全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-27
基金项目:国家自然科学基金(30470133)
作者简介:路丹(1981-),女,汉族,在读硕士研究生,主要从事系统与进化植物学研究
通讯作者:贺学礼,男,教授,E-mail:xlh3615@tom.com
绢蒿属[Seriphidium(Bess.)Poljak]隶属菊科(Compositae)春黄菊族(Trib.Anthemideae),具有耐旱、抗
旱、抗盐碱的特性,多生长在草原、半荒漠或荒漠草原地区[1],是前苏联学者 Poljak于 1961年从原蒿属
ArtemisiaL.中分出来的一个具有两性同型花的头状花序属,自从绢蒿类植物从蒿属中分出后,林有润对其
进行过系统研究,并建立了较为完整的分类系统,但不同的见解也很普遍,如“中国沙漠植物志”、“黄土高
原植物志”、“内蒙古植物志”等仍将绢蒿类植物归入蒿属。因此,绢蒿类植物的系统发育、分类和演化等方
面仍有许多亟待解决的问题。
过氧化物酶(POD)是植物细胞内的一种保护酶,主要作用是清除 H2O2,从而维持正常的生理过程[2,3]。
该酶活性的高低可以反映植物生长发育和内在代谢情况,同时也是衡量植物抗性的标志之一[4]。同工酶是
一种特异蛋白质,是基因的直接产物,同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节等都有一定关系[5]。因此,
通过研究 POD活性和同工酶谱及其变化,不但能够了解植物生长发育和代谢状况,还能够通过同工酶谱
从遗传育种上对种类进行鉴定,判定其亲源关系及其来源[6]。
现有的绢蒿分类系统皆建立于传统的形态学基础上。对绢蒿属植物生理生化特性的研究未见报道。采
九种绢蒿属植物过氧化物酶同工酶分析
路丹 贺学礼 刘媞 赵丽莉
(河北大学生命科学学院,保定 071002)
摘 要: 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对9种绢蒿属[Seriphidium(Bes.)Poljak.]植物过氧化物酶(POD)同工酶进行
分析。结果表明,供试材料共出现了57条酶带,且种间带数有所不同,最多的为沙湾绢蒿S.sawanense有9条酶带,最少
的为新疆绢蒿S.kasschgaricum只有4条酶带。每种植物的POD大致可分为A,B两区,其中酶带数量较多,活性较强,分
布较为集中的是B区,表明各供试植物在酶谱特征以及种间相似程度上均有明显差异,并根据电泳显示的不同种条带分
布,绘出了酶谱类型图及聚类图,且聚类结果与现行的分类结果有一定出入。
关键词: 绢蒿属 电泳 过氧化物酶 同工酶 聚类分析
AnalysisonPeroxidaseIsozymeof9SeriphidiumSpecies
LuDan HeXueliLiuTiZhaoLili
(ColegeofLifeScience,HebeiUniversity,Baoding071002)
Abstract: PolyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)wasusedtoanalysethePOD isozymeof9Seriphidium
species.Theresultshowedthattherewere57isozymebandsappearedinthetestedmaterials,andthenumberofbands
wasdiferentinspecies.Themaximalisozymebandsnumberwas9from S.sawanense,whiletheminimalnumberwas4
from S.kasschgaricum.ThePOD zymogram canbedividedintotworegions(A andB),theB regionhadmore
isozymebands,andinthisregionthebandsmoreconcentratedandhigheractivity.Thetestedplantshadobvious
diferencesamongthezymogramcharacteristicsandspecies.ThePODisozymepaternandclusterfigureweredrawedup
accordingtothedistributionofdiferentspeciesbands,andtheresultofclusteranalysiswasdiferentfrom actual
clasificationsystem.
Keywords: Seriphidium ElectrophoresisPeroxidase Isozyme Clusteranalysis
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
用过氧化物酶同工酶技术对 9种绢蒿属植物进行物种鉴定及种间亲缘关系的探讨,以便为中国绢蒿属植
物系统研究和资源开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
9种供试的绢蒿属植物及代号为新疆绢蒿 S.kaschgaricum(P1),纤细绢蒿 S.gracilescens(P2),蛔蒿 S.
