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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
植物内生枯草芽孢杆菌纳豆激酶同源基因的
序列分析及其在大肠杆菌中的表达
姜嵛 梁晨 姜国勇
(青岛农业大学植物基因工程研究所，青岛 266109)
摘 要: 利用基因组学和生物信息学的方法，从一种植物内生枯草芽孢杆菌菌株 Bs0922 的基因组 DNA中克隆了纳豆激
酶的同源基因 NK-Bs0922，长度为 1 149 bp。通过重组和转化在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达了一个大小为 48． 0 kD的重组蛋白。
关键词: 内生菌 枯草芽孢杆菌 纳豆激酶 同源基因
Sequence Analysis of Nattokinase Homologous Gene from Endophytic
Bacterial Bacillus subtilis Strain Bs0922 and Expression in E． coli
Jiang Yu Liang Chen Jiang Guoyong
(Institute of Plant Genetic Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109)
Abstract: With genomics and bio-informatics method in this report，a 1 149 bp of nattokinase homologous gene NK-Bs0922 has
been cloned from a strain of B． subtilis Bs0922 which isolated within plant tissue． By means of recombination and transformation，it has
been expressed a recombined protein with 48． 0 kD of molecular weight in E． coli BL21(DE3)．
Key words: Endophytic bacteria Bacillus subtilis Nattokinase Homologous gene
收稿日期:2011-01-22
基金项目:国家自然科学基金项目(30771440) ，国家转基因重大专项课题(2008ZX08009-003)
作者简介:姜嵛，女，实验员，研究方向:病理学;E-mail:tianshiyu0219@ 163． com
通讯作者:姜国勇，男，教授，研究方向:植物分子病理学、基因工程;E-mail:jiangguoyong99@ yahoo． com． cn
许多植物具有多种与之共生的内生菌，如葡萄球
菌(Staphylococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)和固氮菌
(Azospirillum)等。这些有益的微生物能够产生一些
有益的次生代谢物质与寄主植物共生，并起到促进植
物个体生长、抑制病原菌侵染的作用［1］。Reva［2］研究
表明，从油菜、棉花、大麦和拟南芥的植物组织分离的
解淀粉芽孢杆菌(B． amyloliquefaciens)能够促进根系
发育、抑制病原菌的孢子萌发。植物内生菌的次生代
谢产物中不仅存在抗菌活性化合物，也含有一些具有
医疗作用的化学物质。如 1993 年从红豆杉树皮中分
离的内生真菌 Taxomyces andreanae，可以产生紫杉
醇［3］。这表明植物内生菌是有待开发的生物资源库。
Sumi［4，5］在纳豆中发现一种有强纤溶活性的纤
溶酶———纳豆激酶。试验显示，纳豆激酶可以被消
化道吸收，并在体内产生溶栓效果;还可以提高血浆
优球蛋白的纤溶活性，同时能使血浆中的纤溶酶原
激活剂的水平提高［6］。近年来，国内有学者利用基
因工程生产重组纳豆激酶并在原核细胞中获得表
达［7 － 9］。本研究从植物体内分离了一种内生芽孢杆
菌，利用基因组学和生物信息学的方法从分离菌株
Bs0922 的基因组 DNA 中克隆了纳豆激酶的同源基
因，并在大肠杆菌中获得了表达，旨在开发和应用植
物内生菌及其功能蛋白。
1 材料和方法
1． 1 菌株
枯草芽孢杆菌(B． subtilis)菌株 Bs0922，由本实
验室分离和保存。
1． 2 DNA的提取及其同源克隆
枯草芽孢杆菌 DNA 的提取采用 SDS-NaOH 法
提取，引物序列:JP-N41(5-GACGAATTCATGGCCG-
GAAAAAGCAGT-3) ，JP-N42 (5-CGTGGATCCTTAT-
TATTGTGCAGCTGC-3)。PCR扩增程序:95℃ 30 s，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
53℃ 30 s，72℃ 2． 5 min，38个循环;72℃ 延伸10 min。
产物回收后克隆至载体 pUCm-T 中(上海生工)获得
克隆菌株 pUCm-0922。测序后，用 DNAMAN 软件进
行序列比对。
1． 3 cDNA验证
采用 Trizal 法提取上述芽孢杆菌的总 RNA，
DNase I 处理纯化后，用 UNTO-10 柱式 mRNA 抽提
试剂盒(上海生工)获得 mRNA，随后用 MMLV第一
链 cDNA合成试剂盒(上海生工)获得反转录的 cD-
NA，并利用 CA Adaptor 建立 cDNA 文库(TaKaRa) ，
再以引物 JP-N41 和 RA primer引物实施 PCR扩增，
PCR产物回收后克隆，双向测序验证基因产物。
1． 4 重组 pET30a-0922 的表达
克隆菌株 pUCm-0922 经 Sal I /Nco I 双酶切连
接到原核表达载体 pET30a(+)中，获得重组质粒
pET30a-0922，转化大肠杆菌 BL21(DE3) ，在 LB 液
体培养基 30℃过夜培养，加入 IPTG诱导表达，诱导
后的菌体经过破碎、离心，分别取 pET30a(+)和
pET30a-0922 进行 SDS-PAGE电泳。
2 结果与分析
2． 1 枯草芽孢杆菌纳豆激酶基因的同源克隆
以 GenBank 公布的纳豆激酶基因的 DNA 序列
(AY219901、AY895162 和 EF533986)的核苷酸序列设
