全 文 ：2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
收稿日期:2007-11-04
基金项目:山东省自然基金资助项目(Y2006D08)
作者简介:任轩(1982-),男,硕士研究生,研究方向:应用真菌学;E-mail:smile6960@sina.com
通讯作者:贾乐,博士,副教授,硕士生导师,研究方向:真菌学和环境微生物学;E-mail:jiale9015@163.com
原生质体融合(Protoplastfusion)技术起源于 20
世纪 60年代,最初应用于动物细胞中,后逐渐扩展
到植物细胞和微生物细胞。在食用菌上的应用最早
在 70年代,Devriers(1972)等人对裂褶菌原生质的
分离的研究成功开始。随着人们对原生质体研究的
不断深入,到 80年代中后期原生质体融合技术应
用到了食用菌的菌株改良或者品种选育上[1]。食用
菌原生质体融合育种与常规的自然选育和人工诱
变、杂交育种相比,具有显著特点,即遗传信息传递
量大,能有效克服生物间性因子的障碍,实现远缘
杂交,可有目的地选择亲株以选育有突出优良性状
的新类型等。
近年来,人们利用原生质体融合技术在食用菌
育种上取得了较大进展,先后获得了食用菌种内、
种间、属间[2~4]、甚至科间原生质体融合子;并且从
科间原生质体融合菌株中选育出优良品种[5],并在
生产上广泛应用。事实证明,原生质体融合技术是
一项行之有效的育种技术。
1 食用菌原生质体融合技术在育种上的特点
食用菌常规的菌种选育可分为自然选育和人
工选育,人工选育又分为诱变育种、杂交育种和原
生质体融合育种。
自然选育是利用自然变异,选取所需的有益变
异。诱变育种是运用物理或化学诱变剂作用于菌株
的 DNA,使其发生遗传性变异而获得优良性状菌
株。较自然选育能提高菌种变异率和扩大变异幅
度,使能有更多的机会从大量变异的细胞中筛选出
具有优良特性的变异菌株。陆师义等[6]通过诱变育
种,筛选获得了可供生产上应用的无孢平菇品种。
杂交育种是通过两个亲本适当的亲本染色体片断
食用菌原生质体融合育种研究进展
任轩 贾乐 杨凤苓 马福荣 李明才
(山东农业大学生命科学学院,泰安 271018)
摘 要: 原生质体融合是微生物遗传育种中的一项重要技术,可以在种间、属间及科间构建出新型菌株,同时也是
菌种改良的重要手段之一,在遗传育种中具有广阔的应用前景。从食用菌原生质体融合技术在育种上的特点,原生质体
制备及影响因素,融合方法,融合子的鉴定以及前景展望等方面进行了综述。
关键词: 原生质体 原生质体融合 育种
ResearchProgressontheProtoplastFusionTechniquein
EdibleMushroom Breeding
RenXuan JiaLe YangFengling MaFurong LiMingcai
(ColegeofLifeScience,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018)
Abstract: Theprotoplastfusiontechniquewithadvantagesofgetingnew varietybetweenspecies,genusand
familyandimprovingthecharactersofvariety,hasthewideapplicationprospectinmicrobialgeneticandbreeding.The
papersummarizesthefeaturesoftheprotoplastfusiontechniqueinediblemushroom breeding,thepreparationof
protoplastanditsinfluencingfactor,themethodsofprotoplastfusion,theselectionoffusantsandtheapplicationof
protoplastfusioninediblemushroombreeding,etc.
