全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
番茄果实总 RNA提取方法的优化
何健行 陈乐 郭新伦 余有见 杨玲
(浙江师范大学化学与生命科学学院,金华 321004 )
摘 要: 针对番茄等果实的特殊性, 对商品化 T r izo l试剂盒提取总 RNA的方法进行适当的改良: 液氮研磨后加入预处
理液除去果实中大部分糖类等次级代谢物质,裂解时加入 巯基乙醇抑制酚类等物质的氧化, 从富含多糖、多酚的番茄、枣果
肉中成功提取总 RNA。与其它方法相比, 该改良方法具有操作步骤简单、快速等优点。利用 RTPCR技术, 从所提取 RNA中
成功克隆出 胡萝卜素脱氢酶基因片段,进一步表明其质量可以完全满足分子生物学研究的要求。
关键词: 果实 RNA提取 改良 T rizo l法
An ImprovedMethod for Extracting RNA from Tomato Fruit
H e Jianx ing Chen Le Guo X inlun Yu You jian Yang L ing
(College of Chem istry and L ife Sciences, Zhejiang N ormal University, J inhua 321004)
Abstrac:t Extraction o f high qua lity RNA from fruit flesh is particu lar ly difficult due to large am ount of po lysacchar ides, po lyphe
nol and other seconda ry me tabo lites. A sim ple procedure fo rRNA isolation from tom ato and Ch inese date fru its w as designed. The com
m ercia lT r izo l k it protoco w as im proved by using pretreatment so lution afte r g rinding in liquid N 2 to rem ove most of secondary m etabo
lites, and add ing m ercaptoethanol into the extraction so lution to preven t po lypheno lic com pounds from ox id izing. Compared w ith other
m ethods, the procedure w as sim ple and rapid. RTPCR ana ly sis o f zetaca ro tene desa turase gene also dem onstrated that the iso lated
RNA samp les we re in h igh qua lity.
Key words: F ruit RNA extrac tion Improved T r izol m ethod
收稿日期: 20100118
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30700519) ,浙江省浙江科技计划项目 ( 2008C24006) , 浙江省新苗人才计划项目 ( 2008R40G2030029)
作者简介:何健行,男,本科生,专业:生物科学; Ema i:l 06260134@ zjnu. net
通讯作者:杨玲,女,教授,博士生导师,从事植物生理与分子生物学研究; Em ai:l yang@l z jnu. cn
番茄等果实具有较高的营养价值,不仅提供人
们需要的多种营养成分,而且还有一定的药用价值,
可预防和治疗多种疾病 [ 1, 2]。例如, 果实中的番茄
红素是很强的抗氧化剂,除了延缓衰老、预防心脑血
管疾病外,还可抑制肿瘤细胞生长 [ 3]。
快速高效提取高质量的 RNA是进行基因克隆
和表达分析等研究的基础。提取 RNA的方法很
多 [ 1, 4- 6] ,但应用这些方法提取富含多糖等次生代谢
物质的果实组织中的 RNA时,通常步骤繁琐, 提取
的 RNA易降解或不纯 [ 5] , 加上受果实种类和成熟期
的影响,很难建立一种适合多种果实总 RNA提取的
方法。
目前最常用的 RNA提取试剂盒是 T rizo ,l已成
功应用于糖含量较高的柿果、桃以及柑橘果皮
等 [ 6, 7] , 但没有检索到用于番茄、枣等果实的报道。
这可能是由于番茄、枣果肉中含有过多的其他次生
代谢物质,这些物质在 RNA提取过程中不但不易除
去,且在去除过程中,易导致 RNA的降解,影响提取
质量 [ 7, 8]。为解决这一问题, 在总结前人研究工作
的基础上, 对不同的 RNA提取方法进行比较, 尝试
对 T rizo l试剂盒操作程序进行优化和改良。
1 材料和方法
1. 1 材料
成熟的番茄 ( Ly cop ersicon esculentum M il.l cv.
