全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
口蹄疫细胞免疫研究进展
杜进鑫 1, 2 王永录 1
( 1中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室,
兰州 730046; 2甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070 )
摘 要: 口蹄疫是世界性重大动物疫病之一, 接种疫苗是预防该病的重要策略之一。随着对口蹄疫疫苗及其免疫特性
的深入研究和探讨, 许多学者对口蹄疫细胞免疫机制的研究更进了一步, 就参与口蹄疫细胞免疫的各类细胞及细胞免疫与新
疫苗设计的研究进展作一综述。
关键词: FMD 细胞免疫 进展
New Research Progress of Cellular ImmuneM echanism
of Foodandmouth Disease
Du Jinxin
1, 2 W ang Yonglu1
(
1
K ey Laboratory of Animal Viro logy of A griculture, S tateK ey Laboratory of Veterinary Etioligical B io logy, Lanzhou Veterinary R esearch Institute,
Chinese A cademy of A gricultural Sciences, Lanzhou 730046;
2
Co llege of VeterinaryM edicine Gansu Agricutural University, Lanzhou 730070)
Abstrac:t Foo tandm ou th disease is one of serious an im a l d iseasesVacc ination is one o f the sign ificant preventativem easures
W ith the study and exploration of vaccines o f FMD and their immune m echan ism, m any researchers have taken furthe r step to study the
ce liular imm unem echanism of FMD Th is paper summ arized various types o f imm une ce lls partic ipating the ce llu lar imm une of FMD
and the new research prog ress o f FMD vacc ine design invo lv ing ce llu la r immune m echan ism
Key words: FMD C ellular vaccine P rogress
收稿日期: 20081016
基金项目:国家支撑计划项目 ( 2006BAD06A06)
作者简介:杜进鑫 ( 1982) ,男,甘肃靖远人,在读硕士研究生,从事动物病毒分子免疫学研究; T e:l 09318343719
通讯作者:王永录, Te:l 09318343796, Em ai:l Wyonglu@ yahoo com cn
口蹄疫是由口蹄疫病毒 ( foot and mouth d isease
v irus, FMDV )引起的急性、热性、高度接触性的传染
病。FMDV属于小 RNA病毒科, 口蹄疫病毒属, 其
基因组 RNA全长约 8 500 n,t依次由 5UTR、ORF和
3UTR组成,其中 5UTR长约 1 300 n,t含有 VPg二
级结构、po ly ( C )区段和内部核糖体进入位点等;
ORF长约 6 500 n,t由 L基因、P1结构蛋白基因、P2
和 P3非结构蛋白 ( 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C和 3D)基
因以及起始密码子和终止密码子组成,其中 P1结构
蛋白基因编码 4种主要的衣壳蛋白, 即 VP1、VP2、
VP3和 VP4, VP13组成衣壳蛋白亚单位, VP4位于
病毒颗粒内部, 他们是制备 FMD疫苗的抗原成分;
