全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
转 Prd29A ipt基因对烟草根及侧芽生长的影响
董绍旺 王爱英 孙建富 沈海涛 祝建波
(石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子 832000 )
摘 要: 利用异戊烯基转移酶 ( isopenteny ltransferases, ipt)基因转化植物, 可明显提高抗逆性和抗病性, 延缓叶片衰老。
逆境胁迫常会对植物造成很大的伤害,拟南芥的 P
rd29A
启动子受干旱、盐及冷胁迫诱导。构建了 P
rd29A
ipt植物表达载体, 通过
农杆菌介导转化普通烟草,获得了能够正常生长的转基因植株。通过表型观察发现 ,转 P rd29A ipt烟草具有一定的组成型表达,
降低了烟草的顶端优势,促进了烟草侧芽的生长, 同时,对根的伸长有一定的抑制作用。
关键词: 异戊烯基转移酶 细胞分裂素 顶端优势 侧芽
Effects of Transform ing P rd29A iptGene on Grow ing of Tobacco
Lateral Bud and Root
Dong Shaow ang W angA iying Sun Jianfu ShenH a itao Zhu Jianbo
(K ey Laboratory of Agriculture B iotechnology of Shihezi University, Shihezi 832000)
Abstrac:t T ransgen ic p lants w ith isopenteny l transfe rase gene( ipt) can improve the ability o f stressand diseaseresistance, and
de lay the senescence of leaves. Stress usua lly causes g reat damage to p lants. Prd 29A of A rabidop sis thaliana is droughtsaltand co ldin
duc ib le prom oter. W e constructed P rd29A ipt plant expression vector, transform ed tobacco by Agrobacterium tum efaciens, and have ac
qu ired a few transgen ic tobaccos. By detecting pheno type, w e found that tobaccos transform ed Prd29A ipt cou ld constructively express, de
crease ap ica l dom inance and im prove lateral bud grow ing, bu t inhab it root e longa tion. The studym ight prov ide referece for further study
in g ra ft plants such as flow ers and fru it trees.
Key words: Isopen teny ltransferases Cytokin in Apical dom inance Lateral bud
收稿日期: 20100322
基金项目:国家转基因专项 ( 2008ZX08011002, 2008ZX08005004 )
作者简介:董绍旺,男,硕士研究生,研究方向:植物基因工程; Em ai:l sw _d@ 163. com
通讯作者:祝建波,男,副教授,研究方向:植物基因工程; Em ai:l z jbshz@ 126. com
异戊烯基转移酶 ( isopentenyltransferases, ipt)
是合成细胞分裂素的关键酶,催化异戊烯基焦磷酸
和单磷酸腺苷的分解, 生成细胞分裂素的前体异戊
烯基单磷酸腺苷 ( isopenteny lAMP, iAMP) [ 1]。细胞
分裂素的作用功能是多方面的,施用外源的细胞分
裂素可以有效地提高籽种的重量 [ 2] , 提高果树的坐
果率 [ 3] , 增强植物对逆境的抗性。利用该基因来延
迟植物衰老和提高植物的抗逆性已被证明是一种有
效的方法 [ 4]。
组织型表达的 ipt基因的转基因植物常会对植
物的表型产生不利的影响, 如生长缓慢, 植株矮化,
种子不育,不形成根 [ 5]等。筛选合适诱导型启动子
调控该基因的表达,是当前该基因利用的一个主要
的策略。许多研究人员利用组织专一性启动子如块
茎专一 [ 6]、胚珠专一 [ 7]等以及诱导型启动子如热
激 [ 8]、光 [ 9]、铜 [ 10]等来调控 ipt基因表达, 从而实现
对转基因植物的调控。利用衰老诱导型 SAG12的
启动子调控 ipt表达提高植物的抗衰老性是当前应
用比较多的一个方法, 如转 Prd29A ipt的水稻、番茄、
小麦、樱桃植株和对照植株相比, 转基因植株衰老延
缓, 绿色期延长, 生长后期体内的 CTK s、可溶性糖、
可溶性蛋白等含量明显高于对照植株 [ 11 - 16 ]。
来源于拟南芥的启动子 Prd29A, 受干旱、高盐、高
渗、低温等逆境诱导 [ 1 7 ] , 为了评估该启动子诱导表
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
达效果,本试验构建了 Prd29A ipt植物表达载体, 并通
过转基因方法获得转基因烟草植株, 在确定 Prd29A能
够调控 ipt的表达基础上, 分析转基因烟草表型的变
化,对该表达系统应用范围进行评价。
1 材料与方法
11 材料
111 基因及菌株 基因 ipt由北京大学林忠平教
授惠赠,启动子 Prd29A、质粒 pB I121、大肠杆菌 DH5
和农杆菌 GV3101为本实验室保存。
112 植物材料 烟草为普通野生型烟草。
113 主要生化试剂 限制性内切酶, DNA回收
试剂盒, T4 DNA连接酶, Taq DNA聚合酶购自 Pro
