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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
PCR构建融合基因方法的建立
陈国梁  白兴俊  赵蓉  雷鸿亮  陈宗礼
(延安大学生命科学学院 陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心,延安 716000 )
  摘  要:  以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术 融合 PCR技术是一种新的基因片段融合技术。以含有马铃薯
块茎两种淀粉合成关键酶 ss!和 ss∀基因为模板, 利用融合 PCR对其进行融合拼接, 初步建立以 PCR产物 (不回收 )及一步
PCR法融合基因的构建方法,并对融合基因构建时 PCR产物 (不回收 )的使用量及一步 PCR法构建融合基因的中间引物浓度
等条件进行优化。结果表明, 以不回收的 PCR产物为模板构建融合基因时 PCR产物 (不回收 )的使用量在 10- 20 ng范围内
为佳; 一步 PCR法构建融合基因的中间引物浓度在 25- 1 000 nm o l/L为宜。
关键词:  融合基因  一步 PCR法  模板浓度  引物浓度
Establishment and Optim ization of PCRM ethods for
Constructing Fusion Gene
Chen Guoliang  BaiX ing jun ZhaoRong LeiHong liang Chen Zongli
(College of L ife Science Yan# an University, Shaanx i Engineering& T echno log ical Research Center for
Conversation& Utilization of RegionalB iological Resources, Yan# an 716000)
  Abstrac:t  Fusion PCR techno logy is a new w ay used for constructing fused gene, based on fragm ent
sp licing techn iques. Two cru

cial genes of potato tuber sta rch synthesis key enzym e ss! and ss∀ we re em ployed as the temp la tes to construct a fused gene w ith a
one
step me thod of fusion PCR, in which interm ediate PCR products were not sub ject toDNA gel
extraction. The resu lts show ed that, the
am ount of interm ediate PCR products shou ld be around 10- 20 ng used in fusion PCR. It is appropr ia te to construct fusion gene by one

stepPCR w ith the in term ed ia te pr im er concentra tion at 25- 1 000 nm o l/L.
Key words:  Fusion gene One
step PCR Concentration o f tem plate Concen tration of prim er
收稿日期: 2010
03
01
基金项目:延安大学专项科研基金项目 (YDK2008
17 ) ,延安大学大学生科技创新训练项目 (YD2009
208 )
作者简介:陈国梁,男,讲师,研究方向:植物生物技术; E
m a i:l glc9359@ 163. com
通讯作者:陈宗礼, E
m ai:l zongli_chen@ yahoo. com. cn
随着对植物代谢网络日渐全面的认识, 应用基