M oneym aker)果实采集于浙江师范大学生物技术基
地, 枣 (Z izyphus jujuba M ill)购于超市。Trizo l、EDTA
为 B iosharp公司产品, 巯基乙醇购自 S igma公司,
氯仿、异丙醇、乙醇均是国产分析纯试剂。
2010年第 8期 何健行等:番茄果实总 RNA提取方法的优化
12 总 RNA的提取
新鲜果肉 1 g置于液氮预冷的研钵中, 在液氮
中迅速研磨成均匀的粉末; 将约 02 g粉末移入含
1 mL处理液 ( 025 mo l/L N aC l、02 mo l/L TrisHC l
pH8. 0、005mo l/L EDTA pH8. 0、1% 巯基乙醇 )
的 15mL离心管中, 涡旋混匀, 冰浴静置 20 m in;
4 下 7 000 r /m in离心 5m in,弃上清, 用 1mL Trizol
试剂 (含 1%的 巯基乙醇 )重新溶解沉淀, 4 下
10 630 r /m in离心 10 m in; 转移上清液到 15 mL离
心管中,加入 02 mL氯仿,上下颠倒充分混匀,室温
静置 3m in, 4 下 10 630 r /m in离心 15m in;将上相
转移至 15mL离心管中, 加入 05mL氯仿,上下颠
倒充分混匀,室温静置 3m in, 4 下 10 630 r /m in离
心 15 m in; 将上相转移到 15 mL离心管中, 加入
05mL异丙醇, 1 /10体积 3 mol /L N aA c( pH5. 2) ,
混匀, 室温静置 10 m in, 4 下 10 630 r /m in离心
20 m in;弃去溶液,沉淀倒置控干,加 1 mL 70%乙醇
重新悬浮, 4 下 8 350 r/m in离心 5 m in, 弃去溶液;
70%乙醇重复洗涤 1次, 沉淀倒置控干, 加 1 mL无
水乙醇悬浮, 于 4 下 8 350 r /m in离心 5 m in。用
20- 50 L TE溶解;取 2 L电泳检测。
13 cDNA的合成
使用 C lon tech公司生产的 SMARTTM cDNA li
brary construct ion k it合成双链 cDNA,具体操作按产
品说明指导书进行。用 1% 琼脂糖凝胶电泳检查
PCR扩增产物。
14 37 保温试验
取 15 L已提取的 RNA于 37 温浴 30m in,取
2 L电泳检测。
15 RTPCR引物设计和扩增体系
根据 GenBank登录的番茄 胡萝卜素脱氢酶
( Zetacarotene desaturase, ZDS)基因序列 (AF195507)
设计引物, 即上游引物 5!CTACGCTACAATGGCT
GGGT3!和下游引物 5!GAAAGAGTTGCTCCTTCCAT
3!。 PCR 反 应 体 系: cDNA 模 板 1 L, 引 物
( 10mmo l/L )各 1 L, 10 ∀ PCR Buffer 2. 5 L, dNTP 2
L, DM SO 05 L, Taq酶 015 L,加灭菌超纯水至
25 L,混匀离心后扩增。
扩增条件: 94预变性 5m in; 94 变性 30 s; 47
复性 30 s; 72 延伸 30 s, 32个循环; 然后 72 延伸
5m in。PCR产物用 1%琼脂糖凝胶电泳分离, 采用
Ugene公司 H. Q. &. Q凝胶回收试剂盒回收后, 连
接到 pMD18T载体上,转化感受态大肠杆菌 DH5!,
阳性克隆送至上海生工公司测序。
2 结果
2. 1 RNA的提取
从番茄、枣果肉中提取的总 RNA经 1%琼脂糖
凝胶电泳分析结果如图 1,可以看到 3条清晰的条
带, 即 28S rRNA、18S rRNA及 5S rRNA, 并且 28S
rRNA亮度约是 18S rRNA的 2倍, 表明提取的 RNA
结构完整,未发生明显降解。以此 RNA作为模板合
成的双链 cDNA大于 2 000 bp(图 2) , 进一步说明
RNA的完整性较好。以鲜重计, 番茄果实 RNA的
产率为 44. 8 g /g,枣果肉 RNA的产率为 54. 3 g /
g,表明所提取的总 RNA样品产量较高。
1.番茄; 2.枣
图 1 番茄和枣果实总 RNA电泳图
图 2 番茄果实双链 cDNA扩增结果
2. 2 37 保温试验
番茄果实 RNA的 37 保温试验结果见图 3, 保
温前后比较, 条带亮度基本一致, RNA未有明显的
分解。说明所提的 RNA没有受到 RNase污染。
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1.保温前总 RNA; 2. 37 保温 30 m in后 RNA; 3. M arker
图 3 番茄果肉总 RNA在 37 下保温试验
2. 3 克隆 ZDS基因片段
RTPCR扩增结果如图 4所示,用改良的 Trizol
法从番茄果肉中提取的总 RNA为模板,扩增出与预
期长度 453 bp相符合的 cDNA片段,测序结果证实是
ZDS基因 ( GenBank登录号: AF195507)片段。同时,
以番茄果肉基因组 DNA作模板扩增出多条带,以逆
转录时不加 RNA或不加逆转录酶所得到产物作模板
没有扩增到条带,这进一步说明该法提取的番茄果肉
总 RNA质量较高, 没有基因组 DNA或其他污染, 完
全可以满足于从事相关分子生物学研究的需要。
1.以基因组 DNA为模板; 2. 以总 RNA为模板; 3.未加
逆转录酶; 4.未加 RNA模板
图 4 RTPCR克隆 ZDS基因结果
3 讨论
与其他组织相比, 番茄、枣等果肉中富含多糖、
多酚类物质等次级代谢物质,多糖与 RNA的性质十
分相似 [ 9] ,严重影响 RNA的提取,并会影响逆转录、
基因扩增,载体构建等下游操作。尽管热硼酸盐法、
CTAB法等也能提取到果实总 RNA [ 1 ] , 但与本方法
相比, 用时较长、步骤较繁琐,不仅增加了提取过程
中 RNA发生降解的风险, 而且在构建 cDNA文库或
其他需要大量 RNA的研究中明显不足。对 T rizo l
试剂盒的操作程序进行优化, 在裂解前用预处理液
除去其中大部分多糖等次级代谢物质, 并在 T rizo l
试剂中加入 1%的 巯基乙醇,防止后续提取过程
中酚类物质被氧化而影响提取质量。
本方法也被尝试应用于苹果 (Malus domestica
L. Borkh)和秋橄榄 (E laeagnus umbellata Thunb. )果
实, 但未能提取高质量的总 RNA, 这可能于苹果富
含酚类化合物 [ 10 ]、秋橄榄果实中含有大量的萜类化
合物 [ 1] , RNA的浓度相对较低有关。本研究结果表
明, 本方法提取的番茄、枣果肉总 RNA, 不但产量
高, 纯度好,完全能满足分子生物学研究的后续试验
要求,并可在 3 h内完成整个提取过程, 具有快速、
简便的特点,可为其他果实 RNA的提取提供参考。
参 考 文 献
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