3UTR长约 172 n,t由 poly ( A )以及 po ly( A )和 P3
区之间的碱基组成。
一般认为动物机体针对 FMDV的抗感染免疫
主要与高水平的抗体有关, 但细胞免疫在口蹄疫免
疫应答中也扮演着非常重要的角色。口蹄疫病毒易
发生变异,在感染的细胞表面会出现新的抗原,这给
免疫带来了挑战。一般来说参与抗口蹄疫感染的免
疫细胞主要有: ( 1)单核细胞和巨噬细胞, 是天然免
疫防御中急性炎症反应阶段的主要效应细胞; ( 2)
细胞毒性 T细胞,能特异识别病毒和感染细胞表面
的病毒抗原,杀死病毒或裂解感染细胞; ( 3)致敏的
T淋巴细胞及其释放的淋巴因子, 具有破坏病毒活
力或增强巨噬细胞吞噬的能力。口蹄疫病毒常常能
逃避宿主的免疫反应而呈持续感染状态,带毒者可
在自然状态下传播病毒。病毒的传播受 FMDV变
异, 入侵部位, 感染病毒的数量宿主易感性等因素的
2009年第 5期 杜进鑫等:口蹄疫细胞免疫研究进展
影响。虽然目前有关 FMD细胞免疫机制尚不完全
清楚, 但 FMDV抗原表位研究, 新疫苗的设计等的
研究都要涉及到细胞免疫, 所以有必要就针对 FM
DV的细胞免疫机制作更进一步地研讨。
1 吞噬细胞
在天然防御中, 巨噬细胞在缺乏特异性抗体的
情况下能直接与 FMDV相互作用,接种一周就可观
察到巨噬细胞的增殖, 因此动物紧急接种 4 d之内
的保护可能与巨噬细胞有关。巨噬细胞能将病毒控
制在机体的某一部位,直到特异性抗体的产生。巨
噬细胞参与抗体调理作用, FMDV免疫成败的关键
依赖于巨噬细胞与抗原抗体复合物的相互作用,
FMDV特异性抗体改变其 Fc片段的结构与 FMDV
作用形成复合体,并与巨噬细胞的 Fc受体 ( FcR)结
合,还可结合第二个抗体, 当第二个抗体和相邻的另
一 FcR结合时, 形成交叉连接,刺激巨噬细胞进行
吞噬作用,吞噬体与细胞浆中的溶酶体融合成吞噬
溶酶体, FMDV被其中的酶破坏, 进而丧失感染性。
巨噬细胞拥有两个 FcR均以高亲合力的方式结合
IgG抗原复合物, IgA的 FcR也存在于吞噬细胞中,
并以一种相似的方式 FcrR作用, 这在黏膜免疫中
很重要。当两个 FcR在同一个抗体FMDV复合物
中交联时, 使 FcrR的构象发生变化, 在适宜的 pH
值条件下,被吞噬的病毒和降解酶相接触后,经一连
串的与早期和晚期的核内体、溶酶体相互作用,使病
毒逐渐降解掉,但需要的时间较长。Baxt等 [ 1]报道
FMDV可通过抗体依赖增强作用进入带有 Fc受体
的细胞系,并且在巨噬细胞内进行限制性的复制,这
种感染机制导致动物持续感染和病毒成为持续不断
的感染源; FMDV也可在巨噬细胞不完全吞噬的情
况下被所谓的 运输病毒 的巨噬细胞带到动物机
体的其它部位,在这些组织的细胞内继续复制,导致
感染 [ 2]。此外,用常规的 FMD疫苗对猪进行免疫,
被免动物在免疫初期并没有出现强烈的系统炎症反
应,而在免疫后的第一周内,外周血液白细胞的血浆
的趋化作用增加,而且免猪和豚鼠血浆中白细胞介
素 6( IL6) , IL8和 IL12都有增加, 由此表明了吞
噬细胞的活性。尽管 IL6和 IL8的水平不能对攻
毒的猪进行保护,但 IL12的水平较高,能够保护病
毒攻击。
巨噬细胞吞噬掉 FMDV需要很长时间, 这在缺
乏抗体的情况下是一种重要的防御机制。与免疫动
物相比,自然感染的动物体内吞噬细胞的吞噬率仍
然很低,其差异归因于病毒粒子的特异性抗体,特异
性抗 FMDV抗体的存在可促进巨噬细胞对病毒的
破坏。此外,巨噬细胞在吞噬的过程中受到损伤时,
破坏病毒的能力就会下降。
2 细胞毒性 T细胞
细胞毒性 T细胞 ( CTL)为 CD8+ T细胞亚群, 其
作用主要是直接接触靶细胞, 杀伤和溶解靶细胞。
CTL在动物体内以非活化的前体形式存在, 其表面
的抗原受体 ( CTR)能识别由抗原呈递细胞 ( APC)呈
递而来的内源性抗原。 CTL与抗原特异结合后, 在
致敏 Th细胞产生的白介素 ( IL4, IL6, IL9等 )的
作用下,使 Tc前体细胞活化增殖, 分化为具有杀伤
能力的效应性 CTL。CTL与病毒感染细胞间的作用
会导致病毒感染的细胞在病毒复制前死亡, 终止病
毒的合成与释放。例如, 相关研究证实, 在 FMDV
重组痘苗免疫动物的脾细胞中检测到 FMDV特异
性 CTL反应, 但这种细胞活性较低, 对这一现象的
发生可能是由于 FMDV感染的细胞膜上 MHC肽复