计多对 PCR 扩增引物实施一对一的 PCR 扩增。其
中，JP-N41、JP-N42的 PCR扩增获得长度大约为1 100 －
1 200 bp的 DNA扩增片段。回收克隆后测序获得一
条长度为 1 149 bp 的基因序列(图 1)。DNAMAN软
件实施序列比较发现，该基因 NK-Bs0922的核苷酸序
列与 AY895162、AY219901 和 EF533986 序列的同源
性为 81%(图 2)。该基因编码蛋白的氨基酸序列与
三者的同源性为 86%。其编码蛋白的 N端前导肽与
已经公布的序列存在明显的差别(图 3)。
1． PCR扩增产物;M． Marker(EcoR I + Hind Ⅲ)
图 1 PCR扩增产物
图 2 Nk-Bs0922 与三种纳豆激酶核苷酸
序列的同源性比较
图 3 Nk-Bs0922 基因编码蛋白的氨基酸序列(显示 N端 1 －200)
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2011 年第 3 期 姜嵛等:植物内生枯草芽孢杆菌纳豆激酶同源基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达
2． 2 重组子 pET30a-0922 克隆的 PCR 扩增及酶切
鉴定
以 LB + Kan 平板上生长的 pET30a-0922 重组
子克隆单菌落为样品，实施克隆 PCR，PCR 产物经
0． 8%琼脂糖凝胶电泳，显示一条单一的、长约 1 149
bp左右的条带，扩增片段与目的片段大小一致。回
收扩增产物用 Pst I 酶切，产生 718 bp 和 431 bp 的
两个片段(图 4)。
1． Pst I酶切产物;2． PCR扩增产物;
M． Marker:λ /EcoRⅠ + Hind Ⅲ
图 4 重组子 pET30a-0922 酶切鉴定
2． 3 重组子 pET30a-0922 在大肠杆菌 BL21 中的
表达
挑取重组质粒 pET30a-0922 的大肠杆菌 BL21
(DE3)菌株单克隆，LB + 50 mg /L Kan 30℃过夜培
养，加入 20 μL IPTG诱导表达 5 h，菌体经过破碎，离
心，分别取 pET30a(+)和 pET30a-0922 进行 SDS-
PAGE电泳。结果显示，电泳得到一条分子量在 48． 0
kD左右的特异表达的带(图 5) ，表明克隆的 NK-
Bs0922基因在大肠杆菌中 BL21(DE3)获得表达。
1． pET-30a(+) ;2． pET30a-0922;M． Marker
图 5 NK-Bs0922 基因在大肠杆菌中获得表达
3 讨论
Nakamura 等［10］报道了纳豆激酶基因序列为
1 143 bp，包括调控顺序在内的长度可达 1 473 bp。
本研究在植物体内生枯草芽孢杆菌中克隆的纳豆激
酶的同源基因的序列为 1 149 bp，其编码蛋白信号肽
与 Nakamura报道的基因序列存在明显的差异，表明
二者具有相同的功能，其蛋白表达的亚细胞定位有所
不同，有待于进一步分析和研究。国内一些学者先后
在大肠杆菌或枯草杆菌中表达了纳豆激酶的基
因［7 － 9］，但是尚未见到利用植物内生菌克隆和表达纳
豆基因的报道，本研究对于开发纳豆激酶的医疗功能
具有积极意义。同样，利用植物体内生芽孢杆菌纳豆
激酶基因的克隆，通过植物体整合和表达这一基因来
合成纳豆激酶也是一种有意义的尝试。
参 考 文 献
［1］张祺玲，杨宇红，谭周进，等．植物内生菌的功能研究进展． 生物
技术通报，2010(7) :28-34．
［2］Reva ON，Dixelius C，Meijer J，et al． Taxonomic characterization and
plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus
amyloliquefaciens and Bacillus subtilis． FEMS Microbiology Ecology，
2004，48(2) :249-259．
［3］马养民，赵洁．植物内生真菌抗菌活性物质的研究进展． 有机化
学，2010，30(2) :220-232．
［4］Sumi H，Hamada H，Tsushime H． A novel fibrinolytic enzyme(nat-
tokinase)in the vegetable cheese natto;a typical and popular soy-
bean food in the Japanese diet． Experientia，1987，43:1110-1111．
［5］Sumi H，Hamada H，Nakanishi K． Enhancement of the fibrinolytic
activity in plasma by oral administ ration of nattokinase． Acta Hea-
matol，1990，84(3) :139-143．
［6］ Fujita M，Ito Y，Hon GK． Characterization of nattokinase degraded
products from human fibrinogen or cross linked fibrin． Fibrinolysis，
1995，9(3) :157-164．
［7］张淑梅，张云湖，赵晓祥．纳豆激酶基因的克隆与表达．中国生物
化学与分子生物学报，1999，15(6) :912-915．
［8］刘兆域，宋后燕． 纳豆激酶的基因克隆及其在枯草杆菌中的表
达．生物化学与生物物理学报，2002，34(3) :338-340．
［9］朱立成，张耀洲．纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备．
浙江大学学报:理学版，2006，33(4) :447-450．
［10］Nakamura T，Yamagata Y，Ichishima E． Nucleotide sequence of the
subtilisn NAT gene，aprN of Bacillus subtilis(natto)． Biosci Bio-
technol Biochem，1992，56(11) :1869-1871．
(责任编辑 马鑫)
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