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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
酿酒酵母 ATP合酶δ亚基融合蛋白的
构建、表达及生物学功能分析
于立权 1 　闫智慧 2 　蒋伶活 1, 2
(1 天津大学药物科学与技术学院 ,天津 300072; 2 天津医科大学 天津市基础医学研究中心 , 天津 300070)
　　摘 　要 : 　利用分子克隆手段构建了酿酒酵母 ATP合酶δ亚基和流感病毒血凝素 ( haem agglutin in, HA )标签融合蛋白的
表达质粒。该融合蛋白在酿酒酵母细胞中能够正常表达 ,而且能够互补编码δ亚基的 ATP16基因缺失株在利用非发酵性碳源
方面的表型缺陷 ,表明该融合蛋白具有野生型δ亚基的功能。同时 ,构建了在大肠杆菌细胞中表达该δ亚基的 ScA tp16p2H is6 融
合蛋白 ,并用纯化的融合蛋白在家兔中制备了其多抗血清。结果表明此多抗可以很好地与 ScA tp16p2H is6 和 HA2ScA tp16p两种
融合蛋白特异性结合。这些研究材料的获得为深入研究 ATP合酶的解偶联机制和磷酸化调控机理奠定了基础。
关键词 : 　酿酒酵母 　F1 F0 2ATP合酶 　δ亚基 　融合蛋白 　功能分析
Construction, Expression and Functional Analysis of Haemagglutin in2tagged
δSubun it of Saccha rom yces cerevisiae M itochondria l ATP Synthase
Yu L iquan1 　Yan Zhihui2 　J iang L inghuo1, 2
(1 School of Pharm aceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072;
2 Tianjin Research Center of B asic M edical Sciences, Tianjin M edical University, Tianjin 300070)
　　Abs trac t: 　A construct exp ressing the HA2taggedδ subunit of F1 F0 ATP synthase was constructed. Functional comp lementation
study showed that the fusion p rotein could comp lement the function of the wild2typeδ subunit in the utilization of non2fermentable car2
bon sources in yeast cells. Meanwhile, antiserum against inclusion bodies containing bacterial exp ressed ScATP162H is6 p roteins was
generated, and this polyclonal antibody could recognize fusion p roteins ScATP162H is6 and HA2ScA tp16p. These studies p rovide a basis
to further study the uncoup ling mechanism between F1 and F0 portions of ATP synthase and its regulation by p rotein phosphorylation in
the m itochondrion.
Key wo rds: 　Saccharom yces cerevisiae 　F1 F0 ATP synthase　δ subunit　Fusion p rotein　Functional analysis
收稿日期 : 2009203218
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30870107)
