全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
牛蛙抗菌肽的生物信息学分析
邬晓勇 孙雁霞 何钢 颜军 苟小军
(成都大学生物产业学院,成都 610106)
摘 要: 对 NCBI公布的牛蛙抗菌肽序列进行了生物信息学方面的分析。结果表明, 牛蛙抗菌肽基因可能属于诱导性
表达, 存在多个可能的功能域, 在进化上高度不保守。二级及空间结构分析结果表明,牛蛙抗菌肽属于典型的 螺旋型抗菌
肽, 并且均属于信号肽。通过对牛蛙抗菌肽的分析, 可为抗菌肽类药物的分子设计和构造提供重要的理论依据和快捷
的途径。
关键词: 牛蛙 抗菌肽 生物信息 分子设计
Bioinformatics Analysis of Bullfrog Antibacterial Peptides
W uX iaoyong Sun Yanx ia H e Gang Yan Jun Gou X iao jun
(Faculty of Biotechno logy Industry, Chengdu University, Chengdu 610106)
Abstrac:t B io in fo rm atics ana lysis o f the Bullfrog antibacter ia l peptides released on the NCBIThe resu lts show ed that the gene of
bullfrog s antibacter ia l peptidem ight be long to induce expression, and there are severa l possib le func tiona l dom a ins in the peptides and
not conservative in evo lutionar ilyThe second and spatial structure ana lysis show ed that the bu llfrog s antibacter ia l peptides a re of typ i
ca lhelica l peptides and be long to the signal peptideThe ana lysis results can prov ide im po rtant reference for mo lecu lar design and
construction of peptide type drug s
Key words: Bu llfrog Antibacter ia l peptide B io info rm atics Molecu lar design
收稿日期: 20100115
基金项目:四川省科技发展项目 ( 2006J13016)
作者简介:邬晓勇,男,博士,讲师,研究方向:生物天然产物及功能蛋白的分离纯化; Em ai:l w uxiaoyong@ cdu. edu. cn
抗菌肽是一类广泛存在于植物和动物体内的小
分子多肽,在生物天然免疫和获得性免疫中发挥着
重要作用。国内外研究成果表明 [ 2, 3 ] , 抗菌肽对细
菌、真菌、原虫、病毒及癌细胞均有很强的杀伤作用,
且具有高效、低毒、无污染等特点, 极有可能成为新
一代绿色环保的抗菌新药物 [ 4]。然而, 天然抗菌肽
的提取过程非常复杂,且抗菌肽的天然资源有限,通
过基因工程方法虽然可以大量生产抗菌肽, 但是产
量及成本仍然存在瓶颈 [ 5]。
可喜的是, 结构和活性的关系为抗菌肽分子的
设计和构造提供了重要的理论依据 [ 6, 7]。抗菌肽是
小分子,易于合成, 便于改造,目前利用计算机建立
数据库对已存在的抗菌肽分子结构与活性关系进行
深入研究与总结,设计出具有特定性质的新型抗菌
肽,验证其抑菌、抑瘤活性,进行毒理学研究之后,用
基因工程的方法就可以获得大量的产品。因此,利
用生物信息学手段对牛蛙抗菌肽的结构和功能等进