因工程技术对植物次生代谢途径进行遗传改良已取
得了可喜的进展。目前对次生代谢途径进行基因修
饰的策略主要是通过导入单个、多个靶基因,使宿主
植物合成新的目标物质或通过反义 RNA和 RNA干
涉等技术降低靶基因的表达水平, 从而抑制竞争性
代谢途径,改变代谢流和增加目标物质的含量,以提
高特定化合物的积累 [ 1]。通过基因工程手段实现
研究目标,一般均需构建含有两个或两个以上融合
基因的多价载体,而传统的融合基因重组构建是以
限制性内切酶和 DNA连接酶为基础, 即通过限制酶
将两个 DNA分子进行酶切后,用连接酶将两个具有
相同末端酶切位点的 DNA片段进行连接 [ 2]。这不
仅需要对 DNA片段的限制性酶切位点有所了解, 而
且对于过长片段连接有时很难找到合适的内切酶对
DNA片段进行酶切 [ 3] ,对于过短的片段又增加了连
接和鉴定的难度, 同时在连接过程中还引入了不必
要的酶切位点碱基序列,因此,在某种程度上限制了
该方法的应用。为了克服传统的融合基因重组构建
方法的缺陷,出现了以聚合酶链式反应为基础的片
段拼接技术 融合 PCR技术 [ 4 ] ;但其在应用过程
中还有诸多缺陷, 如首先必须应用特异性引物 [ 5, 6]
对各片段进行独立扩增、分别纯化、回收才能进行融
合扩增; 一般要进行两步 PCR反应,延长了试验时
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
间, 增加了试验成本及操作程序等。为此, 在融合
PCR方法的基础上,以含有马铃薯块茎两种淀粉合
成关键酶基因 ss!和 ss∀为材料,利用融合 PCR对
其进行基因片段融合拼接,初步建立起以 PCR产物
(不回收 )及一步 PCR法融合基因的构建方法,并对
构建时作为模板的 PCR产物 (不回收 )使用量及一
步 PCR法构建融合基因的中间引物浓度用量等条
件进行优化,以便建立起一种经济, 有效, 快速方便
的基因融合方法,供相关研究人员参考。
1 材料和方法
1. 1 菌种、质粒及工具酶
菌株 E. coli DH5
;质粒 Y1(含 ss∀基因 ) ,质粒
Y2(含 ss!基因 )均由本实验室提供; pGEM
T Vec

to r克隆载体购自 Promega公司。试验所需的限制
性内切酶、连接酶和 Taq聚合酶均购自宝生物 (大
连 )工程公司; 小量 DNA胶回收试剂盒、标准 DNA

Marker购自天为时代公司。
1. 2 引物设计
以 ss∀ ( g :i 1911165)和 ss! ( g:i 48927499)基
因的 cDNA全序列为依据, 考虑到采用 PCR拼接两
个基因片段及最终试验目的, 最终确定选择用于拼
接的 cDNA片段 ss∀基因 ORF中 2 164- 2 407 bp
之间的片段 ( 244 bp) , ss!基因 ORF中 161- 441 bp
之间的片段 ( 281 bp)。采用 O ligo6. 0分析软件对其
进行引物设计,并依次为命名为 g1、g2, g3、g4, 其碱
基组成如表 1所示。 PCR引物合成和 DNA序列测
定由上海生物工程公司完成。
表 1 扩增所用引物
引物名称 引物序列 ( 5∃
3∃) 模板 备注
g1  TAA AAT GTC GCC TGC TGA AAA TG
g2  ttc g at tca gca c tt gca gTA ACA ACA TCA CCA AGG CCT CC
g3  gga ggc ctt gg t g at gtt gtt aCT GCA AGT GCT GAT GAA TCG AA
g4  ATC GAT GGT ACC AGC AGG CGG TGT ATT TTT ATC G
ss!
ss∀
引物中大写序列为扩增片段的
特异性引物序列, 小写序列为相
邻片段的互补序列
在进行 ss∀、ss!基因片段的 PCR融合中, 以
不同浓度的扩增片段 (不回收 )以及含有目的基因
的质粒 (WY 01、WY 02)为模板, 分别以不同浓度的
引物,采用相应的扩增体系及参数进行扩增, 期待
找出一个简便、经济、有效的 PCR构建融合基因的
方法。
1. 3 以 PCR产物 (不回收 )为模版构建融合基因
以质粒 Y1和质粒 Y2为模板扩增出 ss∀、ss!