cinum(P3),沙湾绢蒿 S.sawanense(P4),博洛塔绢蒿 S.borotalense(P5),民勤绢蒿 S.minchünense(P6),伊梨
绢蒿 S.transiliense(P7),西北绢蒿 S.nitrosum(P8)和针裂叶绢蒿 S.sublessingianum(P9)。9种植物的成熟种
子均采自新疆自然生长的植株,于相同条件下同步培养,种子浸种催芽后,按沙:土=1:1的比例,播种于塑
料花盆中,每种设置 3个重复,经过 9个月温室培养,待其长到成体后取样测定。
1.2 实验方法
1.2.1 过氧化物酶同工酶的制样 同一种类不同单株混合取样,取相同部位植物叶片用于酶粗提液的制
备。酶提取液为 0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8)。样品质量(mg)与提取液体积(μl)比为 1:3,冰浴研磨匀
浆后,在 10000r/min下离心 15min,取上清液进行同工酶电泳分析。
1.2.2 电泳 采用垂直平板式(北京市六一仪器厂生产)聚丙烯酰胺凝胶电泳法[7],凝胶厚度为 1mm,面积
180×180mm,分离胶浓度为 10%,浓缩胶浓度为 3%,电极缓冲液为 Tris-Gly(pH值 8.3),点样量为 15μl,采
用 1%溴酚蓝作前沿指示剂,电泳时先通 15mA电流,待溴酚兰(1%)带至分离胶时,电流加倍(均指单板),
电泳 2h～3h,保持温度 0℃～4℃,待溴酚兰指示剂至距底端 1.5～2.0cm时即停止电泳。每种酶电泳 2次以上
以便相互验证。选取酶带清晰重复性好的胶板摄影,绘制酶谱图。
1.2.3 染色及固定 采用抗坏血酸-联苯胺染色液染色 2～5min,酶带充分显色后,用 7%冰醋酸固定 5～
10min,用清水漂洗后记录、照相。
1.2.4 迁移率计算 Rf=Lx(酶带移动距离)/L(指示剂移动距离)
1.2.5 POD酶谱的聚类分析 聚类分析是用数学方法将一批样品 (变量)按其性质亲疏远近程度进行分
类的科学方法,用相似系数来描述样品之间的关系,相似系数:C=2w/(a+b),不相似系数:D=1-C(表 2,相
似系数为右上角,不相似系数为左下角),其中 a,b分别代表两品种各自出现的酶带数(无论强带和弱带),
w代表两品种共有酶带数。亲缘关系越近的种类,相似系数越接近于 1,彼此无关的种类其相似系数越接近
于 0[8,9]。结果进一步用分析软件 PRIMER5.0进行聚类分析[10]。
2 结果与分析
2.1 酶带及酶谱分布特征
9种绢蒿属植物的过氧化物同工酶酶谱模式(图 1),酶谱见图 2,酶带的相对迁移率见表 1。由图 1可
知,9种植物材料的 POD同工酶共产生了 57条酶带,其中最多可在 9个位点(P4)出现酶带,最少只有 4个
(P1)位点出现酶带。依据酶谱特征,从负极到正极按迁移率大致可显现为 A,B2个区带(表 1),即 A区
(0.031～0.203),B区(0.458～0.0.755)。在 A区,9个供试材料共出现 15条酶带,其中包括中级带 4条,弱带
11条,且只有 P2在该区内没有出现谱带。而 B区则是 9种植物酶活性最强、分布最多和最为集中的区域,
共出现了 42条酶带,其中主酶带 20条,中级带 8条,弱带 14条。从各个种在 B区酶带数看,最多的是 P2
和P4,各出现了6条不同活性和位点的酶带;P1和P8最少,各出现3条。从带级上看P4和P5各出现了4条
主酶带。其中B14出现在所有试材中,只是显带强弱不同,这条带可能是绢蒿属植物的特征酶带,也可能是蒿
属植物的特征酶带。在所有供试材料中只有 P3和P8没有出现主酶带,且酶带数较少,各为5条,P1的酶带数
最少,为4条。其中P4和P5的主酶带数最多,各为4条,且位置相同。显然,其酶谱越复杂,说明酶活力越强;
酶谱的组分越多样,可以推测其生物活性物质越多样;相同(似)谱带数越多,说明其过氧化物酶组成越接近,
系统发育上亲缘关系越密切。因此,以上具有较多共同谱带的种间其亲缘关系和进化水平越接近。
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2.2 聚类分析
根据聚类分析(图 3),绢蒿属酶谱在种间表现出的特异性,与现有绢蒿属分类系统无论在组级还是在