行预测和分析,可为牛蛙及及其他抗菌肽类的新药
开发提供一条捷径 [ 8]。
1 材料与方法
11 材料
分析用的牛蛙抗菌肽均来源于 NCB I中已注册
的核酸及蛋白序列。抗菌肽序列及相应的登录号见
表 1。
12 方法
用 Pro tparam分析蛋白质的理化性质 (氨基酸
组成及稳定性 ) ;用 S igna lP 30 Server进行信号肽分
析; 用 TargetP进行导肽分析; 用 SOPMA和 Pred ict
prote in预测二级结构; 用 Pro tScale进行蛋白的疏
水 /亲水性分析;用 Pfam HMM search在线预测蛋白
的功能域;用 Pro tfun 20 Server分析蛋白质功能等;
多序列比对采用 C lustalX183进行;利用 Cn3D 41
2010年第 8期 邬晓勇等: 牛蛙抗菌肽的生物信息学分析
软件构建抗菌肽的空间结构。
2 结果与分析
21 牛蛙抗菌肽的一级结构
应用 Pro tparam软件对 NCBI上公布的 11种牛
蛙抗菌肽序列进行分析, 结果见表 1。由表 1可以
看出, 11种牛蛙抗菌肽序列均由基本氨基酸组成,
但均不含组氨酸 (H )和色氨酸 (W ) , 因此受 pH的
影响小 [ 7]。其中, Ranalex in抗菌肽中还不含有谷氨
酰胺 (Q )和酪氨酸 ( Y )。其余 5种抗菌肽 ( Ranatu
erin4、 temporin1C c、 ranatuerin7、 ranatuerin8 和
temporin1Cb)除不含 H和W 外, 还不含 Y; 依据稳
定性值大于 40为不稳定蛋白的标准, 11种牛蛙抗
菌肽中除 3种 ( Ranatuerin4、ranatuerin5C a和 Rana
lex in)为不稳定外,其余均为稳定蛋白。
表 1 牛蛙抗菌肽的理化性质
序
号 抗菌肽名称 登录号 稳定性 氨基酸组成
1 R anatuerin4 GenBank: ACO51651. 1 47. 20不稳定 不含 H、W、Y
2
ranatu erin
5Cb1
GenBank: ACR84082. 1
38. 88
稳定 不含 H、W
3
ranatu erin
5Ca
GenBank: ACR84080. 1
40. 80
不稳定 不含 H、W
4
temporin
1Cc
GenBank: ACR84090. 1
35. 58
稳定 不含 H、W、Y
5
ranatu erin
5Cb2
GenBank: ACR84084. 1
37. 49
稳定 不含 H、W
6
ranatu erin
5Cb3
GenBank: ACR84081. 1
36. 41
稳定 不含 H、W
7 ranatu erin5 GenBank: ACR46977. 1 36. 41稳定 不含 H、W
8 ranatu erin8 GenBank: ACR46976. 1 34. 09稳定 不含 H、W、Y
9 R analex in Sw issProt: P39084. 1 43. 50不稳定
不含 Q、H、
W、Y
10 ranatu erin7 GenBank: ACR46974. 1 34. 87稳定 不含 H、W、Y
11 temporin1Cb GenBank: ACR84089. 1 37. 96稳定 不含 H、W、Y
22 信号肽及导肽分析
在核糖体上新合成的多肽被送往细胞的各个部
分以行使各自的生物学功能。信号肽指的是指导蛋
白质寻靶的任何一段连续的氨基酸序列。信号肽一
般由一段高度疏水的氨基酸组成,位于新生肽的 N
端, 长度为 13- 26个氨基酸残基。用 SignalP 30
Server和 TargetP工具在线分析表明, 11种牛蛙抗菌
肽均属于信号肽,且信号肽酶切位点均位于第 22 -
23个氨基酸 SLCEE之间 (只有 Ranatuerin4为
SFCEE)。
由图 1可知, 11种抗菌肽的信号肽均位于抗
