全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第1期
收稿日期:2007-07-19
基金项目:北京市教委科技发展重点项目和北京市自然基金重点项目资助(KZ200311417015)
作者简介:黄汉昌(1975-),男,硕士,助理研究员,E-mail:hanchang@ygi.edu.cn
通讯作者:姜招峰(1956-),男,博士,教授,E-mail:zhaofeng@buu.com
生物分子相互作用是一种基本的生命现象,生
物分子的活性功能是通过分子之间的相互作用来
实现的,生物分子相互作用研究也是现代生命科学
研究的重大问题之一。表面等离子共振(SPR,
SurfacePlasmonResonance)分析技术是上个世纪 90
年代由 BiacoreAB公司首先开发发展起来的一种
以生物传感芯片(biosensorchip)为核心的生物传感
分析检测技术[1,2]。SPR技术已被广泛地用于研究蛋
白质-蛋白质、核酸-蛋白质、核酸-核酸以及药物-
蛋白质之间相互作用的结合模式、反应动力学及亲
和分析等[3,4]。与其它一些检测生物分子相互作用
的技术,如放射免疫分析(RIA),酶联免疫标记分
析(ELISA)、平衡透析(EquilibriumDialysis)、亲和层
析(AfinityChromatography)等,相比较,SPR技术主
要 具 有 能 实 时 生 物 分 子 相 互 作 用 分 析 (BIA,
BiomolecularInteractionAnalysis)和无需要作标记的
优点[5]。对表面等离子共振技术的原理、分析方法
及其存在的问题作一评述。
1 SPR分析技术原理
1.1SPR原理
表面等离子体子共振是一种物理光学现象。当
一束平面光波从介质 1进入到介质 2时,入射光在
SPR技术分析生物分子相互作用的研究方法
黄汉昌 1 姜招峰 1 朱宏吉 2
(1北京联合大学应用文理学院 生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京 100083;2天津大学化工学院,天津 300072)
摘 要: 生物分子的活性功能是通过分子之间的相互作用来实现的,了解这种相互作用的关系对生命科学的研究
及揭示生命发生发展的基本机制具有着重要的意义。基于表面等离子共振(SPR)的分析分子相互作用(BIA)的技术是新
型的生物传感技术,其无需标、能实时跟踪检测生物分子间结合、解离的整个过程,通过分析传感图谱获取分子相互作用
的模式和动力学常数等方面的信息。SPR是研究生物分子相互作用的强有力工具,SPR技术已被广泛应用于生命科学领
域的研究,并且显示出广阔的应用前景。概述了SPR技术原理、分析方法及其评述了其存在的问题。
关键词: 表面等离子共振 生物传感器 生物分子相互作用
TheMethodofBiomolecularInteractionAnalysisbySurface
PlasmonResonance
HuangHanchang1 JiangZhaofeng1 ZhuHongji2
(1BeijingUnionUniversity,BeijingKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandFunctionalFoods,Beijing100083;
2SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,TianjinUniversity,Tianjin300072)
Abstract: Bioactivity ofbiomolecule isachieved through bio-molecularinteractions,and understanding the
relationshipsbetweenbiomolecularinteractionsisveryimportantforustoresearchanduncoverthemechanismsoflife
development.Thetechnologyofbiomolecularinteractionanalysisisasortofnew ofbiosensortechnologybasedon
surfaceplasmonresonance(SPR),whichcandetectbio-moleculesreal-timeasociationanddisociationwithoutbio-mark.
Theinformationofinteractivemodel,dynamicsconstantandsooncanbeacquiredfrom SPR sensorgram.SPR isa
powertoolofbiomolecularinteractionanalysis,andithasbeenwidelyappliedinlifescience.ThisarticlereviewsSPR
technologysprinciple,analyticmethodandrequirementsforfurtherdevelopmentinlifescience.
