全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
红酵母 NZ01发酵条件的优化
张琇 林勤
(北方民族大学生物科学与工程学院 国家民委发酵酿造工程生物技术重点实验室,银川 750021)
摘 要: 以红酵母菌株 NZ01为试验菌株,研究其发酵工艺与中试生产。采用摇瓶发酵优化的方式,研究培养基组分与
发酵工艺条件对该菌发酵的影响,并进行中试放大生产。结果显示, 该菌最适生长培养基组分为葡萄糖 10 g /L, 蔗糖 10 g /L,
酵母膏 10 g /L,牛肉膏 25 g /L; 色素合成最适培养基组分为葡萄糖 15 g /L,蔗糖 10 g /L,酵母膏 2 5 g /L, 牛肉膏 5 g /L。最适
生长起始 pH 值为 60,最适接种量为 8% , 生长周期为 44 h;最适色素合成起始 pH值为 70,最适色素合成接种量为 8% ,色素
合成周期为 48 h。发酵优化后的色素产量 3 88g / mL较优化前 171g /mL提高了 127%。中试产量达 3 05g / mL。红
酵母菌 NZ01优化后的发酵条件可以应用于中试生产虾青素,有规模化生产应用潜力。
关键词: 红酵母 虾青素 发酵优化
Ferm entation Optim ization and Pilot Production of Red Yeast NZ01
Zhang X iu L in Q in
(College of Biological Sciences and Engineering, N orth University forE thnics,
K ey Laboratory of F ermentation, Brewing Engineering and B iotechnology, State Nationalities Affairs Comm ission, Yinchuan 750021)
Abstrac:t The ferm entation optim iza tion and p ilo t production o f red yeast NZ01 w as stud ied. The e ffects of the cu lture m edium
components and the ferm entation conditions on the yeast grow th and pigm ent y ie ld were investig ated by shake flask. The p ilot ferm enta
tion exper iment w as carr ied out. The results ind ica ted that the optimum culturem edium for g row th consisted of g lucose 10 g /L, sucrose
10 g /L, yeast ex trac t10 g /L, Beef ex tract 2 5 g /L and the optim um culturem ed ium fo r pigm ent producing consisted o fG lucose 15 g /L,
sucrose 10 g /L, Yeast ex tract 25 g /L, Beef extract 5 0 g /L. The optim um ferm entation conditions for red yeast NZ01 g row th w ere in
cubation o f 44 h, initial pH va lue 6 0 and inoculums leve l 8% ( v /v). The optimum ferm en tation conditions for red yeast NZ01 p ig
m ent producing w ere incubation o f 48 h, in itial pH value 70 and inoculums leve l 8% ( v /v ). There w as an overall increase o f 127%
p igm ent produc ing y ie ld ( 3 88 g /mL ) com pared w ith that o f the o rig ina l cond itions ( 1 71g /mL ) . The p igm ent y ie ld reached 305
g /mL after p ilo t fermentation. Therefore, we can conc lude that the param ete rs screened by shake flask could be app lied to NZ01 p ig
m ent in p ilot scale directly . Red yeastNZ01 p igment had the po tential to produce at large scale.