作者简介 :于立权 (19742) ,男 ,黑龙江人 ,博士研究生 ,主要从事微生物分子遗传学的研究 ; E2mail: yuliquanjy@yahoo. com. cn
通讯作者 :蒋伶活 ,教授 , Tel: 022227402527, E2mail: linghuojiang@yahoo. com. cn　　线粒体内膜上的 F1 F0 2ATP合酶能够利用氧化呼吸链产生的跨膜质子梯度将 ADP和无机磷酸合成 ATP。F1 F0 2ATP合酶为多亚基复合体 ,由镶嵌在膜内与质子转运有关的疏水性 F0部分和位于线粒体基质中的与酶催化活性相关的 F1 部分组成 [ 1 ]。酿酒酵母 ATP合酶中 F1 部分由α3、β3、γ1、δ1、ε1五种亚基组成 [ 2 ] , 3个α亚基和 3个β亚基交替排列环绕在 γ亚基周围形成一个转子 [ 3 ] ,γ亚基从(αβ) 3复合体中向下延伸与δ、ε亚基形成中心柄 将 F1 和 F0 连接起来 [ 4 ]。 F0 部分的中心柄外周有由 10～12个 c亚基组成的环 ,中心柄在 ATP合酶催化过程中随 c环一起旋转 ,δ亚基对 c环和γ亚基之间的协同作用非常关键 [ 5 ]。研究表明 ,δ亚基缺失不影响 F1 F0 复合体的形成 ,但会影响 A TP4基因编码的合酶定子柄组分亚基 b的功能 ,从而使A TP6基因编码的离子通道组分亚基 6不能插入ATP合酶中去 ,离子通道不能聚集而丧失功能 ,进而发生 ATP合成和质子转运解偶联 ,线粒体 DNA功
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
能丧失 [ 6 ]。因此 ,编码酿酒酵母δ亚基的 A TP16基
因的缺失株不能在只含有非发酵性碳源的培养基上
生长 ;此外 , A TP16基因的缺失会导致线粒体 DNA
不稳定 ,造成线粒体丢失 ,从而在含葡萄糖的平板上
形成专一性小菌落 (obligate petites) [ 7, 8 ]。酿酒酵母
中的δ亚基首先由 Giraud等 [ 1 ]分离纯化并克隆测
序 ,与大肠杆菌中相对应的 ε亚基同源性高达
66%。最近的研究报道在酵母细胞 ATP合酶的 δ
亚基上检测到被磷酸化的丝氨酸残基 [ 9 ]。
本研究报道了酿酒酵母 F1 F0 2ATP合酶δ亚基
与流感病毒血凝素 ( HA )融合蛋白的构建、表达和
功能研究 ,并分析了 ScA tp16p2H is6 融合蛋白的免疫
学活性和相应的多抗特异性 ,为深入研究δ亚基的
磷酸化调控机制奠定了基础。
1　材料与方法
111　材料
酿酒酵母单倍体野生型菌株 BY4741 (M ata h is3
△1 leu2 △0 m et15 △0 u ra3 △0 ) 参考文献 [ 10 ] ,
atp16缺失株 (M ata h is3△1 leu2△0 m et15△0 ura3
△0, a tp16: : kanM X4 )保存在 YPD培养基上。大肠
杆菌菌株 Top10在 LB培养基上培养传代。酵母表
达载体 pHAC111 是在单拷贝载体 YCp lac111 的
S ph I和 EcoRV位点之间插入 3个连续的流感血凝
素 ( HA ) 标记构建而成 [ 11 ]。 SD2LEU 培养基含
0. 67%酵母氮源 , 2%葡萄糖和除亮氨酸外的必需氨
基酸。YPD固体培养基含 1%酵母提取物 , 2%胰蛋
白胨 , 2%葡萄糖和 1. 5%琼脂粉 ,非发酵碳源培养
基 YPA、YPE、YPG和 YPL分别是用 2%的乙酸钠、
乙醇、甘油和半乳糖代替 YPD中的葡萄糖。
日本大耳白家兔 ,体重 2. 5 kg,雄性 ,由中国军
事医学科学院放射性研究所提供。
112　试剂
限制性内切酶为 Fermentas产品 ;胰化蛋白胨、
酵母提取物和氨苄青霉素为 Gibco公司产品 ;酵母
氮碱为 D ifco公司产品 ;小鼠抗 HA单克隆抗体、羊
抗小鼠 IgG多克隆抗体和羊抗兔 IgG多克隆抗体均
为 Tiangen公司产品 ;其它化学试剂均为 Sigma公司
的分析纯试剂。
113　方法
11311　ATP16基因的克隆及测序 　酿酒酵母基因
组 DNA 提取方法参照以前的文献 [ 12 ]。用引物