Keywords: Surfaceplasmonresonance(SPR) Biosensor Biomolecularinteraction
2008年第1期
介质 1接触界面上一部分发生反射,另一部分则透
射进介质 2,入射角和透射角之间满足关系式:
n1sinθ1=n2sinθ2 (1)
这里 n1是介质 1的折射率,n2是介质 2的折
射率。当入射角增大,增大到临界角 θc时,这时的
透射角为 90°;当入射角继续增大到大于临界角
时,光不再透射进介质 2,也就是发生了全反射。由
snel定律可知:
θ2=90° (2)
θc=arcsin(n2/n1) (3)
由上式可知,当 n2
反射时,光会在介质 1界面上完全反射而不进入介
质 2中。实际上,由于波动效应,有一部分光的能量
会穿过界面渗透到介质 2中,能量呈指数性衰减,
E=E0exp(-"/dp) (4)
dp为透射深度,(深度 dp约 1个波长),平行于
界面传播,
dp=
λ
2π
. 1
n
2
1.sin
2
θ-n
2
2!
(5)
这部分光场就是所谓的倏逝波(EvanescentWa
ve)。一般情况下倏逝波在折射率小的介质中传播
一段距离,再回到折射率大的介质,使光的全部能
量都回到第一介质中。如果在发生全反射的界面涂
上约一层 50nm厚的金膜(或其它金属膜),由于金
膜中有自由电子在平衡位置附近以一定的频率振
动,形成一种偏振的横磁波,即表面等离子波(Sur-
facePlasmonWave)。当入射光为偏振光且倏逝波的
频率(kX,是入射光频率及入射角的函数),
KX=
2π
λ
.n1.sin(θ) (6)
与金属表面振荡的自由电子频率(ksp),
Ksp=
2π
λ
.
n
2
gold.n
2
2
n
2
gold+n
2
2! (7)
一致时,金属表面的自由电子就吸收光能发生
共振,入射光能量被部分吸收,使反射光强度减弱,
反射光谱上出现共振峰,这时的入射角为共振角
(SPR角)(图 1[6])。当紧靠在金属薄膜表面的介质
介电特性改变时,SPR角的位置将发生变化,根据
SPR角的变化可以推断金属薄膜表面介质所发生
的变化。然而,折射率的变化引起的共振角的变化
是很微小的,溶液折射率改变 0.001单位才引起
0.1°共振角的变化,这就要求有足够精密的检测器
来准确测量这种微小的角度变化。
1.2 BIAcore仪器介绍[7]
SPR应用于生物分子相互作用的分析已经实现
了仪器的集成化,世界上有 BIAcore、NipponLasers、
Prolinx、IBIS等主要基于 SPR技术的仪器生产商,
由 BIAcore公司研发生产的 BIAcore系列 SPR生物
传感仪器得到广泛地应用。BIAcore系列 SPR仪器
主要由五部分元件组成:传感芯片、光学检测系统、
液体微射流系统、控温系统和计算机软件,其中传
感芯片是最为核心的组件。传感器芯片是实时信号
的传导载体,在玻璃片上覆盖了一层约 50nm厚的
金膜,在金膜的表面连有不同的多聚物以形成不同
的表面环境,以利于固定不同性质的生物分子。光
学系统由偏振光发生器和二极管列阵检测器组成,
760nm的偏振光楔形聚焦到传感芯片表面,检测器
实时地检测全反射光中共振角的变化。液体微射流
系统是一个多通道的微流通池,可以控制不同液体
流过芯片表面。温控系统保证了仪器系统在工作过
程中温度的恒定性,系统温度可以控制在 4~40℃
范围内。计算机软件系统实现了仪器各部件工作的
协调、自动化性及传感图谱的实时分析。
1.3 SPR技术分析分子间相互作用
SPR技术是基于 SPR原理的生物传感分析检
测技术,实时传感图谱的变化缘于靠近传感芯片表
面介质折射率的变化。对于多数分子来说,相同质
量的分子在界面引起的 SPR角的改变都是相当
的,因此 SPR监测的结果实际上是芯片表面物质
质量的变化。对于传感芯片的分子 1及溶液介质中
的分子 2,两者的化学和物理特性及溶液体系介电
图 1 表面等离子共振产生示意图[6]
黄汉昌等:SPR技术分析生物分子相互作用的研究方法 109
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
性质等决定了分子 2在传感芯片表面结合的质量,