合物表达水平较低, 从而导致结合 MHC分子的病
毒肽无法有效递呈。CTL反应在 FMDV感染上皮
细胞的早期发挥作用,但 FMDV的感染会导致 MHC
类分子在易感细胞上表达的快速减少,这会抑制
FMDV感染过程中细胞递呈病毒肽到 CTL作用, 从
而有利于病毒从宿主的特异性抗病毒反应中逃逸。
Barfoed等 [ 5 ]用带有 FMDV非结构蛋白 2C的 DNA
接种 Balb /c小鼠, 试验结果证实, 2C 蛋白含有
CD8
+
T和 CTL的显性表位。在 FMDV感染的牛外
周血单核细胞中分离到 CD4+ T效应细胞,该细胞在
抗病毒感染时无 MHC限制, 并且与鼠大颗粒淋巴
细胞具有相同的表型和功能特征, 经试验进一步证
实, 该细胞为牛的细胞毒性淋巴细胞,它能明显降低
FMDV的复制。用 FMDVP1免疫牛得出后, 其外周
血淋巴细胞中 CD8+ T细胞明显增加, 且 T细胞对
VP1的识别是血清特异的。这说明了 CD8+ T细胞
参与了对 FMDV的防御,在口蹄疫感染后的第 10 ~
14 d均能检测到 CD8+ T细胞, 且一直持续了 3 ~
4周。
15
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
3 迟发型变态反应性 T细胞 ( Td)和辅助性
T细胞 ( Th)
Td、Th均属于 CD4+ T细胞亚群, 前者通过释放
多种淋巴因子发挥免疫作用,主要表现为以局部单
核细胞侵润为主的炎症反应,即迟发型变态反应;后
者主要协助其它免疫细胞发挥功能,辅助 B细胞分
化和合成抗体, 增加其它 CD8+ T细胞的增殖功能,
使其更好的发挥杀伤靶细胞的功能, 协助巨噬细胞
产生迟发型变态反应。
很多有关抗 FMD的 T细胞研究结果来自对合
成肽研究,合成肽的低免疫原性与缺乏 Th细胞表位
有关, 而通过增加额外的 Th细胞表位可以克服 FM
DV反应的 MHC限制性。在牛体免疫试验中发现,
FMDV T细胞表位是血清型交叉反应性的, 在 VP1
的 21~ 40氨基酸序列上存在 T细胞免疫优势位点。
Rodrguez等 [ 3 ]研究证实在猪上 VP1第 141~ 209位
氨基酸残基存在 FMDV Th细胞位点,该位点能克服
牛 MHC的遗传限制。 GarcaBriones等 [ 4 ]用含有
FMDV聚合酶 3D的重组鸡痘病毒接种猪,后用同源
病毒攻击,部分获得保护, 而用异源病毒攻击时不保
护。经淋巴细胞增殖试验检测得出,对 FMDV3D蛋
白识别的 T细胞属于 Th细胞亚群, 3D蛋白包含能
有效的识别猪 T淋巴细胞的表位,而异源病毒相对
于接种的重组鸡痘病毒的 3D来说不能获得保护。
这些表位能增加亚单位苗和合成肽苗的 T细胞表
位数量,从而为构建更加有效的疫苗奠定基础。
4 细胞免疫与新疫苗设计
由于传统 FMD灭火疫苗有自身的一些缺陷,如
灭活不完全,可能引起散毒和不能产生交叉保护等,
所以研制更加高效安全的新型疫苗就十分必要,现
要国内外很多学者都致力于新型 FMD疫苗研究,并
已取得了一定的进展。口蹄疫细胞免疫研究与新型
疫苗的设计相辅相成,有效 FMD疫苗的开发很有必
要涉及细胞免疫机理。随着分子生物学技术的进
步,设计核酸疫苗、多肽苗和多表位疫苗都要涉及到
细胞免疫,尤其是 T细胞和 B细胞。
41 细胞免疫与 DNA疫苗
DNA疫苗也称基因疫苗,是将抗原编码基因插
入质粒载体,再加上佐剂制成。接种动物以后, DNA
疫苗抗原编码基因即在细胞内合成抗原蛋白, 诱发
机体产生保护性免疫反应, 这些免疫反应包括抗原
特异性的细胞毒性 T细胞 ( CTL)和中和抗体的产
生。CTL对成功防御细胞内的抗原是非常重要的,
而蛋白亚单位疫苗则缺乏 CTL反应, 这一特点是
DNA疫苗较其他蛋白疫苗的优点之一。 Bo rrego
等 [ 6]设计了含 FMDV VP1( 133~ 156) 3A ( 11~ 40)
VP4( 20~ 34)的质粒 pCMV, 这 3个区段分别含有
BTT细胞表位,将此质粒与泛素融合后接种小鼠, 后
用同源病毒攻击, 50%获得保护,在获得保护的小鼠
体内检测到了肽特异性的 CD4+ T细胞,说明表达 B
细胞和 T细胞位点的核酸疫苗在缺乏体液免疫的
情况下能是动物免受 FMDV的攻击。 Ced illoBarron
等 [ 8]用编码整个衣壳蛋白和 3D蛋白的 DNA连续 3