Keywords: ProtoplastProtoplastfusion Breeding
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的交换和重组而获得新性状从而选育出具有双亲
优良性状菌株的育种方法,刘都才等[7]通过平菇种
和品种间的单孢杂交获得了高产优质的平菇杂交
异核体。
自然选育虽然选育目的性很强,但是效果是相
对的,有条件的,从本质上将不能改变个体的基因
型,而只是积累并利用其自然条件下发生的有益变
异,既费时又费力。诱变育种尽管具有速度快、收效
大、方法比较简便等优点,但其遗传突变率较大,难
免存在着盲目性。杂交育种虽然具有一定的定向
性,但由于食用菌是有极性的真菌,因不亲合性及
细胞壁的存在使得杂交育种受到一定的限制,进程
缓慢。
原生质体融合是新近发展起来的一种细胞工
程技术,是细胞融合的一个组成部分。它是利用酶
法剥除细胞壁后,在一定物理或化学条件下使不同
遗传性状菌株的原生质体产生融合,使两者基因部
分或全部重组,从而获得重组子。食用菌原生质体
融合具有其独到的优势和特点:由于去除了细胞
壁,原生质膜没有极性,易于融合;相互融合的是整
个胞质与细胞核,保持了遗传物质传递的完整性;
解除了菌株间物理上、生理上的主要屏障,因而使
食用菌远缘杂交、相同交配型的杂交及共生菌根菌
的驯化栽培成为了可能。
2 原生质体制备及影响因素
原生质体的制备是原生质体技术的前提和基
础。人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物
理方法来制备原生质体,效果都不理想。随着酶技
术和生物工程技术的不断发展,酶解法制备原生质
体逐渐取代了早期的物理方法并大规模应用到食
用菌原生质体制备领域中来。到目前为止,适合于
原生质体制备的各种酶类已经得到开发和应用[8]。
由于各种食用菌细胞壁组成的差异,具体使用哪种
酶要根据所研究的食用菌种类而定。
影响原生质体形成的因素很多,其中包括:培
养基成分、菌龄、酶种类、酶浓度、酶解时间、酶解温
度、酶解 pH值、稳渗剂和预处理等。研究表明,在
菌龄的选择上,对数生长期以前的菌丝体细胞壁结
构对降解酶不敏感,对数生长后期的菌丝体原生
质体释放量较高,但菌丝体体内有大量液泡产生,
且原生质膜内皱较多,故释放的原生质体体积较
大[9]。据报道,使用微生物产生的酶复合物或商品
酶的混合液比单独使用一种酶的效果好[10]。陈海昌
等[11]证明,在一定范围内,酶作用的时间、浓度都与
原生质体的形成率成正相关,而与再生率成负相
关。另外,对已培养好的菌体在酶解前用适量硫醇
化合物(如 β-巯基乙醇和二硫苏糖醇)预处理能还
原细胞壁中蛋白质的二硫键,使分子链切开,酶分
子易渗入,从而促进细胞壁的水解及原生质体的释
放[10];EDTA作为螯合剂,可以避免金属离子对酶的
抑制作用而提高霉的脱壁效果,从而提高原生质体
的形成率[12];适量的青霉素对菌体进行预处理,可以
抑制肽聚糖合成过程中的转肽作用,有利于原生质体
的形成[13]。
3 融合方法
原生质体融合有 2种情况:一种为自发融合,
这种现象非常罕见;另一种为诱导融合,即通过人
工诱导方法促使原生质体发生融合,其方法又可分
为生物法、化学法、物理法和混合法。
3.1 生物法
最早发现的一些紫外灭活的病毒膜片能使细
胞间产生凝聚和融合。但由于存在安全性及融合效
率等原因,只适用于动物细胞融合,未在食用菌原
生质体融合中采用。
3.2 化学法
始于 20世纪 70年代,用化学融合剂促进原生
质体融合,目前最常用的是 PEG结合高 Ca2+、pH诱
导法。此法不需要特别的仪器设备,操作简便,但是
原生质体聚集成团的大小不易控制,且 PEG本身
对原生质体具有一定的毒性,影响原生质体的再
生。
3.3 物理法
兴起于 20世纪 80年代前后,用物理的手段
(如电场、激光、超声波、磁声等)使亲本的原生质体
发生融合。最常用的主要有:电处理融合法、激光诱
导融合法以及在电融合技术上改进的方法,如磁-
电融合法、超声-电融合法及电-机械融合法等。这
种方法优点在于电融合条件可控,融合率高,无毒
性、操作简便及融合子成活率高等。但也存在一定
的缺点:设备条件要求高,费用较贵。
任轩等:食用菌原生质体融合育种研究进展 43
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3.4 混合法
起源于物理融合法,包括细胞物理聚集电融合
法、细胞化学聚集电融合法、特异性电融合法等。它
具有融合效率高、专一性强、对原生质体损伤小等
优点,但却存在方法和设备复杂等缺点,目前在食
用菌中还未见报道。
4 融合子的鉴定
原生质体融合子的鉴定是原生质体融合过程
中最关键的一步,也是整个融合过程成功与否的判
定。在融合体中除了重组体外,还有异核体或部分
结合子、杂合二倍体或杂合系,这些都会在再生平