Key words: Red yeast Astaxanth in Ferm enta tion optim ization
收稿日期: 20091208
基金项目:国家民委科研项目 ( 08XBE 09 ) ,宁夏自然科学基金项目 ( NZ0841)
作者简介:张琇,男,博士,副教授,主要从事发酵工程研究; Em ai:l zh angxiu101@ yahoo. com. cn
虾青素 ( astaxanth in )化学名称为 3, 3二羟基
, 胡萝卜素4, 4二酮, 分子式为 C40H52O 4, 属于
类胡萝卜素, 呈粉红色, 具有独特的着色功能 [ 1, 2 ] ,
广泛存在于生物界中, 特别是水产动物的虾、蟹、鱼
和鸟类的羽毛中, 甚至在微生物中也有存在 [ 3, 4 ]。
虾青素能够促进动物机体抗体的产生, 增强动物的
免疫力 [ 5, 6] ;对人体也具有抗氧化、增强免疫力等功
效 [ 7 8]。在清除自由基方面, 其能力强于 胡萝卜
素 [ 9, 10]。在养禽业中,肉禽饲喂添加了虾青素后,皮
肤、脚和喙呈现出金黄色, 大大提高了禽蛋、肉的商
品价值。在观赏鱼行业中, 通常在饲料中添加虾青
素以促进鱼类体表颜色的沉积,提高观赏性,满足消
费者的需求。由于天然红色素产量有限而且性质不
稳定 [ 11] ,故远不能满足生物行业各方面的需求, 化
学合成色素随之诞生, 天然色素逐渐被所取代。然
而, 随着研究的深入,人们发现某些人工合成色素食
用过量有致癌的危险,世界各国对化学合成色素均
有严格的法律限制 [ 1]。据测算, 全球水产市场每年
2010年第 4期 张琇等 :红酵母 NZ01发酵条件的优化
对天然虾青素的需求量约为 750 t左右, 而截至
2005年底, 全球的天然虾青素总产量不到 4 ,t仅为
需求量的 05%。据统计, 养殖三文鱼和鳟鱼每年
需求虾青素 150 t。目前,人们通过微生物生产虾青
素的研究较多 [ 12- 14 ] , 如利用红发夫酵母 [ 15, 16]和雨
生红藻 [ 17, 18 ]等,但是虾青素产量远不能满足国内市
场。在国外,具规模的虾青素生产厂家仅有 3家,国
内仅有一家 (百信集团投资的荆州市天然虾青素有
限公司 )。对实验室筛选得到菌株 NZ01为出发
菌,对其进行正交试验优化, 提高其总色素的产量,
以其达到中试生产,实现虾青素的规模化生产。
1 材料与方法
11 试验菌株及培养方法
红酵母菌株 NZ01由本实验室分离保存。从斜
面挑取 1环菌株 NZ01,接入盛有 3mL种子培养基
的试管中, 20 ,摇床转速为 200 r /m in恒温振荡培
养 18 h,然后按照一定的接种量转入摇瓶发酵培养
基中 ( 250 mL三角瓶中装液 30 mL) , 20 , 200 r/
m in培养 40 h。斜面培养基 ( g /L ) :葡萄糖 10, 麦芽
汁 2,蛋白胨 3,酵母膏 1, 琼脂粉 2。种子培养基 ( g /
L ): 葡萄糖 10,麦芽汁 2, 蛋白胨 3,酵母膏 1。发酵
培养基 ( g /L ): 葡萄糖 10, 酵母膏 2, 蛋白胨 2, K2
HPO 4 1, M gSO4 05, CaC l2 01[ 2]。
12 主要试剂和仪器
试验用牛肉膏 (北京双旋 )、蛋白胨 ( OXO ID )、
琼脂 (国产 )、无机盐类与其它生化试剂均为国产分
析纯。 722S上海精科分光光度计, CR22G日立高速
冷冻离心机, HZQF恒温培养摇床, SW GJIBU标
准超净工作台, HH4型恒温水浴, 高压灭菌锅 YX
280D等。
13 菌体生长量的测定
发酵液离心,弃上清, 用自来水稀释 20倍, 波长
为 600 nm,以蒸馏水为参比,测定其吸光度 [ 2]。
14 总色素的测定
取 4 mL发酵液离心后, 用 2 mL DMSO破壁菌
体,加 4mL乙醇直接萃取,以 VDM SO: V乙醇 = 1 !1为
空白, 测定 max = 500 nm时的吸光度。
细胞总类胡萝卜素质量浓度 (g /mL) = ( A ∀
V a) ( / E ∀ V f)
式中 A为吸光度, Va为萃取液体积 ( mL) , E为
消光系数 ( 016) ; V f为取样发酵液体积 (mL) [ 4]。
15 摇瓶发酵条件的筛选与优化方法
分别从碳源、氮源、起始 pH、接种量方面进行红酵
母虾青素摇瓶发酵工艺条件的优化,参考文献 [ 19]。
16 绘制生长曲线与色素产量曲线
取振荡培养 18 h的种子培养液,以 8%接种量
接种于装有 200 mL的发酵液的 1 000 L的三角瓶
中, 摇床震荡培养, 摇床转速 200 r /m in, 培养温度
20 ,每隔 4 h取菌液发酵液离心, 弃上清, 用自来