两分子作用力强则分子 2在芯片表面含量高,反之
则低。除发生化学反应外,两分子也可以通过形成
氢键、疏水作用等形式结合,相互作用较强的有抗
体与抗原的特异结合作用、亲和素与生物素等的亲
和作用等。SPR技术主要应用于以下分析领域:分
子相互作用模式的研究;动力学常数的测定;亲和
常数测定及浓度的测量等,SPR技术应用于生命科
学研究的领域有:蛋白质组学研究、癌症研究、新药
研发、信号传递、分子识别、免疫调节、免疫测定法、
疫苗开发、瞬时结合、配体垂钓、结合特异性、结构
与功能的关系及酶反应等。无需借助标记物进行分
析使 SPR技术广泛应用于各类生物体系的测定,
分析样品类型从小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核
苷酸、寡聚糖到类脂、脂质体,甚至噬菌体、病毒和
细胞,研究分子之间有无结合以及相互作用的亲和
力强弱、结合/解离的快慢,分析结合位点和结合顺
序,并且寻找受体、配体、底物、疾病靶点等。
2SPR分析方法
2.1SPR实验操作技术
在 SPR实验分析中,先将生物分子 1中作为偶
联物(Ligand)固定于传感芯片表面,将与之相互作
用的分子 2作为分析物(Analyte)溶解于溶液流过
芯片表面,使之与偶联物发生结合作用;检测器实
时跟踪检测芯片表面共振角的变化情况,得到传感
图谱(Sensorgram),从传感图谱获取分析物与偶联
物结合、解离过程的信息(图 2[8])。传感图谱的单位
为 RU,1000RU的变化相当于共振角改变了 0.1
度。
典型的 SPR实验主要包括以下实验步骤[9]:
(1)准备偶联物和分析物,纯度高的偶联物有
利于特异结合的分析判断及结合参数分析
(2)选择合适的芯片并插入固定于仪器系统
(3)将偶联物固定于芯片表面,根据不同的分
析要求,固定相应的偶联物的量
(4)将分析物进样于芯片表面使之与偶联物结
合,记录传感图谱,
(5)再生芯片表面,选择合适的再生试剂(高盐
溶液、酸碱溶液等),去除与偶联物相结合的分析物
(6)分析传感图谱,获取相应的分子相互作用
信息
偶联物固定在传感器芯片表面是 SPR技术研
究生物分子相互作用的基础,目前偶联物在传感芯
片表面的固定方法主要有共价键交联法(氨基偶联
法、巯基偶联法及醛基偶联法等)和非共价交联法
(GST抗体-抗原标记固定、组氨酸-镍螯合法及亲
和吸附法等)[10],通过传感图谱能观察两种分子结
合的特异性,不仅能知道两种分子的结合有多强,
而且还能了解生物分子的结合过程共有多少个协
同者和参与者,可以得到用其他技术方法难以得到
的实验结果。对于蛋白质分析检测来说,1000RU
的传感单位变化相当于芯片表面蛋白浓度变化为
1ng/mm2。
第三分子的非特异吸附作用对特异性吸附分
子的相互作用的判断及作用强度带来影响,在 SPR
分析分子相互作用实验中,采用空白对照流体通
道,消除非特异吸附的影响。空白通道的传感芯片
为空白的、或经过活化并封闭的葡聚糖表面、或偶
联了非特意结合蛋白质的葡聚糖表面。
2.2 SPR结合动态分析及数据处理
SPR数据分析主要为结合过程曲线分析,从传
感图谱中提取结合反应动力学信息,其分析方法主
要包括建立结合数学模型及相应的数学模拟计算,
评价拟合结果。
分子相互作用的动力学过程主要的参数描述
为结合速率常数(Ka)、解离速率常数(Kd)及速率平
衡常数(KA=Ka/Kd)或解离速率平衡常数(KD=Kd/
Ka)。根据结合及解离速率快慢,采用不同的数学模
型,采用数学回归方法,拟合计 R算各参数值。图 2 分子相互作用传感图谱[8]
110
2008年第1期
2.2.1 动力学常数分析模式 1:1Langmuir模型:
对于较快结合慢解离的单分子结合动力学过程,可
以采用 1:1Langmuir模式进行数据拟合[11],
dR
dt
kaC(Rmax-R)-kdR (8)
R为 t时刻的 SPR响应单位,C为分析物浓
度,Rmax为最大 SPR响应单位。
解离速率方程为:
dR
dt
-kdR (9)
对于结合参数的模拟结果的优劣的评价,采用
拟合参量值或方差总和(χ2)作为参考标准。理想的
拟合结果为拟合参量值随即分布在噪音的 2～3RU
的两侧的范围内。一般而言,χ2值越小表示模拟结
果可信度越大。
