全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
酿酒酵母丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸酯酶的功能与调控
蒋伶活 1, 2 　于立权 2
(1天津医科大学 天津市基础医学研究中心 ,天津 300070; 2天津大学药物科学与技术学院 ,天津 300072)
　　摘 　要 : 　从酿酒酵母蛋白磷酸酯酶的分类和结构特征入手 ,阐述了该蛋白家族中的亚家族成员丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷
酸酯酶的功能和表达调控。深入研究酿酒酵母丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸酯酶 ,特别是 PP2C蛋白磷酸酯酶的细胞功能及其调
控 ,将对新药研发和疾病干预治疗提供重要基础。
关键词 : 　酿酒酵母 丝氨酸 /苏氨酸 蛋白磷酸酯酶 调控机制
Functions and Regula tion of Prote in Ser /Thr Phosphatases
in Saccha rom yces cerevisiae
J iang L inghuo 1, 2 　Yu L iquan 2
(1 Tianjin R esearch Center of B asic M edical Sciences, Tianjin M edical University, Tianjin 300070;
2 School of Pharm aceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072)
　　Abs trac t: 　This review first introduces the classification and structrual features of p rotein serine / threonine phosphatases in Saccha2
romyces cerevisiae. W e then focus on the research p rogress on the functions and regulation of the type 2C p rotein phosphatases
( PP2Cs). Understanding the mechanism s by which PP2C enzymes regulate cellular p rocesses would p rovide a basis for develop ing
drugs against human diseases.
Key wo rds: 　Saccharomyces cerevisiae　Ser/Ter　Protein phosphatase　PP2C
收稿日期 : 2009208224
基金项目 :国家自然科学基金 (30870107)
作者简介 :于立权 (19742) ,男 ,黑龙江人 ,博士研究生 ,主要从事微生物分子遗传学的研究 ; E2mail: yuliquanjy@ yahoo1com1cn
通讯作者 :蒋伶活 ,教授 ,博导 ,研究方向 :分子微生物学 ; E2mail: linghuojiang2@yahoo. com. cn
随着基因组学和蛋白质组学新型分析技术的不
断建立和细胞信号转导途径的持续探索 ,在信号转
导途径中发挥核心调控作用的蛋白质磷酸化过程已
经成为新药发现和疾病干预治疗最重要的研究方向
之一。蛋白质可逆磷酸化调控细胞中蛋白质磷酸化
的水平。现已研究发现 ,人类细胞中磷酸化的蛋白
质数量超过蛋白总数的 30% ,它们涉及到细胞生
长、增殖、分化、凋亡、形态建成、细胞周期和分解代
谢等许多细胞过程 [ 1, 2 ]。在这个可逆过程中负责控
制底物磷酸化状态的两类关键酶 ———蛋白激酶和蛋
白磷酸酯酶 ,理所当然地成为了人们进行药物设计
与开发时最感兴趣的靶标。与种类繁多、特异性高