水稀释 20倍, 波长为 600 nm, 以蒸馏水为参比, 测
定其吸光度,并相应测定色素产量。绘制生长曲线
和色素产量曲线。
17 中试发酵
种子罐总体积 200 L,培养液体积为 80 L;发酵
罐总体积为 2 000 L, 发酵液体积为 800 L。通气量
为 1!05,培养温度 20 , 搅拌轴转速为 80 r/m in,
其它条件依据摇瓶优化结果 [ 20 ]。
2 结果与分析
21 碳源对发酵的影响
由表 1可见, 红酵母菌 NZ01能够利用葡萄
糖、蔗糖、乙醇、甘油、甘露糖醇和麦芽糖, 不能利用
淀粉,其中葡萄糖和蔗糖既能提高生长量和能提高
总色素的产量。以蔗糖为红酵母菌 NZ01的碳源
物质进行下一步试验。
表 1 碳源对发酵的影响
碳源 OD600 总类胡萝卜素含量 ( g /m L)
葡萄糖 0523 171
蔗糖 0609 169
甘油 0192 056
乙醇 0284 109
甘露糖醇 0110 070
麦芽糖 0494 063
淀粉 0087 064
对照 (无碳源 ) 0070 075
22 氮源对发酵的影响
由表 2可见, 红酵母菌 NZ01能够较好地利用
有机氮源物质如酵母膏、蛋白胨和牛肉膏,几乎不利
199
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
用无机氮源物质,其中酵母膏和牛肉膏适合为红酵
母菌 NZ01的氮源物质。
表 2 氮源对发酵的影响
氮源 OD 600 总类胡萝卜素含量 ( g/mL)
酵母膏 0623 170
蛋白胨 0375 152
硫酸铵 0164 073
牛肉膏 0523 140
硝酸钾 0126 048
氯化铵 0148 069
尿素 0035 026
对照 (无氮源 ) 0104 048
23 正交试验确定合适的碳源、氮源组合及其浓度
设计正交试验的各因素及其浓度水平, 如表 3
所示。结果如表 4和表 5。由表 4可见, R值大小分
别为 B> D > A = C, 蔗糖浓度和牛肉膏浓度对红酵
母菌 NZ- 01的生长影响较大, 葡萄糖和酵母膏次
之。各因素最适配比是 A2 B2 C1D3 (即葡萄糖 10 g /
L, 蔗糖为 10 g /L, 酵母膏为 10 g /L,牛肉膏为 25 g /
L )。由表 5可见, R值大小分别为 A > C> D> B,葡
萄糖浓度和酵母膏浓度对红酵母菌 NZ01的产色素
能力影响较大, 蔗糖和牛肉膏次之。各因素最适配
比是 A1 B2C3D2。由表 4和表 5可见,红酵母菌 NZ
01的生长和产色素对营养的需求并不呈相关。尽
管葡萄糖、蔗糖、酵母膏和牛肉膏既能促进菌体生
长又能促进色素合成, 但是当将上述 4种营养物
质配在一起时, 蔗糖和牛肉膏对菌体的生长影响
较大,而葡萄糖和酵母膏对菌体的色素合成影响
较大。综合分析, 以色素合成为主要考虑指标, 确
定最适营养比例 A1 B2 C3D2, 即葡萄糖 15 g /L, 蔗糖
为 10 g /L,酵母膏为 25 g /L,牛肉膏为 5 g /L, 进行
下一步试验。
表 3 正交试验的因素和水平
水平 A B C D
1 15 15 1 1
2 1 1 05 05
3 05 05 025 025
注: A为葡萄糖; B为蔗糖; C为酵母膏; D为牛肉膏
表 4 正交试验结果 ( OD600 )
组别 A B C D OD 600
1 15 15 1 1 0599
2 15 1 05 05 0672
3 15 05 025 025 0512
4 1 15 05 05 0629
5 1 15 1 025 0687
6 1 05 025 1 0542
7 05 15 025 1 0621
8 05 1 1 05 0697
9 05 05 05 025 0466
K 1 0594 0616 0613 0582
K 2 0619 0685 0587 0612
K 3 0593 0505 0607 0613
R 0026 0180 0026 0031
注: K 1, K 2, K 3分别代表个因素水平的 OD 600平均数; R为极差
(Km axKm in)
表 5 正交试验结果 (总类胡萝卜素 )
组别 A B C D 总类胡萝卜素含量 ( g/ mL)
1 15 15 1 1 118
15 1 05 05 232
3 15 05 025 025 203
4 1 15 05 05 144
5 1 15 1 025 174
6 1 05 025 1 162
7 05 15 025 1 148
8 05 1 1 05 108
9 05 05 05 025 128
K 1 1843 1367 1293 1400
K
2 1600 1713 1680 1807