基因片段,并以 ss∀、ss!基因片段的 PCR产物 (不
回收 )等体积混合为模板, 配成 25 L的反应体系
(含 Taq酶缓冲液、dNTP、Taq酶 ) , 94% 4 m in、
95% 40 s、54% 1m in、72% 1. 5m in扩增 5个循环
(不加任何引物 )。 5个循环后,另加入 25 L的反
应溶液 (含 Taq酶缓冲液, dNTP, Taq酶以及所设
计融合基因的上、下游引物即 g1、g4各 1 L, 浓度
为 10 mo l/L )。 94% 4 m in; 95% 40 s、54% 45 s、
72% 1m in、循环 30次; 72% 10 m in, 4% 保存。为了
得到单一的融合基因片段,对经 PCR扩增所得到的
ss∀、ss!片段 (不回收 )的加入量依次以 0. 05、
010、0. 15、0. 20、0. 25、0. 50、1. 0、1. 5、2. 0 L等体
积混合 (对应的 DNA量分别约 2、4、6、8、10、20、40、
60、80 ng )进行扩增并取 5 L扩增产物进行电泳
检测。
1. 4 一步 PCR法构建融合基因
以质粒 Y1,质粒 Y2为模板,配成 25 L的反应
体系 (含 Taq酶缓冲液、dNTP、Taq酶、组成融合基
因的各个基因片段的上下游引物 g1、g2, g3、g4各
1 L), 94% 4m in、95% 55 s、50% 45 s、72% 50 s,
进行 5个循环, 72% 5 m in, 5个循环后,反应参数变
为 95% 55 s、54% 1m in、72% 2m in,循环 5次, 72%
5m in,另加入 25 L的反应溶液 (含 Taq酶缓冲液,
dNTP, Taq酶、所设计融合基因的上、下游引物引物,
即 g1、g4各 1 L, 浓度为 10 mol/L ) ; 95% 55 s、
54% 1m in、72% 2m in,循环 30次, 72% 10m in, 4%
保存。依据一步 PCR法构建融合基因的原理及影
响因素,为了获得较好的融合效果,我们对该过程的
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2010年第 8期 陈国梁等 : PCR构建融合基因方法的建立
4条引物浓度进行了调整, 分别用浓度为 10 000、
2 000、1 000、500、200、100、50、25 nmo l/L进行融合
试验, 扩增后分别取 5 L进行电泳检测。
1. 5 融合基因片段与 T载体的连接及测序
从上述经琼脂糖凝胶电泳检测大小合适的 PCR
融合产物中选取融合片段进行回收,并与 T
easy载体
连接转化、筛选,并进行双酶切鉴定。将酶切和 PCR
鉴定后将所得阳性克隆子送往上海生物技术有限责
任公司进行测序。
2 结果
2. 1 PCR一步法构建融合基因的原理
以含有目的基因的质粒为模板进行基因片段融
合扩增过程如图 1所示。以质粒 Y1、质粒 Y2为模
板,进行 5个循环扩增, 目的是分别扩增出 ss!、ss
∀基因片段;接下来的 5个循环扩增是在提高退火
温度的条件下 (由 50% 提高到 54% ) , 利用已经扩
增出来的两个片段互为模板和引物, 进行基因融合
扩增, 形成融合基因, 同时抑制了两个片段的单独扩
增;第二次 30个循环, 以形成的融合基因为模板,融
合基因的 5∃端片段的上游引物及 3∃端片段的下游
引物 (即 g1, g4为引物 )扩增融合基因全长序列。
图 1 PCR一步法构建基因融合原理图
2. 2 以 PCR产物 (不回收 )为模版构建融合基因
ss!、ss∀ 基因片段的独立扩增产物经琼脂糖
凝胶电泳检测 (图 2 ), 均出现约 300 bp左右的条
带,与预期片段大小 ( 299 bp、317 bp)相符合,表明
扩增得到了目的片段。用 1. 3方法扩增得到的 PCR
产物取 5 L进行琼脂糖凝胶电泳,结果 (图 3,图 4)
表明, 所有扩增产物均出现大小约 560 bp左右大小
的条带,初步表明两片段已经且按照预期顺序融合
在一起;但在以 PCR产物 (不回收 )为模版加入量分
别为 20、40、60及 80 ng时 (图 4)所得扩增产物除了
含有特异性条带外还有大小约 300 bp左右的非特
异条带出现,而且随着模板的浓度增大而变亮。表
明以 PCR产物 (不回收 )为模版,通过调节模板量,
可成功地构建含 ss!和 ss∀基因片段的融合基因。
1. ss! ; 2. ss∀ ; 3. M ark er!