和底物识别数量相对较少的蛋白激酶相比 ,蛋白磷
酸酯酶种类较少 ,但能够识别多种底物并具有重叠
酶活性 (即两种酶识别同一种底物 )。虽然蛋白磷
酸酯酶在 20世纪前后才得到高度重视 ,但是它们已
经在细胞功能评估和临床新药研发领域具有了潜在
的应用前景 [ 3 ]。由于各种生物中蛋白磷酸酯酶 ,特
别是丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸酯酶家族 ,具有广泛的
系统发育保守性。因此 ,通过研究酿酒酵母等模式
生物中蛋白磷酸酯酶的功能和表达调节 ,间接了解
人体细胞中蛋白磷酸酯酶潜在的细胞功能 ,特别是
疾病发生过程中蛋白磷酸酯酶的作用 ,可以更快地
为新药研发和疾病诊疗提供基础。
1　蛋白磷酸酯酶的分类和特征
酿酒酵母中蛋白磷酸酯酶存在于细胞的胞浆、
胞核和线粒体内 ,也能够以跨膜受体形式存在于质
膜上。根据蛋白磷酸酯酶氨基酸序列和三维结构的
相似程度 ,它们主要分为 3个家族 :酪氨酸蛋白磷酸
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
酶 (p rotein tyrosine phosphatase, PTP)、丝氨酸 /苏氨
酸蛋白磷酸酯酶 ( p rotein serine / threonine phospha2
tase)和双特异性蛋白磷酸酶 ( dual specific p rotein
phosphatase, DSP)。其中 , DSPs既能去除酪氨酸残
基上的磷酸基团 ,也能除去丝氨酸和苏氨酸残基上
的磷酸基团。根据酶对底物的特异性和对抑制剂的
敏感性以及对二价离子的依赖性 ,丝氨酸 /苏氨酸蛋
白磷酸酯酶又可分为 PPP和 PPM两个亚家族 ,能够
专一性地使丝氨酸 /苏氨酸残基去磷酸化 [ 4, 5 ]。
PPP家族包括 PP1, PP2A和 PP2B ( calcineurin)
3个亚族图 1,均具有各自不同的调节亚基 ,能形成
各式各样的全酶 ,这些酶在催化域的氨基酸序列上
具有 40%左右的相似性。PP1和 PP2A的酶活性不
依赖任何离子 ,对于肿瘤促进因子冈田酸 ( okadaic
acid, OA ) 和微囊藻素 ( m icrocystins) 敏感 , 但是
PP2B的酶活性却需要 Ca2 +作为辅因子。 PPP家族
的蛋白磷酸酯酶酶活性还能被非特异性蛋白酶抑制
剂 1和抑制剂 2所抑制 [ 5 ]。
图 1　酿酒酵母细胞中的丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸酯酶
PPM家族包括 2C类蛋白磷酸酯酶 ( PP2Cs)和
丙酮酸脱氢酶磷酸酯酶 ,其中最主要的就是 PP2C
蛋白磷酸酯酶。PP2C蛋白磷酸酯酶催化域的氨基
酸序列与 PPP家族没有显著同源性 [ 6 ]。序列分析
表明 PP2C家族成员有 11 个保守结构基序 (mo2
tif) [ 7 ]。与其他的丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸酯酶不
同 , PP2C家族成员是单体酶 ,其催化活性依赖于
Mg2 +或者 Mn2 + [ 8 ] ,受 NaF的抑制 [ 5 ] ,但对肿瘤促进
因子 OA和 PPP家族的其他抑制剂并不敏感 [ 9 ]。
2 丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸酯酶的功能
2. 1 细胞中 PP1蛋白的功能
PP1蛋白磷酸酯酶催化亚基序列在生物进化上
高度保守。酿酒酵母中仅含有一种为细胞存活所必
须的被命名为 Glc7的 PP1蛋白 [ 10 ]。Glc7参与细胞
中各种生理过程的调控 ,如糖原代谢 ,葡萄糖阻遏、
离子平衡、细胞周期循环、孢子形成、液泡融合、内吞
作用、多腺苷酸化终止和细胞壁完整性维持等 [ 11 ]。
酵母细胞 Glc7之所以具有如此多样的生物学功能 ,
在于 Glc7蛋白有许多结构多变的调节亚基 [ 12 ]。这