次接种动物, 被接种的动物均能抵抗活毒的攻击。
Zhang等 [ 9]用包含 FMDV 5个 B细胞表位 ( VP1的
135~ 167位的 5个残基 )和 1个 T细胞表位 ( GH
loop)的重组 DNA质粒接种 BALB /c小鼠,用 T细胞
增殖试验检测到了强烈的细胞免疫应答。
42 细胞免疫与多肽疫苗
研究发现,用合成的 VP1或含连续 B细胞位点
和 VP1 C端多肽,可保护动物免受 FMDV的感染,并
在豚鼠上取得了预期的结果,但对自然宿主免疫力很
低,没有达到预期效果。其原因可能是所构建的多肽
缺乏足够的辅助 T细胞位点,因为辅助 T细胞位点只
有与 MHC结合才能被 T细胞胞识别,而MHC有严格
的遗传限制,当加入外源性 Th位点时,才能克服这种
遗传限制。如在含 B细胞位点合成肽中引入一个 Th
位点,就能克服遗传限制, 产生高水平的中和抗体。
Guzman等 [ 7]通过研究受 MHC I类分子限制的淋巴
细胞在接种灭活疫苗牛和自然感染牛中的作用,离体
试验检测到了已知 MHC限制型感染牛体中 CD8+ T
所释放出的抗原特异性 IFN, 在接种灭活疫苗的牛
体内也检测得到了 CD8+ T淋巴细胞, 这类免疫应答
至少部分是针对 FMDV P12A的一些位点产生的,弄
清楚这些位点有助于对牛体内的 FMDV抗原特异记
忆性 CD8+ T淋巴细胞进行定性和定量分析, 并且有
助于设计能诱导产生高质量的 CD8+ T淋巴细胞的疫
苗。2002年W ang等设计了对猪有效的合成肽疫苗,
该苗具有台湾 01型 FMDV VP1的 GH loop区域和一
个混合 Th位点,结果表明:每头猪注射 125mg该苗
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2009年第 5期 杜进鑫等:口蹄疫细胞免疫研究进展
可抵抗同源病毒的攻击, 保护率高达 952%。V an
L ierop等 [ 10]通过分析 MHC多态性对多肽疫苗的限
制时发现, FMDV VP4第 20~ 34位氨基酸残基与至
少 4种不同的 MHC单型有关,并且含有该残基的多
肽在有无 MHC单型存在时均能诱导产生 Th1细胞免
疫应答,含有单个型 MHC的动物个体只能被有限数
量的肽接种并获得保护,所以在设计肽疫苗时应当构
建含 VP4第 20~ 34位氨基酸残基。有学者发现, 在
VP1 141~ 209区至少含有 11个不同的 T细胞位点,
除对 VP1的 T细胞位点作研究以外, 在 FMD病毒
O1C株的结构蛋白 VP2, VP3和 VP4上至少存在 10
个 T细胞表位,其中 VP4上的 17~ 36, VP2上的 49~
68, 113~ 132, 179~ 198, VP3上的 81~ 100, 129~ 148,
具有明显有效的 Th细胞刺激功能。另外, 从 FMDV
对于非结构蛋白 3A, 3B,和 3C, FMDV能诱导高水平
抗病毒反应, 例如, 一个包含 B细胞抗原位点 VP1
( 137~ 156)和 3A ( 21~ 35)的合成肽能够刺激显著水
平的血清特异性抗病毒活性。为了提高 FMDV合成
肽疫苗的免疫原性,确定被不同宿主识别的病毒衣壳
蛋白上的细胞位点十分必要。
合成肽苗不含病毒核酸,安全可靠,但是需要与
载体偶联或与佐剂混合才能达到更好的细胞免疫效
果,因为合成肽只具有 B细胞表位,而载体蛋白如
半乳糖苷酶等则提供了 Th细胞表位,能被 Th细胞识
别,从而使 B细胞进一步分化并产生中和抗体。
43 细胞免疫与表位疫苗
表位疫苗是指同时携带多个目标抗原相关表位
以及辅助性表位的疫苗。通过分子生物学手段可筛
选出病毒的 B细胞和 T细胞表位, 以及其它淋巴细
胞表位,同时对表位进行优化, 从而研制出多表位疫
苗。多表位疫苗有能克服主要组织相容性复合体
(MHC )分子的遗传限制, 可被多种遗传背景的
MHC分子识别结合,并被高效递呈等优势。
多表位疫苗因其独特的免疫优势已成为近年来
基因工程疫苗研究领域的热点之一。FMDV粒子上
B细胞和 T细胞表位的不断确定为构建表位疫苗打
好了坚实的一步,现在国内外很多学者都致力于此
项研究,并已取得了一定的进展。Du等 [ 11 ]用腺病
毒构建了含口蹄疫 VP1的 3个氨基酸残基表位 ( 21
~ 60、141 ~ 160、200 ~ 213)的重组腺病毒 ( rAd
GMCSFVPe) ,并与猪的巨噬细胞集落刺激因子混