ScATP162F ( 5′2tcagacgggcagtttatttg23′)和 ScATP162R
(5′2cggcatgctttcaatacggattgtaggt23′) ,以酿酒酵母 BY4
741基因组 DNA为模板 , PCR扩增含有 710 bp启动
子和 480 bp ORF (不含终止密码子 )的 A TP16基因
片段. PCR反应程序 : 94℃预变性 2 m in; 94℃变性
30 s, 43. 3℃复性 30 s, 72℃延伸 1 m in 45 s,共 30个
循环 ;最后 72℃延伸 5 m in。目标 PCR产物经琼脂
糖凝胶电泳后回收纯化 ,连接到用 B am H I和 Sph I
双酶切的载体 pHAC111中。转化大肠杆菌 Top10,
所得重组质粒经酶切和测序验证 ,获得 pHAC1112
ScATP16,用于表达 ScATP162HA融合蛋白。
以酿酒酵母单倍体野生型菌株 BY4741基因组
DNA为模板 ,用引物 ScATP162F ( 5′2CGGGATCCTG
TTACGTTCAATTATTGGAAAG23′,附加 B am H I酶切
位点 ) 和 ScATP162R ( 5′2ACGCGTCGACCTATTTCA
ATACGGATTGTAGG23′,附加 Sa l I酶切位点 )进行
PCR扩增获得含有整个 ScATP16 ORF但去掉终止
密码子的 DNA片段 (大小 480 bp ) ,将该片段克隆
到大肠杆菌细胞表达载体 pET28c的 B am H I/S a l I位
点之间 ,得到表达 ScATP162H is6 的 pET28c2ScATP16
重组质粒 ,经酶切和 DNA测序验证其序列的正确
性。引物合成和 DNA测序由北京奥科生物有限公
司完成。
11312　酵母转化和表型分析 　用醋酸锂转化程
序 [ 13 ] ,将酵母 pHAC1112ScATP16和载体 pHAC111
质粒分别转入酿酒酵母 a tp16缺失菌株 ,同时将空
载体转入野生型单倍体菌株 BY4741中做对照。在
SD2LEU培养基中选择转化子。从每个转化平板上
随机选取 3个转化子划线接种在 YPE、YPG、YPA、
YPL和 YPD平板上 , 30℃温度下培养 2～3 d,观察
它们的生长情况。
11313　蛋白提取和 W estern blot分析 　将随机挑选
的转化子菌株接种到 SD2LEU液体培养基中 , 30℃
过夜培养. 培养物按照 1∶10比例转接到新鲜培养基
中 ,震摇培养至 OD600 0. 8左右 , 4 000 r/m in离心
5 m in收集菌体。用玻璃珠方法提取细胞总蛋
白 [ 12 ]。以牛血清白蛋白做标准曲线 ,用 B radford法
测定样品中蛋白质浓度。
参照 Laemm li方法进行 SDS2PAGE 电泳 [ 14 ]。
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2009年第 8期 　　于立权等 :酿酒酵母 ATP合酶δ亚基融合蛋白的构建、表达及生物学功能分析
各样品电泳时加样量均为总蛋白 10μg。湿法转印
后 ,参照文献 [ 15 ]进行 W estern blot分析 ScATP162
HA融合蛋白在酵母细胞中的表达。转印膜经过
5%脱脂奶粉室温封闭 2 h后 ,加 1∶2 000一抗 (小鼠
抗 HA单克隆抗体 ) 4℃孵育过夜 , TBST洗液洗 3
次 ,每次洗 10 m in。1∶500二抗 (羊抗小鼠 IgG多克
隆抗体 )室温孵育 2 h, TBST洗液洗 3次 ,每次洗 10
m in。用 Pierce ECL荧光试剂盒和 X2光片显影法检
测杂交膜上的反应信号。
融合蛋白抗原 ScATP162H is6 免疫学活性分析
和抗血清特异性检测实验中 ,一抗 (兔抗血清 )和二
抗 (羊抗兔 ) 抗体的使用浓度分别为 1 ∶200 和
1∶2 000。免疫学活性分析实验中 , ScATP162H is6 抗
原蛋白用 1 ×samp le buffer做稀释后 ,分别用 1、10、
100 ng和 1μg的蛋白量来检测兔抗血清的免疫学
反应活性。
11314　重组蛋白的诱导和表达以及多克隆抗体的
制备 　将 pET28c2ScATP16重组质粒转化大肠杆菌
