都柿等 ,隶属杜鹃花科越桔
属 ,为亚灌木野生植物。越桔属全世界共有 400多
种 ,中国约有 90余种 [ 1] ,主要集中在东北 、内蒙古 、新
疆等地区 ,吉林省长白山地区野生笃斯越桔分布极
广 ,产量大 ,资源丰富 。当前 ,对笃斯越桔研究主要热
点集中在治疗腹泻 、痢疾 、口腔炎症 、眼科疾病 、血管
障碍和糖尿病并发症等。本研究对野生和人工栽培
的笃斯越桔分别采用异硫氰酸胍法 、CTAB法 、SDS
法和高盐低 pH法提取果实总 DNA进行比较 ,以建
立适宜笃斯越桔果实总 DNA的提取方法 ,并为笃斯
越桔的基因多态性比较奠定基础。
基金项目:吉林省教育厅 “十一五 ”科学技术研究基金项目(吉教科
合字 2006126号).
作者简介:王　程(1979-),男(汉族),助教 ,硕士.
1　材料与方法
1.1　样　品
　　均为低温冷冻品野生笃斯越桔 ,采自吉林省安图
县 ,由吉林医药学院药学院雷钧涛副教授鉴定。
1.2　仪器与试剂
　　PTC-240VAC型 PCR仪(美国 MJR公司), 3K30
型低温高速离心机(美国 sigma公司), EC250-90型
电泳仪(美国 EC-Apparatas公司), DDY-II-34A型电
泳槽(北京六一公司), 756MC型紫外分光光度计(上
海第三分析仪器厂)等 。
十二烷基磺酸钠(SDS)提取缓冲液:100 mmol/L
Tris-HCl(pH 8.0), 50 mmol/LEDTA, 20%SDS,
500 mmol/LNaCl, 10%体积比 β-巯基乙醇(β-ME);
十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)提取缓冲液:
100 mmol/LTris-HCl(pH8.0), 10 mmol/L乙二胺四
—1—第 30卷　第 1期2009年 02月 　　吉　林　医　药　学　院　学　报Journal　of　Jilin　Medical　Colege　　Vol.30　No.1Feb.2009 　　
乙酸(EDTA), 1.4mol/LNaCl, 3%CTAB, 1%聚乙烯
基吡咯烷酮(PVP);
高盐低 pH值提取缓冲液:100mmol/LNaAc(pH
4.8), 50 mmol/LEDTA, 1%SDS, 500 mmol/LNaCl,
10%体积比 β -ME;
异硫氰酸胍提取缓冲液:5 mol/L异硫氰酸胍 ,
4 mol/LNaClO4(pH5.2)。
RAPD引物 、dNTPs、Taq酶 、RNaseA、Marker均
购于北京鼎国生物技术服务有限公司;试剂均为国产
分析纯 。
1.3　DNA提取的方法
　　SDS法按参照文献 [ 2-3]略加改进如下 ,取约 3 g
果实加 2 mol/LNaCl10 ml均浆至所有细胞破裂 ,取
300μl果汁样品放入 1.5mlEp管内 ,加 SDS提取缓
冲液 800 μl,匀浆成糊状 , 65℃水浴 20min,取出降至
室温后加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),上下轻缓
混合 , 12 000 r/min离心 10 min,小心取出上清液 。
转移入一新的 1.5 mlEp中 ,加入 40 μlRNaseA
(100pg/ml),再加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),
上下轻缓混合 ,室温放置 20 min, 12 000 r/min离心
10 min,将上清液转移入另一新的 1.5 mlEp中 。加
入 1 /10体积 3 mol/LNaAc和 2倍体积无水乙醇(两
者均提前放置于 -20℃下 10 min以上),充分混匀 ,