些调节亚基均含有 Glc7活性所必须的结合结构域
(R /K) (V / I) X ( F /W ) [ 13 ]。这种高度保守的结合结
构域 ,是细胞为严格控制由于 Glc7的过表达或超活
性引起的细胞毒害或致死效应进化而来的 ,能够为
胞内大量的 Glc7调控蛋白及一些表达抑制因子 ,如
YP I1等 [ 11 ]发挥生理功能提供结构上的支撑。
2. 2　PP2B (Calcineurin)蛋白的功能
PP2B ,即钙调磷蛋白磷酸酯酶 (Calcineurin) ,最
初是在哺乳动物的神经组织中以 Ca2 + /CaM的主要
结合蛋白形式被发现并予以冠名。Calcineurin结构
和功能高度保守 ,是由催化亚基 A、调节亚基 B和具
81
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 12期 蒋伶活等 :酿酒酵母丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸酯酶的功能与调控
有 EF手型结构的钙调蛋白相关结合蛋白组成的异
源二聚体 [ 14 ]。Calcineurin酶活性是以 Ca2 + /CaM结
合蛋白的形式被激活 ,进而调控 Ca2 +信号转导途径
中各种靶蛋白的磷酸化状态。酿酒酵母细胞中的
Calcineurin通过调控锌指型转录因子 CRZ1激活基
因表达 [ 15 ] ,为细胞内离子平衡调节所必须。Calci2
neurin缺陷型菌株 ( cmp1△cmp2△或 cnb1△)在含
有高浓度离子 ,如 Na+ 、L i+ 、Mn2 + 、OH - 等的培养
基中高度敏感 [ 16 ]。Calcineurin调控着酵母出芽早
期事件中相关的肌动蛋白的极性 , Calcineurin2Crz信
号途径为高渗透压甘油途径 (HOG途径 )负调控所
必须 ,在酵母细胞生长调节上相互拮抗 [ 17 ]。
2. 3 有丝分裂中的 PP2A蛋白
酿酒酵母基因组中编码 PP2A蛋白的基因遗传
体系庞大且高度保守。PP2A蛋白是由结构亚基 A、
催化亚基 C ( PP2Ac)和调节亚基 B组成的多亚基复
合酶 ,其中亚基 A仅仅由 TPD3单个基因编码 ,亚基
B由 CDC55和 R TS1两个不同的基因编码 , C亚基
是由两个相似的基因 PPH21 和 PPH22 编码。同
时 ,酿酒酵母细胞中还存在着许多 PP2A类似蛋白 ,
现已鉴定的 PP2A 类似蛋白有 3种 , SIT4、PPH3和
PPG1,它们在 C亚基的结构上与 PP2A 有所不同。
另外 ,还有一种 PP2A类似蛋白 ( TAP422PP2Ac) ,占
所有 PP2A 蛋白总量的 5% ～10% , TAP42也能与
SIT4或其他 PP2Ac结合成为第 3种形式的 PP2A类
似蛋白 [ 18 ]。
细胞周期结合转录因子 SW I4 /6调控细胞 G1
末期 G1周期蛋白的表达 ,研究发现 SIT4与 SW I4
的表达有关 ,在 G1 /S周期转换中非常重要 [ 19 ]。细
胞通透性药物神经酰胺能诱导酵母细胞生长抑制和
停止在 G1期 , PP2A 中的两个调节亚基 CDC55和
TPD3任何一个失活 ,都能使酵母细胞产生神经酰胺
抗性 [ 20 ]。酿酒酵母中 PP2A 正调控细胞周期 ,
PP2Ac条件性失活突变导致细胞 G2 /M 期转换延
迟 ,具有二倍 DNA 含量的细胞数量增加 ,纺锤体
变短 [ 21 ]。
遗传分析表明 ,含有 CDC55的 PP2A蛋白复合
酶与酵母中期到后期的转换和有丝分裂退出这两个
细胞周期阶段有关。CDC55缺失能部分抑制 cdc202
1缺失株细胞由于从中期到后期转换缺陷引起的温
度敏感表型 [ 22 ]。在温度敏感型突变株 cdc521中过
表达基因 CDC55、PPH21或者 PPH22均对细胞有毒
害作用 ,表现出有丝分裂退出缺陷表型 [ 23 ]。细胞周
期的最后阶段是胞质分裂 ( cytokinesis) ,这个细胞动
力学过程的重要步骤是芽颈上 sep tin环的形成。
cdc55和 tpd3缺失株细胞在低温下芽体伸长 ,表现
