全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
植原体检测与分类研究进展
张松柏1 罗香文1 刘勇1 张德咏1 李华平2
(1湖南省植物保护研究所，长沙 410125;2华南农业大学植物病毒室，广州 510642)
摘 要: 从 20 世纪 60 年代末发现植原体以来，目前已发现的植原体已有 300 多种，其中有多种植原体危害经济作物。
综述了国内外植原体检测方法与分类研究。
关键词: 植原体 检测 分类 进展
The Study Advances of Detection and Taxonomy of Phytoplasma
Zhang Songbai1 Luo Xiangwen1 Liu Yong1 Zhang Deyong1 Li Huaping2
(1 Hunan Plant Protection Institute，Changcha 410125;2 Laboratory of Plant Virology，
South China Agricultural University，Guangzhou 510642)
Abstract: From the end of 1960s of phytoplasma being discovered，over 300 phytoplasmas have been discovered ，many of which
have been involued in harming economic crops. The phytoplasma detection methods and taxonomy were summarized
Key words: Phytoplasma Detection Taxonomy Advances
收稿日期:2010-02-08
基金项目:国家自然科学基金(30370929)
作者简介:张松柏，男，博士研究生，主要从事植物病理学与微生物学研究;E-mail:zsongb@ hotmail com
通讯作者:李华平，教授，E-mail:huaping@ scau edu cn
植原体(phytoplasma) ，原称类菌原体(myco-
plasma-like organism，MLO) ，在植物和昆虫中广泛分
布，能引起许多重要的粮食作物、蔬菜和果树以及观
赏植物、林木树和林荫树的严重病害，造成巨大损
失。到目前为止，已有研究者分别对植原体的检测
和分类进行了综述，然而，随着分子生物学、微生物
学以及仪器设备等学科的发展，新的研究成果如植
原体检测与分类方法的不断出现，同时一些检测技
术也用于植原体的分类。综述了到目前为止，植原
体检测与分类方法的研究进展。
1 植原体检测方法
1 1 传统检测方法
从 20 世纪 60 年代末发现植原体至 80 年代初，
植原体的检测方法几乎没有突破。传统的检测方法
是根据植原体引起病害的独特症状结合木本植物韧
皮部注射植原体敏感的盐酸四环素，然后超薄切片
法直接观察病原体加以确定。这种推测很不可靠，
而且费时，并且从灵敏度、可靠性、简便性和特异性
等方面来衡量是很不够的。
1 2 电子显微技术检测
20 世纪 80 年代以后，电子显微技术应用于植
原体的检测，并且随着方法的进一步改进，植原体检
测出现了一些较重大的突破。从而使电子显微技术
成为研究植原体的经典方法，它也是鉴定新病原不
可缺少的手段。许多研究者通过不同电子显微镜方
法观测到植原体的完整和立体结构［1，2］。
电子显微技术应用于植原体的检测，推动了植
原体的检测研究。但是电子显微技术也存在一些不
足。在电镜下观察植原体是一种费时、费力的方法，
容易产生假阳性。而且这种方法所需条件高，难以
用于实际检测［2］。
1 3 植原体的组织化学技术检测
组织化学技术是充分利用光学显微镜检查植物
和介体昆虫体内的植原体的有效手段，而且可以进
行病原的组织定位和定量。国内外用迪纳氏染色法
和DAPI显微荧光作用植物中病原植原体的检测方
法都作过尝试［3，4］。
2010 年第 6 期 张松柏等:植原体检测与分类研究进展
植原体的间接检测，都不是对植原体本身的特
异性染色，容易造成假阳性。如正常植物筛管细胞
的老化及各种逆境也往往导致胼胝质的积累，用苯
胺蓝染色很容易产生假阳性［4］。
1 4 植原体的血清学检测
植原体的血清学在植原体的检测和鉴定上具有
重要的地位。自从 1985 年 Lin 等［5］首次报道翠菊
黄化病植原体的单克隆抗体制备成功以来，国内外
已有多种植原体的单克隆抗体研制成功［6］。然而，
要使血清学方法充分发挥作用，必须解决以下两个
问题:一是获得高纯度和高浓度的植原体抗原;二是
制备出高效价和特异性强的抗体［5，6］。
1 5 植原体的 PCR检测
自 20世纪 90年代以来 PCR被广泛应用于生物
学各领域，在真菌与植物病理学方面也解决了一些传
统技术难以解决的问题。同样，PCR技术也被应用于
对植原体的检测等研究。Sunjun等［7］根据 16S rRNA
序列设计了 5对用于扩增动物菌原体、螺原体和植原
体的引物，证明在控制适当的热循环条件下这些引物
可用于扩增能培养的和不能培养的软球菌。随着
PCR技术的不断完善，其用于对植原体的检测日益增
多［8］。但是，—些特定的情况下，常规的 PCR扩增过
程不一定能得出满意的结果。因而，需对 PCR 进行
适当的调整和改进。为此，又发展出巢式 PCR、循环
PCR技术以及荧光 PCR等［9，10］。
虽然，目前根据血清学以及分子生物学技术与
方法初步建立了植原体的鉴定方法，但这些方法操
作繁琐、成本较高，检测过程中还需要结合多种方法
排除假阳性;而且，目前尚无能够同时检测多种植原
体的方法。但随着研究的深入，一些新的技术如生
物微阵列［8，10］等技术的发展与应用，植原体检测技