系级水平上,都有一些出入。如图 3所示,划分线 L1将 9个样品分为 2大类:Ⅰ:1、5、6、7、9(即新疆绢蒿、
博洛塔绢蒿、民勤绢蒿、伊梨绢蒿和针裂叶绢蒿)为一类;Ⅱ:2、3、4、8(即纤细绢蒿、蛔蒿、沙湾绢蒿和西北
绢蒿)为一类。根据划分线 L2,样品被划分为 4类:Ⅰ:5、6、7(博洛塔绢蒿、民勤绢蒿和伊梨绢蒿);Ⅱ:1、9
表 1 9种绢蒿属植物 POD酶谱的 Rf值
图 1 9种绢蒿属植物 POD同工酶酶谱模式图
表 2 POD酶谱的相似系数和不相似系数
图 3 9种绢蒿属植物聚类图
路丹等:九种绢蒿属植物过氧化物酶同工酶分析
图 2 9种绢蒿属植物 POD同工酶酶谱照片
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(新疆绢蒿和针裂叶绢蒿);Ⅲ:2、3、8(纤细绢蒿、蛔蒿和西北绢蒿);Ⅳ:4(沙湾绢蒿)。而林有润的分类系
统将供试的 9种绢蒿属分在绢蒿组和民勤绢蒿组中,其中新疆绢蒿、博洛塔绢蒿、伊梨绢蒿、针裂叶绢蒿、
纤细绢蒿、蛔蒿、沙湾绢蒿和西北绢蒿属于绢蒿组;民勤绢蒿归为民勤绢蒿组。总的来看,其聚类结果并不
按现行分类的组聚类,各组相互混杂。
3 讨论
就本试验结论而言,9种材料间各自拥有的酶带数、位点、分布格局以及共有带的带级各不相同,即使
两种或多种间出现共有带,其酶的含量、活性强弱也不尽相同。说明这 9种材料属于 9个独立的物种,但在
它们之间存在着一种既独立又相关联,亲疏远近各不相同的非常复杂的种间遗传关系。同时,这种复杂多
样的遗传基因为未来的遗传育种研究以及绢蒿属植物资源开发利用提供了富有价值的基因资源。
聚类分析结果与传统分类结果有一定差异,胡志昂等在杨属、松科,江洪等[11]在柏木属的同工酶研究
中发现,有时分子进化与形态进化是不平行的。这一点在绢蒿属同工酶研究中也是一样。这可能由于酶作
为基因的表达产物,在很多情况下受到地理环境、气候差异的影响,而且许多因素也会影响电泳效果。
经典分类学家在研究种的划分时,主要借助于形态和地理分布的资料。一些学者认为和分子进化相
比,形态进化速度不稳定,受环境制约,那些分子进化差异很大而形态上却很相似的类群,可能是长期适应
于相同或相似的生态环境而进化的结果。因此,主要基于形态学推断的演化系统不一定正确[12]。另一方面,
植物同工酶的表现,有着组织器官的特异性及发育阶段的特异性,这对利用同工酶进行种类鉴定和分类是
一个不利因素。但它也存在着相对的稳定时期和适宜的采样部位,这使得其应用又具备了可能性。因此,对
于绢蒿属系统分类学研究,仅有酶谱一方面的资料是不够的,必须借助更多实验手段和积累更多证据,例
如形态解剖、血清学和细胞地理学等方面的证据[13]。只有这样才能较为正确地划分各级分类群,较为客观
地反映植物类群系统发生和演化的自然过程。
参考 文献
1 林有润.中国植物志.北京:科学出版社,1991,76(2).
2 FridovichJ.Science,1975,201:875～880.
3 PalitKE,YoungAJ,AlscherRG.Antioxidantsinhigherplants.BocaRaton:CRCPress,1992,59～60.
4 胡能书,万国贤编.同工酶技术及其应用.长沙:湖南科学技术出版社,1985.
5 JonesBL,LokhartGL,HalSB,etal.CerealChem,1982,59:181～188.
6 汪清胤.遗传,1981,3(6):28～30.
7 陈毓荃.生物化学实验方法和技术.北京:科学出版社,2002.
8 苏应娟,刘启宏.武汉植物学研究,1994,12(1):44～48.
9 熊全沫.遗传,1986,8(1):1～5.
10 裴鑫德.多元统计分析及其应用.北京:中国农业出版社,1991.
11 江洪.四川林业科技,1985,21:9～15.
12 付桂荣,周国宾,张贵一,等.哈尔滨师范大学学报,1998,14(6):77～85.
13 孙会忠,贺学礼,陈铁山,等.自然科学进展,2007,17(1):35～41.
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