-20℃放置 15min, 12 000r/min离心 10min,弃上清
液 。加入 1ml70%乙醇洗涤沉淀 , 12 000r/min离心
5 min,弃上清液 ,重复洗涤 3次 ,将沉淀在超净工作
台上吹干 ,加入 50 μl灭菌双蒸水溶解沉淀 ,轻缓混
匀 , -4℃保存待用。
高盐低 pH值法除将 SDS提取缓冲液用高盐低
pH值提取缓冲液代替外 ,其余均按 SDS法操作。
CTAB法除将 SDS提取缓冲液用 CTAB提取缓
冲液代替外 ,其余均按 SDS法操作 。
异硫氰酸胍法除将 SDS提取缓冲液用异硫氰酸
胍提取缓冲液代替外 ,其余均按 SDS法操作 。
1.4　DNA样品的检测
1.4.1　琼脂糖凝胶电泳检测
取 5 μlDNA样品 ,加入3 μl灭菌双蒸水 ,再加入
2 μl样品缓冲液 ,混匀后加入点样孔。在 1.5%琼脂
糖(溴化乙锭染色)凝胶上电泳。
1.4.2　紫外消光值检测
将提取得到的 DNA样品每份吸取 10μl,用双蒸
水稀释至 1.5ml分别标记 。用双蒸水作空白对照校
0点 ,然后取各样品 DNA稀释液 1.5 ml在紫外分光
光度计上测定 ,分别测 OD230 、OD260 、OD280值。核酸浓
度按如下公式计算:DNA样品的浓度 (μg/μl)=
OD260 ×核酸稀释倍数(150倍)×50 /1000;核酸纯度
的估计:纯 DNA样品 OD260 /OD280紫外消光值应为
1.8 ,如果 OD260 /OD280值大于 1.9,表明有 RNA污染 ,
小于 1.6,表明样品中存在蛋白质或酚污染。 OD260 /
OD230值应大于 2.0,如果 OD260 /OD230值小于 2.0 ,表
明溶液中有残存盐和小分子杂质 ,如核甘酸 、氨基酸 、
酚等。
1.4.3　RAPD-PCR检测
以随机引物 F05,序列为:5′-CCGAATTCCC-3′,
进行 RAPD-PCR反应。反应体系 25 μl。反应程序:
94℃预变性 4 min;94℃ 40 s, 37℃ 45 s。 72℃ 80 s,
42个循环;72℃, 8min。扩增产物用 1.5%琼脂糖凝
胶(溴化乙锭染色)电泳 。
2　结　果
2.1　琼脂糖凝胶电泳检测结果
　　电泳结果见图 1。图 1的序号 1 ～ 4分别对应
SDS法 、高盐低 pH值法 、CTAB法 、异硫氰酸胍法提
取越桔果汁的基因组 DNA, M为 Marker。从结果来
看 ,四种方法均可看到有明显的 DNA条带 , 1、2条带
较宽 ,可能有 DNA断裂现象 , 3、4号条带较整齐 ,基
因组 DNA较完整。
图 1　越桔果汁总基因组 DNA电泳图　　
2.2　紫外消光值检测结果
　　分别用紫外分光度计检测结果如表 1所示 。由
表 1可见 ,四种方法 OD260 /OD280 >1.6,均没有较多
的蛋白质合分类污染。 SDS法所得的总 DNA的浓度
较大 ,为 2.363 μg/μl,但 OD260 /OD280 >1.9, OD260 /
OD230 <2.0,说明有较多的 RNA和残存盐和小分子
杂质;高盐低 pH值法所得的总 DNA中含 RNA较少 ,
但有残存盐和小分子杂质 , 并且浓度较低 , 只有
0.548μg/μl;CTAB法和异硫氰酸胍法所得的总
—2— 吉林医药学院学报　2009年 02月　第 30卷
DNA中含 RNA、残存盐和小分子杂质都较少 ,更适合
扩增实验。异硫氰酸胍法所得的总 DNA浓度较
CTAB法大 ,为 1.455 μg/μl。
表 1　紫外分光光度法检测各种抽提方法提取越桔果汁总 DNA比较
测定方法 OD230 OD260 OD280 核酸纯度OD260 /OD280 OD260 /OD230 DNA浓度值(μg/μl)
SDS法 0.172 0.315 0.162 1.944 1.831 2.363