K 3 1280 1643 1750 1517
R 0563 0346 0457 0407
注: K 1, K 2, K 3分别代表个因素水平的总类胡萝卜素含量平均数; R
为极差 (Km axKm in)
24 pH对发酵的影响
由图 1可见, 红酵母菌 NZ01在起始 pH 为 6
时, 生长最好, 菌体值达到而起始 pH为 70时, 色
素合成量最高。
200
2010年第 4期 张琇等 :红酵母 NZ01发酵条件的优化
图 1 pH对发酵的影响
25 接种量对发酵的影响
由图 2可见,红酵母菌 NZ01接种量 8%时,生
长量与色素合成量均达到最高。
图 2 接种量对发酵的影响
26 生长曲线的确定
由图 3可见,红酵母菌 NZ01的生长量与色素合
成基本呈正相关, 在培养到 16 h时,进入对数生长
期,在培养至 20 h,色素开始大量合成。培养到 44 h
时,达到生长高峰,培养至 48 h达到色素合成高峰。
27 中试发酵
实验室摇瓶发酵优化试验确定红酵母菌 NZ01
摇瓶优化培养基组成: 葡萄糖 15 g /L,蔗糖为 10 g /
L,酵母膏为 25 g /L, 牛肉膏为 5 g /L。最适发酵
工艺条件: 培养温度 20 , pH 70, 接重量为 8%,
发酵周期为 48 h。为了验证其实用性, 通过种子
罐 200 L的发酵罐和 2 000 L的发酵罐进行中试放
大试验,试验重复 3次。结果表明, 色素产量分别
为 302 , 315, 298 g /mL,平均为 305 g /mL。
图 3 生长曲线与产色素曲线
3 讨论
目前, 据报道能够产虾青素并具有产业生产前
景的微生物为红发夫酵母, 雨生红藻等 [ 1, 4, 17, 18] , 但
是多数都停留在实验室研究中, 投入生产上的微生
物菌种寥寥无几。相比之下,红酵母菌 NZ01更易
培养和放大生产。因为菌株 NZ01产色素的最佳
培养基组分为 15 g /L, 蔗糖 10 g /L,酵母膏 25 g /
L,牛肉膏 5 g /L,从主要营养成分的使用量、原料成
本上可以看出,均属比较经济,易从市场获得; 从最
适发酵工艺条件上看, 最适色素合成起始 pH 值为
70,最适色素合成接种量为 8% ,培养温度为 20 、
通气量为 1! 05- 06, 搅拌轴转速为 80 r/m in, 发
酵周期为 48 h,该发酵工艺条件在普通发酵工厂或
车间完全可以实现而易控制。单位色素产量达到工
业级生产要求。在中试放大试验的过程中发现, 在
发酵中前期左右,发酵罐内易形成较厚泡沫,有时会
出现顶罐现象,添加少量的无菌发酵专用消泡剂,能
够取得一定的消泡沫效果, 但或多或少对虾青素的
后提取有些影响。因此, 改进红酵母菌 NZ01发酵
工艺和提高虾青素的提取效率仍是继续研究的主要
课题任务之一。
4 结论
红酵母菌株 NZ01最适生长培养基组分为葡
萄糖 10 g /L, 蔗糖 10 g /L, 酵母膏 10 g /L, 牛肉膏
25 g /L;最适生长起始 pH值为 60,最适接种量为
8%, 生长周期为 44 h。色素合成最适培养基组分为
葡萄糖 15 g /L, 蔗糖 10 g /L, 酵母膏 25 g /L, 牛肉
膏 5 g /L。最适色素合成起始 pH值为 70,最适色
素合成接种量为 8% ,色素合成周期为 48 h。红酵
母菌 NZ01的发酵优化后的色素产量 388 g /mL
较优化前 171 g /mL提高了 127%。中试产量达
201
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
305 g /mL。说明红酵母菌 NZ01优化后的发酵
条件可以应用于中试生产上。
参 考 文 献
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(上接第 182页 )
及产量高等优势。1号试剂盒采用可以特异性结合
DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌
的基因组 DNA,离心吸附柱中采用的硅基质材料为
该公司特有的新型材料, 能够高效、专一吸附 DNA,
可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合
物,提取到高质量的 DNA。后续的 PCR扩增的 282
bp和 1 521 bp的片段无非特异性扩增的杂带,扩增
效果良好。该试剂盒提取的 DNA片段大、纯度高、
质量稳定可靠,可以为细菌基因组 DNA的提取提供
有效的提取方法。
参 考 文 献
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