合接种豚鼠和猪,能检测到高水平的 T细胞增殖,
IL4和 IFN , 并伴有特异性的体液免疫应答。马
海利等 [ 12]利用计算机软件模拟分析, 构建了 FMDV
复合多表位疫苗表达盒 OAAT。该表达盒以 O型、A
型 FMDV结构蛋白 VP1全基因和 A sia1型 FMDV 2
个基因拓扑型的结构蛋白 VP1基因上的 5个抗原
表位基因作为主要免疫原基因, 以非结构蛋白上的
2个 Th2细胞表位基因及结构蛋白上的 1个 Th2细
胞表位基因作为辅助基因, 将其与猪 IL18基因分
别插入到鸡痘病毒表达载体 pUTA16LacZ复合启动
子和单一启动子下游,构建了携带 OAAT表达合和猪
IL18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒 pUTAL
OAATIL18,从而为新型口蹄疫疫苗的研究奠定了基
础。郑敏等 [ 13]构建的共表达 FMDV复合多表位基因
以及猪 TL18基因的非复制型重组鸡痘病毒疫苗 vU
TA2OAT以及 DNA疫苗 pVR IOAT,将上述 2种重组
疫苗分别单独或联合接种豚鼠,测定 FMDV特异性结
合抗体、中和抗体和 T淋巴细胞增殖反应。结果表明
这两种重组疫苗均能诱导豚鼠产生特异性的体液免
疫及细胞免疫应答, 其中以 pVRIOAT /vUTA2OAT
的联合免疫方式的效果最好, 其诱导的抗体水平接
近于常规灭活疫苗, 而细胞免疫水平则比后者高
得多。
5 小结
由于研究手段、设备的局限,导致对一些涉及到
FMDV细胞免疫的细胞应答机制不是非常清楚, 但科
研人员在针对 FMDV的 CD4+ T细胞, CD8+ T细胞,
以及 MHC多态性对 FMDV抗原递呈过程限制方面
已经有了很大程度的深入研究和探索,相信随着对
FMD细胞免疫研究的深入,人们会逐步搞清楚动物
机体针对 FMD的细胞免疫机制。不断的科研成果证
实,要设计构建更加安全有效的新型口蹄疫疫苗,需
要尽最大可能地搞清楚针对 FMD免疫的各类细胞的
免疫机制,依据这样的理论依据设计出的新型 FMD
疫苗才能跟好的预防和控制口蹄疫病。
参 考 文 献
1 Baxt B, M ason PW V irology, 1995, 207( 2) : 503~ 509
(下转第 20页 )
17
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
干预疗法具有重要潜力,然而, RNA i在体内的成功应
用依赖于将小干扰 RNA ( smallinterfering RNA, siR
NA)导入靶细胞的有效载体系统。 de Jonge等 [ 12]研
究表明混于阳离子脂质体 siRNA能有效包被于
IRIV,并且在体外 IR IVsiRNA以 pH值依赖方式与细
胞膜融合,将其中 siRNA呈递给数个细胞系。 IR IV
呈递的针对绿色荧光蛋白 ( GFP) siRNA能显著降低
靶细胞中组成性表达的 GFP,而且,腹腔内注射 IRIV
siRNA能有效将 siRNA呈递给腹膜腔细胞。这表明
IRIV对体内尤其是局部 (如呼吸道 )应用 siRNA是有
前景的载体系统。
3 展望
综上所述,不难看出由脂质和流感病毒蛋白重建
的半合成病毒样粒子 IR IV不仅能有效增强 APC对
抗原的摄取,并经 MHC II类和 I类途径有效呈递,激
活体液免疫和细胞免疫反应,特别是 CTL反应,而且
呈递给靶细胞的 DNA可避免核酸酶的降解。另外,
IRIV蛋白 /DNA /RNA /多糖复合物成分易于改造, 因
此, IR IV载体系统可以根据预期目的进行人为修饰。
Cusi等 [ 13]制备了携带 CD40L基因和癌胚抗原 ( carcino
embryon ic ant igen, CEA )基因的 IRIV ( CD40L / IRIV和
CEA / IR IV) ,鼻内免疫小鼠,结果表明 CD40L / IR IV能
增强 CEA / IR IV诱导的 CEA特异性 CTL活性和 CEA
特异性保护免疫。近来, de Jonge等 [ 14]建立了易于适
应工业化生产 IRIV的新透析程序,生产 IR IV简单有
效,这将进一步促进 IRIV在学术及工业上作为呈递
系统的开发和利用。
参 考 文 献
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