出与 sep tin缺失株细胞 cdc3、cdc10、cdc11 和 cdc12
相同的表型 ,表明 PP2A调控胞质分裂过程 [ 24 ]。
2. 4　PP2A对细胞周期检验点的调控
出芽是酿酒酵母最具特色的增殖过程。在细胞
周期过程中 ,芽形成事件与核分裂同步进行。为确保
正常传代和子细胞存活 ,酵母细胞进化了一套独特的
细胞周期检验点调控机制 ,来监控出芽过程和细胞核
分裂延迟 [ 25 ]。CDC3、CDC10、CDC11和 CDC12等这
些 Spetin 蛋白都是磷酸化蛋白 , 含有 CDC55 的
PP2A调控着这些 Spetin 蛋白的磷酸化水平 [ 26 ]。
CDC55在 sep tin环聚集的芽颈处累积 ,失活后能引
起 sep tin环发生紊乱 [ 27 ]。PP2A调控芽形成过程中
的萌芽、肌动蛋白极化和胞壁合成 ,这个过程任意一
个环节发生紊乱都会扰乱芽体生长进而激活细胞周
期检验点 [ 28 ]。
有丝分裂末期姊妹染色体分离依赖于纺锤体正
确整合到姊妹染色单体上。纺锤体检验点依赖于分
裂后期开始的精准延迟 , PP2A 同样涉及到这个过
程。 cdc55缺失株细胞与纺锤体检验点缺陷型细胞
一样 ,表现出对苯菌灵 ( benomyl)和噻氨酯哒唑 ( no2
codazole)超敏感 [ 29 ]。同样 , TPD3缺失也赋予细胞对
nocodazole超敏感 [ 23 ]。PP2A与调节亚基 RTS1一起
作为纺锤体定位检验点 ( sp indle position checkpoint
SPOC)调控组分 , PP2A2RTS1功能缺失会导致 SPOC
特异性流产 [ 30 ]。
2. 5　PP2Cs的功能和调控
与 PPP蛋白成员不同 , PP2C是单体酶。 PP2C
的催化活性虽然需要 Mg2 +或者 M n2 + ,但不受到这
些金属离子或者其他抑制性蛋白因子、调节因子
的调控 ,而受到组织或细胞类型的特异性表达、翻
译后修饰、亚细胞区室化或者自身的降解等方面
的调控。同其他的丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸酯酶
一样 ,它们在进化上高度保守 ,具有多种细胞功
能。比如 ,枯草芽孢杆菌中的一个 PP2C磷酸酯酶
91
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
Spo IIE,涉及到孢子形成过程中并调控不对称的细
胞分裂 [ 31 ] 。一个鼠的 PP2C磷酸酯酶 PP2Cδ的过
表达 ,能阻断细胞周期进程 [ 32 ] 。有报道 PP2C涉
及到哺乳动物和植物中的 Ca2 +信号转导和调控植
物中的气孔关闭 [ 33 ]。
目前 ,在酿酒酵母中发现的 PP2C蛋白磷酸酯
酶有 PTC1、PTC2、PTC3、PTC4、PTC5、PTC6 和
PTC7[ 9, 44 ]。已有研究表明它们涉及到细胞的生长
调控和压力等应激反应信号调控 ,通过去磷酸化作
用负调控蛋白激酶级联信号系统 ,参与细胞周期、胁
迫信号转导、基因转录、蛋白质翻译及翻译后修饰等
细胞活动。H2O2、不饱和脂肪酸、Ca2 + /CaM、脂质
信号分子等均可调节 PP2C的活性 [ 34 ]。尽管如此 ,
但对 PP2Cs各个成员特殊功能和调节机制方面的
了解还十分有限。研究较为广泛的 PTC1、PTC2和
PTC3参与酵母细胞 MAPK信号通路 ,负调控 HOG
途径。PTC1在维持 HOG1的基础水平活性和调节
渗透压两方面起着重要作用 [ 35, 36 ]。 PTC2和 PTC3
在高渗透压条件下限制 HOG1激酶的最大活性。
PTC4同样也可以将 HOG1去磷酸化 [ 9 ]。
PTC1缺失能够阻止转录因子 GLN3和 MSN2
的核内转运和雷帕霉素反应路径中的 NPR1激酶的
去磷酸化 ,为 Tor信号途径正常传递所必须 [ 37 ]。
PTC1能够促进马达分子肌球蛋白 V和液泡特异性
受体复合物之间联络 ,为液泡遗传所必须 [ 38 ]。
PTC2和 PTC3可以使依赖细胞周期的蛋白激