板上形成菌落。为了从融合后的细胞群中选育目的
杂种细胞,必须采用合适的筛选方法[14]进行融合子
的筛选。常见的鉴定方法有以下几种:
4.1 生物学鉴定方法
4.1.1 菌落形态 采用平皿培养法对融合子的再
生菌落与亲本在菌落生长类型、生长速度、无性孢
子以及色素分泌等方面进行对比。
4.1.2 细胞学观察 原生质体融合子的再生菌丝
首先表现在细胞核与亲本不同,特别是萌发初期的
菌丝体核分布非常混乱,这一点与亲本有较大区
别。可采用凹玻片微培养,Giemas结合苏木精染
色,镜检菌丝顶端生长情况及分枝、核相和锁状联
合等方法进行鉴别。
4.1.3 拮抗试验 不同菌种的菌丝在生长中相遇
时表现出拮抗反应不同,异源融合子因异源基因相
混合而获得新的遗传特性。因此,会表现出对亲株
的拮抗作用。
4.1.4 出菇试验 融合子再生出来后,应将全部融
合子进行出菇实验,从子实体的形态、色泽等特征
上进行筛选。融合子属于杂种异核体,它可能会结
实也可能不会。出菇试验不仅实现了进行融合育种
的目的,更是鉴定融合子的最直接证据。
4.2 生化鉴定方法
4.2.1 同功酶电泳图谱分析 酶蛋白是基因表达
的第一产物,而不同菌种的同工酶谱一般不同。因
此,异源融合子的基因重组也应在同工酶上有所反
映。将融合子的同工酶与亲本相比较,可为鉴定融
合子提供有力证据。常见的有酯酶(EST)同功酶、
过氧化物酶(POD)同功酶、SOD同工酶等。
4.2.2 可溶性蛋白凝胶电泳图谱分析 是微生物
化学分类的有效手段,也是检测种间相似程度的一
种可靠方法,可作为原生质体融合子与亲本鉴定比
较的重要依据,并直观比较它们各自蛋白质含量的
变化。
4.3 分子生物学鉴定方法
4.3.1 RFLP(Restriction Fragment Length Poly-
morphism) 即 DNA限制性片段长度多态性,可直
接反映 DNA结构差异,是鉴定融合子稳定又可靠
的方法。将融合子及亲本的总 DNA经限制性内切
酶酶切,凝胶电泳后 Southern杂交。菌株总 DNA酶
切后电泳,显现出特异的带型,能用于鉴别品系、分
析亲缘关系,证实遗传分离。由于融合子是两亲本
细胞质和染色体的集合,用特异性探针分子杂交
时,会显示 DNA的同源性和共显性。
4.3.2 电泳核型技术 通过能够分离 DNA大分子
的脉冲场凝胶电泳技术 (PlusedFieldGelElec-
trophoresis,PEGE),进行核型分离。该技术能分离染
色体,检测染色体长度多型性 (ChromosomeLength
Polymorphism,CLP),可用于融合子分析鉴定,揭示
融合子染色体来源及双亲染色体丢失情况。
4.3.3 基于 PCR技术的分子标记 RAPD(random
amplifiedpolymorphicDNA),即随机扩增多态性
DNA,该技术无需繁琐的步骤,DNA用量少纯度要
求不高,引物具有通用性和广泛性,成本低,广泛用
于遗传作图、基因定位、特殊染色体区段的鉴定和
分离、种属特异性鉴定等方面;ISSR(inter-simple
seuencerepeat),即简单序列间重复扩增,该方法标
记稳定重复性高,无需知道靶标序列的背景信息,
多态性好、快速、高效、灵敏,引物具有通用性,所需
DNA量少(5~l0ng),操作简单,广泛用于基因定位,
克隆和菌株鉴定及遗传图谱构建。
5 展望
原生质体融合技术为食用菌育种提供了有效
的手段,而原生质体的制备及再生是原生质体融合
技术的前提和基础。由于各种因素的差异,导致制
备原生质体的条件也各不相同。酶解时间、温度,酶
解液 pH值、浓度以及环境中的渗透压都对原生质
体的制备有着重要的作用。因此,在原生质体制备
和再生中应综合考虑各种影响因素,寻求最佳的制
(下转第53页)
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备条件。另外,目前已有至少 70种食用菌的原生质
体分离培养被报道,而真正形成较稳定的融合子仅
有侧耳属、香菇属中的少数种类[2]。因而,目前食用
菌原生质体融合育种技术尚处于探索阶段。
国内外的相关研究得到核融合菌株的极少,而
偶然得到的核融合菌株均被淘汰或忽视,但在远缘
杂交中,为避免异核不稳定的现象,促使双亲细胞
核融合是今后的发展方向之一。原生质体融合育种
研究理论上将向融合子菌株形成子实体的遗传机
制、基因调控机理纵深方向探讨;技术上将广泛应
用现代分子生物学技术鉴别融合子;育种将向目
间、纲间等远缘融合方向迈进。原生质体融合技术
已经为遗传操纵、基因育种、基因定位、酶的定位、
细胞壁的合成提供了一种重要工具。随着人们对原
生质体融合技术研究的进一步深入,这项技术必将
成为现代生物学研究的最重要领域之一。
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