黄汉昌等[12]将人免疫球蛋白偶联固定于 CM5
芯片表面,羊抗人免疫球蛋白流过芯片表面,得到
两者的特异结合曲线(图 3)。采用 1:1Langmuir模
型进行数据模拟计算,得到两者的结合速率常数
ka=1.0E+3M-1s-1,解离速率常数 kd=3.82E-3s-1,速率
平衡常数 KA为 2.6E+5M-1,χ2值为 58。
在 BIAevalution模拟软件中还提供了几种动力
学模型数学模拟程序,包括:受流速限制的 1:1
Langmuir模型(1:1bindingwithmasstransfer),多种
偶联物/分析物参与反应的平行/竞争反映模型
(Heterogeneous ligand-Paralel reactions/Heteroge-
neousanalyte-Competingreactions),分析物二价结合
偶联物模型(Bivalentanalyte)及复合物构型变化模
型(conformationchange)等。
2.2.2 亲和常数分析模式 稳态平衡分析模型(St-
eadystatefitingmethods):对于快结合快解离的动
力学过程,常采用稳态平衡分析模式求得动力学常
数。这种模式是根据不同浓度化合物进样后达到
平衡时的响应值(Req)作为参数,作出 Req-浓度的实
验曲线,从而求得结合平衡常数的测定,其公式为
[13]:
Req=
i
!Rmax,i.KA,j.C
1+i×KA,i.C
(10)
Rmax为最大 SPR响应单位,C为分析物浓度,i
表示结合位点数。
稳态平衡分析模式要求进行至少五组以上不
同浓度的分析物亲和曲线,且 Req的结果受偶联物
偶联量及分析物流速限制等多种因素的影响。
溶液亲和分析模型(SolutionAfinity):将已知
浓度的多组偶联物和固定浓度的分析物在溶液中
混合并孵化,使两者达到亲和平衡,将溶液通过偶
联有偶联物的芯片表面,通过标准曲线法测定溶液
中游离的分析物含量。有方程 (9)求得平衡常数
KD。溶液亲和分析模式的数据分析结果不受偶联物
偶联量及分析物流速限制的影响。
Atot=
(B-AKD)
2
+
(B+A+KD)
2
4
-AB" (11)
A表示游离分析物的浓度,Atot表示总的分析
物浓度,B表示偶联物的浓度。
3 SPR技术存在的问题
尽管 SPR技术在分子相互作用的生命科学中
得到迅速地发展及应用,但同时还存在一些有待进
一步解决的问题,面临一些技术方法上的挑战。(1)
传感芯片种类比较单一:目前应用于实验中的传感
芯片主要是葡聚糖及表面改性的葡聚糖芯片,有些
生物分子难于通过常用的固定方法固定于芯片表
面;(2)偶联物在芯片表面的固定:尽管目前已经发
展了共价键交联法及物理化学的固定方法,由于蛋
白质、DNA等生物大分子本身的复杂性,种类繁
多,理化性质不一,生物活性与空间结构密切相关,
然而,在芯片表面偶联物的固定位点具有一定的随
机性,偶联结果可能造成偶联物特异作用位点的失
活;(3)非特异性结合问题:分析物在芯片表面的非
特异性结合给实验带来干扰,有时甚至得到错误的
结论;(4)流体动力学问题:在微流动系统中,分析
物在芯片表面的结合过程受扩散系数及流体速率
等因素的影响;(5)小分子检测问题:由于小分子物
图 3 羊抗人免疫球蛋白特异结合传感图[12]
黄汉昌等:SPR技术分析生物分子相互作用的研究方法 111
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质质量变化对折射率变化不明显,这给小分子物质
的分析带来一定的困难和影响。
4 结束语
SPR技术作为研究生物分子相互作用的新技
术,已经逐渐地应用于分子间相互作用的众多领域
的研究,探索分子间有无结合以及相互作用的亲和
力、结合/解离的快慢,分析结合位点和结合顺序,
寻找受体、配体、底物、疾病靶点、分析目标组分的
浓度等。因此,其在蛋白质组学、信号转导、药物研
发、遗传学分析等生命科学领域的应用发展迅速,
其作用也日益重要。随着 SPR仪器和传感芯片技
术的不断发展和完善,结合各个领域研究的拓展,
SPR技术的应用将更加趋向多样化,具有广阔的发
展前景。
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