菌肽蛋白的 N端, 长度为 22个氨基酸残基, 且疏
水性均很强。并且 11个信号肽序列酶切位点上
游的第一个 ( - 1)及第三个 ( - 3)氨基酸均为丝
氨酸 ( S)和半胱氨酸 ( C ) , 而这两个氨基酸都具
有很小的侧链, 符合信号肽的概念。信号肽与导
肽分析结果表明, 牛蛙 11种抗菌肽均属于分泌
型蛋白, 进一步说明抗菌肽是生物体内经诱导产
生的一种生物活性小分子多肽, 因此在牛蛙体内
含量极少。
23 二级结构分析
多肽链借助氢键排列成沿一维方向而呈现有规
则的重复构象的二级结构,借助范德华力、氢键、静
电和疏水等相互作用形成蛋白质的更高一级结构,
从而发挥正常的生物学功能。采用 SOPMA和 Pre
d ictProte in分析牛蛙抗菌肽结果 (图 2)均表明, 11
种抗菌肽的二级结构中 螺旋是最主要的结构, 是
典型的 螺旋型抗菌肽, 而这种两亲性的 螺旋
有利于抗菌肽与细胞膜的相互作用, 从而发挥抗菌
功能。有研究者认为 N端的 螺旋结构域也很重
要, 可维持抗菌活性 [ 6]。
24 成熟肽的疏水性 /亲水性分析
信号肽引导抗菌肽到达作用部位, 而起主要抗
菌作用的是成熟肽。用 ProtSca le进行疏水 /亲水性
分析 (图 3)表明, 11种成熟肽 N端均表现出极强的
亲水性,而 C端则是极强的疏水性 (只显示一个图,
其余均与此图相似 )。疏水性在抗菌肽插入脂质双
分子层过程中起关键作用。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
分析结果表明,信号肽均带有正电荷,因此可顺
利引导抗菌肽到达细胞质膜上。之后成熟肽的亲水
性结构域 ( N端 )与质膜上磷脂的头部通过静电相
互作用结合,同时疏水性结构域 ( C端 )与磷脂的尾
部通过疏水相互结合,二者的共同作用使抗菌肽在
细菌质膜上形成离子通道, 细菌最终不能保持正常
渗透压而死亡。
代^表信号肽的酶切位点
图 1 牛蛙抗菌肽序列信号肽分析结果
C.无规则卷曲; H. 螺旋; T. 转角
图 2 牛蛙抗菌肽的二级结构
图 3 成熟肽的疏水性 /亲水性分析
25 抗菌肽的功能域及保守结构域分析
不同的功能域具有特定的功能,如结合底物、催
化反应及活性调节等 [ 9]。采用 Pfam在线工具对 11
种牛蛙抗菌肽进行了分析,结果见表 2。
由表 2可知, 11种牛蛙抗菌肽均含有 B reven in
功能域,且均位于 2- 46个氨基酸残基, 揭示牛蛙抗
菌肽具有共同的功能。而 R anatuerin4和 R ana lex in
均含有两个功能域 B reven in和 Antim icrob ial_ 1,
Breven in家族主要包括两栖类皮肤分泌的阿片类
( opiatelike)及抗菌类的 dermo rph ins和 de ltorph ins;
Antim icrob ial_1超家族主要包括从青蛙皮肤分泌出
来的抗菌肽 [ 10]。
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2010年第 8期 邬晓勇等: 牛蛙抗菌肽的生物信息学分析
表 2 牛蛙抗菌肽的功能域分析
抗菌肽名称 家族 起始 分值
Ranatuerin4
Breven in 2- 46 61. 2
An tim icrob ial_1 47- 70 45. 7
ranatuerin5Cb1 Breven in 2- 46 68. 9
ranatuerin5Ca Breven in 2- 46 68. 9
temporin1C c
Breven in 2- 46 65. 2
TBX(不显著 ) 42- 65 12. 6
ranatuerin5Cb2 Breven in 2- 46 69. 3
ranatuerin5Cb3
Breven in 2- 46 66. 3
TBX(不显著 ) 42- 66 12. 8
ranatuerin5 Breven in 2- 46 64. 9