图 2 ss!、ss∀基因片段扩增电泳图
1
5. PCR产物加入量依次约为 2、4、6、8、10 ng; 6. M arker!
图 3 以 PCR产物 (不回收 )为模版
进行融合扩增产物电泳图
1
4. PCR产物加入量依次约为 20、40、60、80 ng; 5.M arker!
图 4 以 PCR产物 (不回收 )为模版
进行融合扩增产物电泳图
2. 3 一步 PCR法构建融合基因
利用 1. 4方法扩增得到的 PCR产物取 5 L进
行琼脂糖凝胶电泳,结果 (图 5, 图 6)均出现大小约
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
560 bp左右明亮的目的条带,初步表明两片段已按
预期顺序融合在一起。但是, 当中间引物量为 500、
1 000、2 000、10 000 nmol /L时 (图 5) , PCR产物除
了含有特异性条带外,还有大小约 300 bp的非特异
条带出现, 而且随着中间引物的浓度增大而变亮。
表明以含目的基因的质粒为模板, 通过调节中间引
物浓度,可成功地构建含 ss!和 ss∀基因片段的融
合基因。
1
4.引物浓度依次为 10 000、2 000、1 000、500 nmol /L; 5. Marker!
图 5 PCR一步法融合基因扩增电泳图
1
4.引物浓度依次为 200、100、50、25 nm ol /L; 5. M arker!
图 6 PCR一步法融合基因扩增电泳图
1, 2. PCR; 3, 4.酶切; 5. M ark er!
图 7 pGEM
TR的酶切与 PCR电泳图
2. 4 融合基因片段测序结果
将利用 PCR获得的融合基因片段与 T
easy载
体连接、转化, 经 PCR和酶切鉴定 (图 7)的阳性克
隆子经测序与并与原序列比较, 与 G enB ank中已公
布的序列一致,表明所建立的一步 PCR构建融合基
因的方法是成功的。
3 讨论
利用融合 PCR方法可以通过设计引物只在一
个 PCR反应中将两个、甚至两个以上的基因构建成
为融合基因,同时还可在中间加入所需的特殊序列
及所需酶切位点, 或引入突变碱基、进行基因敲除、
单核苷酸突变等 [ 7]。此外, 利用该方法可在所期望
的某些位点将两种 DNA片段连接起来, 而不需知道
DNA片段的限制性酶切位点, 这为构建没有适宜酶
切位点的融合基因提供了便利, 方便了基因重组操
作,使得该技术在得已广泛应用。如 Kuwayama等 [ 8]
将该技术应用到 D ictyostelium d iscoideum 的 pkaC基
因的敲除;范宝昌等 [ 9]应用该技术获得了登革热 2
型病毒的全长 cDNA 分子; Charlier等 [ 10] 用融合
PCR构建了 MOC /黄热嵌合体病毒, 但他们都是将
单个 PCR产物回收后再融合。虽然刘和等 [ 11 ]曾用
一步 PCR构建了融合蛋自基因 fpg, 不但两个片段
的融合产物量较少,且效果不佳。
通过试验,成功建立起以 PCR产物 (不回收 )为
模板构建融合基因的方法以及一步 PCR构建融合
基因的方法。在利用以 PCR产物 (不回收 )为模板
构建融合基因时,在除模板以外的其他影响 PCR扩
增因素确定后,以不经过回收的 PCR产物为模板加
入量控制在约 2 - 10 ng范围内可得到单一的目的
条带, 与传统的 PCR 构建融合基因相比, 省去了
PCR产物回收的过程, 既节省了时间又节约了试验
经费。在应用一步 PCR构建融合基因时, 中间引物
浓度控制在 25- 1 000 nmo l/L范围内可以得到单一
的目的条带,可用于后续试验。因此,无论是从达到
试验目的的角度,还是实际应用来看,该方法的确是
一种经济,简便、快捷的构建融合基因的好方法。我
们已经成功地利用一步 PCR法进行了马铃薯块茎
两种淀粉合成关键酶 gbss和 ss∀的基因片段以及
gbss、ss∀和 ss!三基因片段的融合 [ 12, 13]。
参 考 文 献
[ 1] 杨致荣,毛雪,李润.植植物次生代谢基因工程研究进展.植物生
理与分子生物学学报, 2005, 1: 11
19.