高盐低 pH值法 0.039 0.073 0.042 1.738 1.872 0.548
CTAB法 0.038 0.098 0.059 1.661 2.579 0.735
异硫氰酸胍法 0.085 0.194 0.107 1.813 2.282 1.455
2.3　RAPD-PCR检测结果
　　电泳结果见图 2。图 2的序号 1 ～ 4分别对应
SDS法 、高盐低 pH值法 、CTAB法 、异硫氰酸胍法提
取越桔果汁的基因组 DNA扩增后的产物 , M为 Mark-
er。从结果来看 ,四种方法均可看到有 2条 DNA扩增
条带 ,分别约为 1 800 bp和 1 400 bp,说明这四种方
法均适合 RAPD-PCR扩增。
图 2　越桔果汁 DNA扩增后的产物电泳图　
3　讨　论
　　目前 ,植物组织中 DNA主要在叶片中进行提取 ,
徐娜等 [ 4]已确立了从越桔叶片中提取 DNA的快速方
法 ,但在果汁中尤其在浆果果汁中提取 DNA鲜见报
道 ,沈夏艳等 [ 5]在苹果汁提取 DNA,取得了较好的效
果 。DNA的提取和纯化是进行 RAPD扩增的首要步
骤 , DNA质量的好坏直接关系到实验的成败 。本实
验分别采用 SDS法 、高盐低 pH值法 、CTAB法 、异硫
氰酸胍法提取果汁样品总 DNA, SDS法所得的总
DNA的浓度较大 ,但高盐低 pH值法所得的总 DNA
的浓度较小;CTAB法效果较好 ,但所用试剂较昂贵;
异硫氰酸胍法所得的总 DNA的质量好 ,浓度大 ,残存
盐和小分子杂质也少 ,故提异硫氰酸胍法是提取果汁
中 DNA的首选方法。实验中如何去除果汁中特有的
影响 DNA提取的物质 ,是选择果汁 DNA提取方法应
重点考虑的问题 。用酚 -氯仿沉淀蛋白 ,交替使用酚 、
氯仿两种不同的蛋白质变性剂以去除与核酸结合的
蛋白质等生物大分子的干扰 ,提越桔果汁 DNA的纯
度 ,且提取的 DNA适合于 PCR扩增和 RAPD反应 。
此外 ,由于果汁中所含的多糖 、多酚 、单宁 、色素及其
它代谢物质均会对 DNA的提取产生影响 ,如多酚等
物质可使 DNA氧化成棕褐色 ,多糖与 DNA结合成粘
稠的胶状物 ,而且加工中出现的某些物理 、化学变化
及酶因子也会影响 DNA的质量 。因此 ,本实验采用
多次加酚去除果胶 、多糖也取得较好的效果。采用果
胶酶处理 ,并在 DNA提取液中加入 PVP及 EDTA螯
合物 ,也是可借鉴的改善模板质量的方法 。本实验建
立了一套较为完整的越桔 RAPD的优化反应体系及
程序 ,为今后分析不同品种越桔居群及居群间的遗传
多态性奠定了基础。
参考文献:
[ 1] 　刘淑兰 ,吕秀莲 ,王晓军 , 等.越橘的化学成分与药理活
性研究进展 [ J] .中医药学报 , 2006, 34(6):53-54.
[ 2] 　丛　娟 ,晓　玲 , 宫　莉 ,等.菠菜基因组 DNA提取方法
与条件的研究 [ J] .长春工业大学学报:自然科学版 ,
2007, 28(4):467-472.
[ 3] 　李晓红 , 陈世义 ,钟淑霞 , 等.研磨-CTAB法与碱性异硫
氰酸胍沸腾法提取真菌 DNA的比较分析 [ J] .中国实验
诊断学 , 2005, 9(3):364-365.
[ 4] 　徐　娜 ,夏秀英 , 徐大可 ,等.越橘基因组 DNA的快速提
取及分析 [ J] .果树学报 , 2007, 24(5):714-717.
[ 5] 　沈夏艳 ,陈　颖 , 黄文胜 ,等.苹果汁中 DNA提取方法的
比较及 RAPD扩增研究 [ J] .中国食品学报 , 2008, 8(2):
18-22.
(收稿日期:2008-09-08)　　
—3—第 1期　王　程 ,等.笃斯越桔果实总 DNA提取方法的比较研究