ranatuerin8 Breven in 2- 46 64. 9
Ranalexin
Breven in 2- 46 67. 8
An tim icrob ial_1 47- 66 26. 9
ranatuerin7
Breven in 2- 46 65. 8
TBX(不显著 ) 42- 67 13. 4
temporin1C b Breven in 2- 46 69. 2
分析结果还显示, temporin1C c、ranatuerin5Cb3
和 ranatuerin7三种抗菌肽中可能还具有不明显的
TBX ( Tbox DNA结合域 )超家族功能域 (可能性分
值分别为 126、128和 134) , 因此这 3种抗菌肽
可能还具有结合 DNA, 对基因转录和调控的作用。
然而, 保守结构域分析 (图 4)表明, 只有 ranatuerin
5Cb1和 R ana lex in存在两个完全不同的保守结构
域,其余 9种均无。
图 4 ranatuerin5Cb1(A )和 Ranalex in( B)的
保守结构域分析
功能域及保守结构域分析均表明, 11种牛蛙抗
菌肽在进化上高度不保守 [ 11 ] ,但在功能上却非常相
似。用 Pro tfun分析 11种抗菌肽的功能, 结果表明,
11种抗菌肽均为作用于细胞膜上的应急反应所产
生的激素类似物质,因而可在极低浓度下与受体结
合, 不参加具体的代谢过程, 只对特定的代谢和生理
过程起调节作用。因此牛蛙抗菌肽基因可能属于诱
导型表达,更进一步说明抗菌肽是经诱导产生的一
种生物活性肽。
26 切除信号肽后的多序列比对
多序列比对主要用于描述一组序列之间的相似
性关系,以便对序列的特征有一个简明扼要的了解。
利用 C lusta lX183软件对牛蛙抗菌肽的成熟肽进
行了多重比对,结果见图 5。
图 5 牛蛙抗菌肽的成熟肽多重比对结果
比对结果表明, 11种成熟肽的序列在 N端较 C
端有较高的相似性,但是无论 N端或 C端均有利于
形成螺旋结构。研究表明 [ 6] , 高的螺旋度可提高抗
菌肽对膜的亲和力, 提高抗菌活性。这也为抗菌肽
的人工设计提供了一定的理论依据。
27 成熟肽的空间结构
蛋白质结构与功能关系研究是进行蛋白质功能
预测及蛋白质设计的基础。蛋白质分子只有处于它
自己特定的三维空间结构情况下, 才能获得它特定
的生物活性;三维空间结构稍有破坏,就很可能会导
致蛋白质生物活性的降低甚至丧失。
利用 Cn3D 41模拟空间结构显示 (图 6),成熟
肽的 N端和 C端均含有 螺旋。结合二级结构的
分析结果, 牛蛙抗菌肽属于 螺旋型抗菌肽, 而这
也可能是牛蛙抗菌肽有效性的结构基础,因此可以
考虑从这方面入手人工设计抗菌肽。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
图 6 牛蛙成熟肽的空间结构
3 结论与讨论
对 NCB I公布的 11条牛蛙抗菌肽序列作的生
物信息学方面的分析表明, 牛蛙抗菌肽均为亲水性
小肽。导肽及信号肽分析表明,牛蛙抗菌肽均属于
信号肽,且切割位点均位于第 22- 23个氨基酸之
间。二级及空间结构分析结果显示, 牛蛙抗菌肽是
典型的 螺旋型抗菌肽。功能域及保守结构域分
析表明,牛蛙抗菌肽在进化上高度不保守,推测其基
因属于诱导性表达, 这也是常规抗菌肽提取过程经
常需要诱导的原因。
通过对牛蛙抗菌肽的分析,认为 螺旋是牛蛙
抗菌肽有效性的结构基础。由于牛蛙抗菌肽均是小
分子, 很容易人工合成。因此, 利用生物信息学手段
对已存在的抗菌肽分子结构与活性关系进行深入研
究与总结,可设计出具有特定性质的新型抗菌肽,再
用基因工程的方法就可以获得大量的产品。所以在
传统抗生素耐药性无法解决的今天, 无疑会为抗菌
肽类药物的开发提供一条快捷的途径,从而避免了
基因工程方法中出现的瓶颈问题。
参 考 文 献
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