212
2010年第 8期 陈国梁等 : PCR构建融合基因方法的建立
[ 2] 王力华,付士红,唐青, 等.三重融合 PCR法构建感染性辛德毕
斯嵌合病毒 cDNA克隆.病毒学报, 2006, 22 ( 2) : 107
113.
[ 3] Yon J, Fried M. Precise gene fus ion by PCR. Nucleic Acids Res,
2000, 17: 4895.
[ 4] 黄留玉. PCR最新技术原理、方法及应用 [M ] .北京:化学工业出
版社, 2005: 245
275.
[ 5] 武国军,王禾等.顺序特异性引物聚合酶链反应技术对 HLA
DR
DNA的分型.细胞与分子生物学杂志, 2003, 19( 6 ) : 1578.
[ 6] 罗师平,冷希岗.基于 PCR的体外诱变技术.国外医学生物医学
工程分册, 2005, 28( 3 ): 188
192.
[ 7] Sed ivy JM, Dutriaux A. G ene target ing and somat ic cell gen et ic S
re

b irth or a com ing of age. T rend sGen et, 1999, 15: 88
90.
[ 8] Kuw ayam aH, Ob ara S, M orio T, et a.l PCR
m ed iated generat ion of a
gen e d isrup tion const ru ct w ithou t the use ofDNA ligase and plasm id
vector. Nucleic A cid Res, 2002, 30( 2) : 2.
[ 9] 范宝昌,赵卫,胡志君,等.扩增我国登革 2型病毒的全长 cDNA
分子的融合 PCR方法.军事医学院院刊, 2001, 25( 2 ): 137
139.
[ 10] Charlier N, Mo lenkam p R, L eyssen P, et a.l A rap id and conven ient
varian t of fu sion
PCR to constru ct ch im eric flaviviru ses. V iro l
M ethed s, 2003, 108 ( 1) : 67
74.
[ 11] 刘和,陈英旭,张文波,等. PCR一步法构建融合蛋自基因 fpg.
遗传, 2004, 26 ( 4) : 525
528.
[ 12] 陈国梁,苗娜,张金,等.一步 PCR法进行基因片段高效融合.
北方园艺, 2008( 8 ): 169
171.
[ 13] 陈国梁,张金文,王蒂. 马铃薯 gbss、ss!和 ss∀基因片段的融
合及其 RNA i载体的构建.中国生物工程杂志, 2008, 28 ( 8 ):
51
56.
(上接第 194页 )
[ 29 ] 邱立言 苏沪沿海瘤背石磺的形态和习性 动物学杂志, 1991,
26 ( 3) : 33
36
[ 30] 沈和定,陈汉春,陈贤龙,等 几种饵料对石磺的暂养效果及其消
化率的初步研究 上海水产大学学报, 2004, 13 ( 4): 293
297
[ 31 ] 沈和定,李家乐,张媛溶 石磺的生物学特性及其增养殖前景
分析 中国水产, 2004, 1: 60
63
[ 32 ] 沈和定 中国大陆沿海石磺生物学实验研究及系统分类 [M ] 
上海:上海海洋大学, 2009
[ 33 ] G rande C, Tem p lado J, Zardoya RM olecu lar phylogeny of E uthy

n eura ( M ollu sca: Gas tropoda ) Mo l B iol E vo,l 2004, 21 ( 2 ):
303
313
[ 34] G rande C, Tem p lado J, Zardoya RE vo lut ion of gastropod m ito

chond rial gen om e arrangem en tsBMC Evolu tionary B iology, 20 08,
8: 61
213