酶 CDC28去磷酸化 ,在 DNA check2point途径的调
节中起着重要的作用 [ 39～41 ]。同时 , PTC2和 PTC3
参与未折叠的蛋白反应过程 [ 42 ] ,在核酸内切酶诱导
的 DNA双链断裂后的回复和适应反应过程中也是
必须的 [ 41 ]。
PTC4和 PTC5也具有非常弱的依赖细胞周期
蛋白激酶 CDC28的去磷酸化活性 [ 39 ]。最近发现
PTC5还具有丙酮酸脱氢酶 ( PDH )的磷酸酯酶活
性 ,它存在于线粒体中 [ 43 ]。 PTC6定位在线粒体内
膜 ,与线粒体自噬 (m itophagy)有关 ,可能参与将线
粒体导入自噬体的信号传导过程。PTC6缺失后酵
母细胞仍能生长 ,但对 rapamycin的耐药性降低 [ 44 ]。
PTC7也存在于线粒体内 ,其转录过程受到碳源特别
是乙醇的调节 ,与氧气不充足条件下的碳源利用有
关 [ 45 ]。这些研究证实了酿酒酵母中的 PP2C与植
物、动物及人类中的 PP2C类蛋白的生理作用是相
似的 ,都能够精细控制 MAPK的量、定位和活性 ,都
能够整合不同途径下的信号转导并参与着它们的交
联过程。
3　小结与展望
综合以上研究证据足以看出 ,酿酒酵母细胞中
涉及可逆磷酸化过程的蛋白磷酸酯酶 ,特别是丝氨
酸 /苏氨酸蛋白磷酸酯酶家族中的 2C类蛋白磷酸
酯酶 ( PP2C) ,以调节蛋白的角色在细胞生长和压力
信号转导中发挥着重要作用。因此 ,以这些蛋白酶
的抑制或激活为研究入口 ,以蛋白质磷酸化调控和
蛋白质相互作用为研究导向 ,利用高通量筛选技术
发现活性肽 ,依据活性位点合成化学探针 ,钓取特异
条件下细胞生长过程的蛋白质组中疾病相关活性组
分。通过高通量基因缺失技术鉴定潜在的与致癌因
素密切联系的 MAPK相关蛋白磷酸酯酶 ,进行 MAPK
相关蛋白磷酸酯酶突变体的转录组和蛋白质组的大
规模分析 ,绘出 MAPK信号元件功能概略图谱。此
外 ,基于蛋白质结构进行计算机模拟筛选 ,搜索能够
发生对接作用的激酶或蛋白磷酸酯酶结构域中的对
接肽序列 ,揭示对接作用沟及相应肽基序特异性介
导的分子机理 ,人工合成出以蛋白磷酸酯酶为靶标
的特异性促效药物或拮抗药物。利用这些药物在体
内干扰蛋白磷酸酯酶的表达调控及其相互作用 ,能
够给人类各种疾病如心肌缺血和梗塞、脊髓损伤和
癌症以及艾滋病等这些疑难病症的治疗和改善带来
新的希望。
参 考 文 献
1 Johnson SA, Hunter T. NatMethods, 2005, 2 (1) : 17～25.
2 Tonks NK. Nat RevMol Cell B iol, 2006, 7: 833～846.
3 Cohen P. Nat Rev D rug D iscov, 2002, 1: 309～15.
4 Bedford D, Das AK, Egloff MP. Annu Rev B iophys B iomol Struct,
1998, 27: 133～164.
5 Cohen P. Annu Rev B iochem, 1989, 58: 453～508.
6 Cohen P, Cohen PT. J B iol Chem, 1989, 264: 21435～21438.
7 Bork P, B rown NP, Hegyi H. Protein Sci, 1996, 5 (7) : 1421～1425.
8 Stark MJ. Yeast, 1996, 12: 1647～1675.
9 J iang L,W hiteway M, Ramos C, et al. FEBS Lett, 2002, 527 ( 1～
3) : 323～325.
10 Feng ZH,W ilson SE, Peng ZY, et al. J B iol Chem, 1991, 266 (35) :
02
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 12期 蒋伶活等 :酿酒酵母丝氨酸 /苏氨酸蛋白磷酸酯酶的功能与调控
23796～801.