术的检测速度和可靠性将会有很大的提高。
2 植原体分类的研究
1967 年日本的土居养二等发现植物类菌原体
以来，经过多年的研究，特别是 20 世纪 80 年代后，
随着分子生物学方法在植原体研究上的应用，才使
植原体的研究出现新的突破。
2 1 基于生物学特性及其与介体昆虫的关系的分类
由于植原体一直未能人工培养，因而在早期对
植原体的区分或分类只有根据其致病害症状、寄主
范围及其与介体昆虫的关系进行［11］，但不同的植原
体可引起相似的症状，如变绿植原体和衰退植原体
都能引起黄化、萎缩及寄主植物芽增生等症状。另
一方面，确定植原体的寄主范围和虫媒传播特征又
很费力费时，因而，根据病原植原体的生物学病理学
特性而进行的分类法常常引起原核生物的命名和区
分紊乱。
2 2 基于 DNA分子杂交的植原体分类
核酸点杂交用于不同植原体的检测和植原体不
同株系之间的遗传系统研究。DNA 杂交技术虽然
可进行植原体之间的分类，并且已分出一些植原体
簇或亚簇［12］，但是这种方法的应用范围比较有限。
迄今为止，克隆出的植原体特异 DNA片段仅限于小
部分植原体，未能获得对植原体普遍适用的标准
DNA探针。而且，DNA 杂交技术对 DNA 的浓度要
求很高，对于植物病组织提取的 DNA较难达到要求
的浓度。
2 3 基于 16SrDNA体外扩增(PCR)产物的 RFLP
分析的植原体分类
Lee 等［13］根据植原体 16S rRNA 基因序列的
RFLP分析，再以 RFLP杂交结果为基础，分析待检
植原体的相似系数(F) ，以此方法对 40 种不同来
源的植原体分为 9 个 16S rDNA 群和 14 个亚群。
本方法得出的 RFLP 图谱作为参考标准对未知植
原体进行同样的处理后，对照已得出的 RFLP 图谱
便可分类，这种做法在未知植原体分类中被证实
是有效的。
以植原体 DNA 产物的 RFLP 分析进行植原体
的分类虽然具有简单快速的特点，但 RFLP 显得精
确度不够高，对亲缘关系比较接近情况，如同一群中
对亚群株系，RFLP则可能难以凑效［14］。
2 4 基于 DNA直接序列分析的植原体分类
Seemüller等［14］创立了通过 16S rRNA的基因序
列分析比较结合数学分析的方法建立的分类系统。
日本的 Shigetou等［15］率先扩增出 6 种植原体的 16S
rRNA序列(约 1 370 bp)对扩增产物进行序列分析
比较。以 Shneider等［16］对植原体采用的 RFLP分类
得出的 7 个类群为基础，Seemüller等［14］选取了分别
代表该 7 个类群的 17 种植原体进行 16S rRNA基因
的全序列分析，比较其同源性，得出结论认为，参与
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
比较的植原体之间的 16S rRNA 的序列同源性高于
植原体与其它可培养的菌原体的同源性，甚至一些
菌株的同源性高达 99%以上，与前人的其它研究结
果一致［15，16］。
2 5 基于 16S和 23S之间间隔区域分类
植原体 16S 和 23S 之间的间隔区域(spacer re-
gion，SR)也是一个植原体系统发育研究的可靠标
记。依据 16S和 23S之间的间隔区域或 tRNA 侧翼
的可变区域建立的植原体分类体系和依据 16S
rRNA基因建立的系统分类体系基本一致。由于这
段间隔区序列总长约 250 bp，利用 PCR产物直接测
序很容易得到其全序列，而且这段序列在遗传上较
16S rRNA 基因有更大的可变性(植原体在 16S
rRNA基因序列上的差异不超过 14%，而 16S － 23S
间隔区域序列差异却高达 22%) ，这样就容易设计
出特异性引物而提高植原体在亚组水平上分类的精
确性［17］。
2 6 其它分类方法
系统发育研究标记物 ITS 区段、核糖体蛋白基
因、tuf基因、ftsZ基因、B操纵子、热击蛋白基因应用
于植原体的分类也日益增多，国际比较菌原体学研
究组织 (The International Research Programme of
Comparative Mycoplasmology，IRPCM)建议植原体的
分类应该基于 16S rRNA 基因，通过分析 16S rRNA
基因近全长的序列来划分主要的组以代表具有明显
差异植原体。这项建议经国际系统细菌学委员会
(International Committee on Systematic Bacteriology，
ICSB)柔膜菌纲分类组织(Subcommittee on Taxono-
my of Mollicutes)同意并采纳，同时同意采用 Murray
和 Schleifer［18］提议的暂定名称“Candidatus phyto-
plasma”来记载植原体。IRPCM(2004)植原体 /螺原
体工作小组提出植原体候选种的 7 条描述规则［19］，
根据该规则，2006 年在英国召开的国际原核生物系
统学委员会柔膜菌纲分类委员会(International Com-
mittee on Systematics of Prokaryotes，Subcommittee on
the Taxonomy of Mollicutes)统计新命名的候选种有
13 种，至少有 7 个候选种还有待命名［20-22］。
除 16S rDNA 序列测定外，我国对植原体的其
它基因和序列的研究明显不足，不同地区间的菌株
比较不够充分;大多数植原体尚无任何分子生物学
信息资料［23］。从整体上看，我国与国外研究差距很
大。因此，需要加强对我国重要、典型和特殊植原体
基因组学和功能基因的研究，为我国植原体的系统
分类与鉴定提供依据和工具。
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