mega公司, pGM T easy vector试剂盒购自 T IANGEN
公司。
12 方法
121 启动子 Prd 29A和 ipt基因的克隆 根据启动子
Prd 29A和 ipt基因的序列,设计包含酶切位点的引物。
启动子 Prd 29A上游引物: 5 AAGCTTCGACTCAAAA
CAAACTTACGAAAT3 , 下游引物: 5 GGATCCCTT
TATTCCTGATGATTGTTTC3 ,在引物的 5 端分别加
入H in d III和 BamH I酶切位点 [ 1 8 ]。基因 ipt上游引
物: 5 CCCGGGATGGACCTGCATCTAATT3 , 下游引
物: 5 GAGCTCCTAATACATTCCGAACGGATG3 , 引
物 5 端酶切位点分别为 Xma!和 Sac!。反应程序均
为 95∀ 5m in; 95∀ 30 s, 55∀ 30 s, 72∀ 1m in,共 30
个循环; 72∀ 10m in。根据 DNA回收试剂盒和 pGM
T easy vector试剂盒提供的说明书进行目的片段回收
和连接,将 Prd29A和 ipt分别克隆到 pGM T easy vector
上,并命名为 TPrd 29A和 Tipt。
122 植物表达载体构建 使用H in d III和 BamH
I切下 pB I121的 35S启动子, 并回收大片段, 使用
H ind III和 BamH I切下质粒 TPrd29A启动子 Prd29A,
并回收目的片段, 将回收得到的大片段和目的片段
体外连接,转化感受态大肠杆菌 DH 5, 筛选阳性克
隆, 得到中间载体 pB I121Prd29A。使用 Xma!和 Sac
!切下中间载体 pBI121Prd29A的 GUS基因, 并且回
收大片段,使用 Xma!和 Sac!切下质粒 Tipt的 ipt
基因,回收小片段, 将回收得到的大片段和小片段连
接, 转化感受态大肠杆菌 DH 5, 利用 PCR筛选阳性
克隆, 最 终得到 植物表 达载 体 pB I121Prd 29A
ipt (图 1)。
图 1 植物表达载体 pBI121Prd29Aip t的构建
123 农杆菌介导转化烟草 利用农杆菌介导叶
盘法转化烟草, 分化生长愈伤,并进行 kan筛选,在
适当生长素和细胞分裂素的作用下, 诱导愈伤分化
出芽 [ 1 9 ]。将 kan筛选阳性的烟草小芽转到生根培
养基,在正常的光照和 20∀ 条件下,诱导烟草生根,
最后产生幼苗,同时用未转基因烟草做阴性对照。
2 结果与分析
21 对转基因烟草的筛选鉴定
提取 kan筛选阳性幼苗和对照组烟草 DNA,
PCR鉴定 ipt基因,得到 6株转基因烟草 (图 2)。
22 RNA鉴定结果
在正常生长条件下与对照烟草相比, 转基因烟
草表现出细胞分裂素过量表达的表现型。为了进一
步确认 ipt基因是否表达,提取转基因烟草和对照烟
草 RNA, 做 RTPCR,结果 (图 3)显示, 转基因烟草
植株 ipt基因出现了大量表达。
23 Prd 29A ipt基因对烟草根生长的影响
将转基因烟草植株和对照植株在相同条件下生
长 1个月后,对照植株正常生根,并且根快速的生长
延伸,转基因植株虽然也长出了根,但是根生长缓慢,
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2010年第 8期 董绍旺等:转 Prd29A ipt基因对烟草根及侧芽生长的影响
根长度明显比对照组短, 显示出细胞分裂素表达的
效果。
24 Prd 29A ipt基因对烟草侧芽生长的影响
转基因烟草在生根培养基培养 1个月后,顶端优势
消失,长出大量的侧芽 (图 5)。
1.对照植株; 2.质粒 DNA ; 3- 13. kan检测阳性植株
图 2 PCR鉴定 kan检测阳性植株结果
1.对照组; 2.质粒 DNA; 3- 5.转基因烟草
图 3 RTPCR鉴定结果
A- C.转基因烟草; D.对照烟草
图 4 烟草转移到生根培养基后一个月后根生长情况
A - C.转基因烟草; D.对照烟草
图 5 烟草转移到生根培养基后一个月侧芽生长结果
3 讨论
ipt基因遗传转化的研究始于 1984年 [ 20 ] ,由于
其对植物生长有较好地促进作用, 很快就吸引了大批
学者的关注;但是由于 ipt基因在转基因植物体内过
量表达会对植株产生不利的影响 [ 5] ,因此它的应用就
有了很大程度的限制。很多学者分别采用不同启动
子调控 ipt基因在植物体内的表达,表明转 ipt基因不
仅可以促进转基因植株果实和种子生长 [ 2 1 ] , 增加转
基因植株次生代谢物含量 [ 2 2 ] ,而且可以提高转基因
植株的抗病性 [ 2 3 ]和抗逆性 [ 2 4, 2 5 ] , 延缓转基因植株
叶片衰老 [ 2 6, 2 7 ]。 ipt基因在植物基因工程应用领域
展示了广泛的应用前景。
植物在生长发育的过程中,经常会受到低温、干
旱、盐渍化等逆境胁迫, 会对植物造成很大的伤害,
引发植物细胞的程序性死亡,而 ipt基因则能够有效
抑制这个过程的发生。研究发现来源于拟南芥的
rd29A基因表达受干旱、高盐、低温等逆境的诱导,
其启动子内部含有两个与逆境胁迫应答有关的顺式
作用元件。为了增强植物对逆境的抗性,本研究利
用 Prd29A基因启动子构建了 Prd29A ipt植物表达载体,
通过转基因烟草的 RTPCR表达分析表明, 转基因
烟草在正常生长条件下也具有较强的表达能力, 转
基因植株表现出顶端优势丧失, 促进侧芽生长以及
根的生长被抑制。这跟已有的报道拟南芥中 rd29A
基因有微量的组成型表达是一致的 [ 2 8 ] , 因此, 我们
可以将其应用在园艺及花卉生产中, 在不影响植物
正常生长的情况下,去除植物的顶端优势,增加花卉
的开花茎数,比如玫瑰、丁香等, 这在果树上同样也
可以应用,不仅可以增加果树的分枝,同时可以调控
果实的形态及无籽果实的形成。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
参 考 文 献
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