11 Pedelini L,Marquina M, A riÌo J, et al. J B iol Chem, 2007, 282 (5) :
3282～92.
12 Ceulemans H, Bollen M. Physiol Rev, 2004, 84 (1) : 1～39.
13 W akula P, BeullensM, Ceulemans H, et al. J B iol Chem, 2003, 278
(21) : 18817～23.
14 CyertMS. Annu Rev Genet, 2001, 35: 647～672.
15 Stathopoulos AM, CyertMS. Genes Dev, 1997, 11: 3432～3444.
16 Serrano R, Ruiz A, Bernal D, et al. MolM icrobiol, 2002, 46: 1319～
1333.
17 Shitamukai A, H irata D, Sonobe S, et al. J B iol Chem, 2004, 279
(5) : 3651～61.
18 D i Como CJ, A rndt KT. Genes Dev, 1996, 10: 1904～1916.
19 Igual JC, Johnson AL, Johnston LH. EMBO J, 1996, 15: 5001
～5013.
20 N ickels JT, B roach JR. Genes Dev, 1996, 10: 382～394.
21 Evans DR, Stark MJ. Genetics, 1997, 145: 227～241.
22 W ang Y, Burke DJ. Mol Cell B iol, 1997, 17: 620～626.
23 W ang Y, Ng TY. Mol B iol Cell, 2006, 17: 80～89.
24 Ford SK, Pringle JR. Dev Genet, 1991, 12: 281～292.
25 Lew DJ. Curr Op in Genet Dev, 2000, 10: 47～53.
26 Versele M, Thorner J. J Cell B iol, 2004, 164: 701～715.
27 Dobbelaere J, Gentry MS, Hallberg RL, et al. Dev Cell, 2003, 4: 345
～357.
28 W ang H, J iang Y. Mol Cell B iol, 2003, 23: 3116～3125.
29 M inshull J, Straight A, Rudner AD, et al. Curr B iol, 1996, 6: 1609～
1620.
30 Chan LY, Amon A. Genes Dev, 2009, 23 (14) : 1639～49.
31 Duncan L, A lper S, A rigoni F, et al. Science, 1995, 270: 641～644.
32 Tong Y, Quirion R, Shen SH. J B iol Chem, 1998, 273: 35282
～35290.
33 Leung J, Bouvier - Durand M,Morris PC, et al. Science, 1994, 264:
1448～1452.
34 Lammers T, Lavi S, Crit Rev B iochem Mol B iol, 2007, 42 ( 6) : 437
～461.
35 Gonzalez A, Ruiz A, Serrano R, et al. J B iol Chem, 2006, 281 (46) :
35057～35069.
36 Young C,Mapes J, Hanneman J, et al. Eukaryot Cell, 2002, 1 ( 6 ) :
1032～1040.
37 Gonz lez A, Ruiz A, Casamayor A, et al. Mol Cell B iol, 2009, 29
(10) : 2876～88.
38 J in Y, Taylor Eves P, Tang F, et al. Mol B iol Cell, 2009, 20 ( 5 ) :
1312～23.
39 Cheng A, Ross KE, Kaldis P, et al. Genes Dev, 1999, 13 (22) : 2946
～2957.
40 MarsolierMC, Roussel P, Leroy C, et al. Genetics, 2000, 154 ( 4 ) :
1523～1532.
41 Leroy C, Lee SE, Vaze MB, et al. Mol Cell, 2003, 11 ( 3 ) : 827
～835.
42 W elihinda AA, Tirasophon W , Green SR, et al. Mol Cell B iol, 1998,
18 (4) : 1967～77.
43 Krause - buchholz U, Gey U, W unschmann J, et al. FEBS Lett,
2006, 580 (11) : 2553～2560.
44 Ruan H, Yan Z, Sun H, et al. FEMS Yeast Res, 2007, 7: 209～215.
45 Ramos CW , Guldener U, Klein S, et al. IUBMB L ife, 2000, 50 ( 6) :
371～377.
12
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net