菌株 BL21 (DE3) ,用 IPTG进行诱导表达。大肠杆
菌细胞中重组蛋白的诱导和表达方法参照文献
[ 16, 17 ]。含有重组蛋白包涵体的变性和溶解方法
参照文献 [ 12 ]。用 8 mol/L尿素溶解包涵体进行
SDS2PAGE电泳后 ,根据蛋白 Marker位置切下目的
融合蛋白冷冻干燥 ,研磨成粉末。免疫前用无菌
PBS溶解含目的蛋白的粉末 ,和等体积弗氏完全佐
剂充分混合 ,皮下多点注射家兔。每只家兔融合蛋
白的用量为 180μg,每间隔 2周加强免疫 1次 ,共加
强 4次 ,每次免疫的剂量同上 ,从第 3次免疫后 1周
开始测定血清抗体效价 ,末次免疫后采集兔体全血 ,
分离的血清经离心部分纯化后 ,分装置 - 20℃保存。
2　结果与分析
211　pHAC1112ScATP16表达质粒的克隆与鉴定
利用 A TP16基因启动子序列上的 B am H I位点
和 ScATP162R引物上附加的 S ph I位点 ,将 PCR扩
增的 ScA TP16基因片段 ,包括 ATG上游 710 bp和
480 bp开放阅读框 ,共 1. 19 kb,克隆到 pHAC111的
B am H I和 S ph I位点之间。pHAC111载体具有 N de I
单克隆位点 , ScATP16基因内部包含有另一 N de I酶切
位点 ,所以用 B am H I + Sph I和 B am H I +N de I两种双
酶切方法对 pHAc1112ScATP16重组质粒 DNA进行酶
切验证 ,证实 pHAC1112ScATP16重组质粒中插入了
预期的 1. 19 kb片段 (图 1)。对插入片段进行 DNA
序列测定表明该重组质粒中 ScATP16阅读框架与 HA
完全融合 ,且无任何碱基突变。
1. 1kb DNA marker; 2. pHAC1112ScATP16双酶切 (B am H I + Sph I) ;
3. 500 bp DNA marker; 4. pHAC1112ScATP16双酶切 (B amH I +N de I)
图 1　酶切鉴定重组质粒 pHAC1112ScATP16的电泳分析
212　ScATP162HA和 ScATP162H is6 融合蛋白的表达
为了检测 ScATP162HA融合蛋白在酵母细胞中
的表达情况 , 利用 W estern blot对带有空载体或
pHAC1112ScATP16质粒的 a tp16缺失株细胞的总蛋
白进行了分析。结果发现 ,在两种细胞中都检测到
了一条大小为 45 kD的非特异性杂交带 ,这条非特
异性蛋白带在以前的研究中曾经报道过 [ 11 ]。然而 ,
在带有 pHAC1112ScATP16质粒的 a tp16菌株细胞中
存在一条与预期的 ScATP162HA融合蛋白大小相同
(约 20 kD)的目的条带 ,而在含有空载体的 atp16缺
失株细胞中 ,没有检测到这条目的条带 (图 2)。
1. 含有 pHAC1112ScATP16的 atp16 细胞 ; 2. 含有空载体 pHAC111
的 atp16细胞
图 2　W estern blot分析 a tp16缺失株细胞中表达的
ScATP162HA融合蛋白
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这一结果表明 ScATP162HA融合蛋白能够在酵母细
胞中正常表达。
为了制备δ亚基的多克隆抗体 ,将 pET28c2ScATP16
重组质粒转化到大肠杆菌表达宿主菌株 BL21,用
IPTG进行诱导表达。通过对表达细胞总蛋白的
SDS2PAGE电泳分析发现 ,在经 1 mmol/L IPTG诱导
的细菌细胞中得到了预期大小的 ScA TP162H is6 表
达 (图 3)。但是 ,在各种诱导条件下表达的融合蛋
白以包涵体形式存在 (数据未显示 )。
1. 0 h; 2. 1 h; 3. 3 h; 4. 6 h; 5. Protein size marker
图 3　SD S2PAGE分析大肠杆菌细胞中
1mm ol/L IPTG诱导表达的 H is6 2ScA tp16p
213　ScATP162HA融合蛋白的功能分析
酿酒酵母细胞δ亚基缺失后会引起细胞中线粒
体功能丧失 ,从而造成 a tp16缺失株细胞在非发酵
碳源培养基上不能生长 [ 18 ]。在 YPD培养基上 ,含
有 pHAC111或者 pHAC1112ScATP16的 a tp16缺失
株细胞均能正常生长 (图 4)。在非发酵性碳源培养
基上 ,含有 pHAC1112ScATP16重组质粒的 a tp16缺
图 4　含有载体 pHAC111或 pHAC1112ATP16的
a tp16缺失株细胞在非发酵碳源培养基中的生长情况
失株细胞能够正常生长 ,而导入空表达载体 pHA C111
的 a tp16缺失株细胞则不能生长 (图 4)。这些结果
表明 ,构建的 ScATP162HA融合蛋白能够互补野生
型 ScA tp16p的正常功能。
214　ScATP162H is6 融合蛋白抗体制备及其免疫学
活性和特异性分析
用纯化的含有 ScATP162H is6 融合蛋白的包涵
体为抗原在家兔中制备获到兔抗 ScATP162H is6 抗
血清。用稀释 100倍、200倍和 1 000倍的这种抗血
清进行 W estern blot分析检测其对 ScA tp16p2H is6 蛋
白的免疫反应活性。结果发现 ,用稀释 200倍的这
种抗血清能够检测到最低含量为 10 ng的 ScA tp
16p2H is6 蛋白 (图 5,泳道 4)。在含有较高蛋白上样
量的情况下观察到大于或小于目的蛋白分子量大小
的非特异性条带 (图 5,泳道 5) ,可能是由于融合蛋
白包涵体中含有的杂蛋白的抗体造成的。试验结果
表明 ,所获得的 ScATP162H is6 融合蛋白的兔抗血清
具有良好的免疫学活性。
1. 预染 p rotein size marker; 2. 0 ng ScATP162H is6 ; 3. 1 ng ScATP162
H is6 ; 4. 10 ng ScATP162H is6 ; 5. 100 ng ScATP162H is6
图 5　融合蛋白抗原 ScATP162H is6 的免疫学活性分析
为了进一步研究 ScATP162H is6 多抗的特异性 ,
用这种抗血清对酵母细胞中表达的野生型 ScA tp16p
和 ScATP162HA融合蛋白进行了检测。发现这种抗
血清能够检测到在含有 pHAC111空载体的野生型菌
株 BY4741细胞中表达的野生型 ScA tp16p蛋白 (图
6,泳道 1) ,也能检测到在含有重组质粒 pHAC1112
ScATP16的 a tp16细胞里表达的 ScATP162HA融合蛋
白 (图 6,泳道 2)。这些结果说明 ,以 ScATP162H is6
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2009年第 8期 　　于立权等 :酿酒酵母 ATP合酶δ亚基融合蛋白的构建、表达及生物学功能分析
融合蛋白为抗原制备的多抗 ,对野生型 ScA tp16p和
ScATP162HA 融合蛋白都具有很好的抗原抗体结
合性。
1. 含有 pHAC111 的 BY4741 细胞 ; 2. 含有 pHAC1112ScATP16 的
atp16细胞 ; 3. 含有 pHAC111载体的 atp16细胞
图 6　抗融合蛋白 ScATP162H is6
的兔抗多克隆抗体特异性评价
3　讨论
细胞氧化磷酸化过程产生的跨膜质子梯度势
能 ,经过 F1 F0 2ATP合酶 F0 部位的质子通道推动
ATP合酶 F1 处的 ATP催化合成。δ亚基作为转子
的一部分 ,涉及到 ATP合成和质子转运之间的偶
联 ,起到“分子离合器 ”的作用 [ 19 ]。然而 ,目前还未
见δ亚基被任何生理过程或因子的调控的研究报
道。最近的研究显示酵母细胞 ATP合酶的δ亚基
上的一个丝氨酸残基可以被磷酸化 ,这表明δ亚基
的功能有可能被蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶所调
控 [ 9 ]。本试验成功构建了在酵母细胞中表达且可
以代替野生型δ亚基的生物学功能的 ScA tp16p2HA
融合蛋白 ,同时获得了抗 ScATP162H is6 兔抗血清。
这些研究结果为深入研究δ亚基的磷酸化调节机理
奠定了基础。
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